李 菁，趙瑞陽，唐 露，張俊杰，古麗帕日·艾克拜

( 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052 )

果蠅Dsx基因和線蟲Mab-3基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子A1(Dmrta1)基因是Dmrt家族的亞族Dmrta中的一員。Dmrt是目前關(guān)注度較高的性別相關(guān)基因家族之一，該家族成員廣泛參與到動物的性別決定與兩性分化中。Dmrt家族基因是目前已知保守的性別分化相關(guān)基因，最初是在果蠅的性別調(diào)控基因Doublesex中發(fā)現(xiàn)了DM結(jié)構(gòu)域[1]。在魚類、鳥類、哺乳類、爬行類均發(fā)現(xiàn)其存在，表明該基因在動物的進(jìn)化過程中具有高度的保守性[2-5]。

目前，在動物中已克隆出Dmrt家族成員基因約有10個[6]。Dmrta基因家族成員包括Dmrta1(Dmrt4), Dmrta2 (Dmrt5), Dmrta3(Dmrt3)[7]。在小家鼠(Musmusculus)中，Dmrt4基因在性腺、肝臟、腎等組織中均有表達(dá)[8]。Dmrt4基因在半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)精巢中的表達(dá)量顯著高于卵巢[9]。江東能等[10]研究表明，Dmrt4基因在金錢魚(Scatophagusargus)精巢和卵巢及鰓中均有較高表達(dá)。鑒于Dmrta1基因廣泛參與了魚類的性別形成與分化，有必要研究其參與調(diào)控的分子機制。在脊椎動物的進(jìn)化過程中，魚類作為低等動物有著舉足輕重的進(jìn)化地位。對Dmrta1基因的研究有助于了解從低等的無脊椎動物到高等生物進(jìn)化過程的性別決定機制。

白斑狗魚(Esoxlucius)，屬鮭形目、狗魚屬，分布于世界各大水域[11]。在我國主要分布于新疆額爾齊斯河流域[12]。白斑狗魚作為自然水域中的主要捕食者，攝食范圍廣，能適應(yīng)溫度范圍變化大的生活環(huán)境，生長迅速，營養(yǎng)價值高，是新疆地區(qū)額爾齊斯河流域重要的水產(chǎn)品之一。近年來對白斑狗魚的研究主要是對其生長性能、胚胎發(fā)育及外源性激素誘導(dǎo)性別發(fā)育等[13-15]。目前白斑狗魚的性別分化機制尚未闡明，關(guān)于Dmrta1基因在其性腺發(fā)育過程中的研究未見報道。筆者通過RT-PCR方法克隆得到白斑狗魚的Dmrta1基因，通過實時熒光定量PCR方法對白斑狗魚Dmrta1基因在生長發(fā)育不同階段的組織中表達(dá)情況進(jìn)行分析，從而探討其在性別形成與分化中的作用，為白斑狗魚性別決定機制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用魚為本實驗室人工繁殖的白斑狗魚仔魚，繁殖所用親魚購于烏魯木齊北園春市場的烏倫古湖野生白斑狗魚，飼養(yǎng)于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)實驗室，取180日齡和320日齡的白斑狗魚，雌雄各3尾，共12尾。將魚體解剖，分別取出腦、肌肉、腎臟、性腺、頭腎、鰓、腸等組織，將其迅速置于液氮里，于超低溫冰箱中-80 ℃保存。

1.2 試驗試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScritTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(寶生物工程大連有限公司)、Trizol試劑(Invitrogen公司)、熒光定量PCR檢測試劑盒(TIANGEN生化科技有限公司)、PCR試劑盒TaKaRa TaqTM(寶生物工程大連有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計

根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的白斑狗魚轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果序列(NC_047592.1)，根據(jù)已報道鮭科魚類的Dmrta1保守區(qū)域設(shè)計引物Dmrta1-F-Primer及Dmrta1-R-Primer，用于白斑狗魚Dmrta1基因擴增。根據(jù)克隆得到的Dmrta1基因序列設(shè)計熒光定量PCR特異性引物Dmrta1-GSP-F和Dmrta1-GSP-R；采用實驗室之前設(shè)計的白斑狗魚的肌動蛋白(β-actin)基因引物Actin1F和Actin1R，上述引物均采用Primer 5.0設(shè)計，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 白斑狗魚Dmrta1基因克隆及熒光定量PCR引物

1.3.2 總RNA的提取和cDNA的制備

將180日齡、320日齡兩個時期的性腺(精巢、卵巢)、腦、肌肉、腎臟、頭腎、鰓、腸道、肝臟等8種不同的組織分別在加入液氮的研缽中充分研磨，用Trizol法對RNA進(jìn)行提取，全程在冰上操作，用DEPC處理過的雙蒸水溶解上述得到的白色沉淀，將RNA放置于冰箱-80 ℃保存。用紫外光分光光度計檢測RNA的光密度值；用瓊脂糖凝膠電泳檢測各組織的總RNA的完整性。以500 ng的RNA為初始模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄步驟按照TaKaRa試劑盒說明書進(jìn)行，cDNA于冰箱-20 ℃保存，用于后續(xù)熒光定量PCR使用。

1.3.3 Dmrta1基因的克隆

以白斑狗魚精巢的cDNA為起始模板，加入2.5 mmol/L dNTP Mixture，4 μL；10×PCR buffer，5 μL；Dmrta1-F/R-Primer各2 μL；TaKaRa TaqTM(5 U/μL)，0.5 μL；cDNA，3 μL；雙蒸水補齊至50 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃終止程序。PCR反應(yīng)結(jié)束后，在1%的瓊脂糖凝膠電泳中以D2000 DNA Marker作為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測，并置于紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果，產(chǎn)物回收送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.3.4 Dmrta1基因的生物信息學(xué)分析

采用DNAMAN軟件將測序所得cDNA序列進(jìn)行拼接，運用BLAST查詢該物種在數(shù)據(jù)庫中同其他物種的Dmrta1基因序列同源性相似程度；使用生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)平臺上的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)工具分析白斑狗魚Dmrta1基因序列的開放閱讀框，進(jìn)一步推導(dǎo)出該基因的氨基酸序列；使用CD Search程序搜索該基因的蛋白功能結(jié)構(gòu)域；采用SMART分析蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域；運用ExPASy和Swiss-model分析Dmrta1蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)；采用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列多重對比；最后使用Clustal X和MEGA 5.1軟件基于鄰接法對其構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 白斑狗魚Dmrta1基因的表達(dá)分析

采用相對定量的方法對白斑狗魚Dmrta1基因在2個時期不同組織的表達(dá)量進(jìn)行測定。以各個組織的總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為起始模板，選擇內(nèi)參β-actin基因、目標(biāo)基因Dmrta1，分別對所選不同組織進(jìn)行實時熒光定量PCR，每個樣品重復(fù)測定3次。實驗室采用BIO-RAD CFX 96定量PCR儀，SYBR Green I熒光染料。以20 μL為反應(yīng)體系，其中2×SuperReal PreMix Plus(TianGen)10 μL，正反向引物各0.6 μL，cDNA模板為1 μL，最后補齊無RNA酶單蒸水7.8 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，39個循環(huán)；95 ℃ 30 s。根據(jù)Dmrta1基因和β-actin基因，在各組織中擴增得到的Ct值，通過2-ΔCt法計算白斑狗魚各組織中Dmrta1基因的相對表達(dá)量。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。采用SPSS 21.0進(jìn)行單因素方差分析，并使用LSD方法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié) 果

2.1 白斑狗魚Dmrta1基因的克隆和序列分析

將cDNA模板與特異性引物進(jìn)行PCR擴增，最終產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，分子大小約1500 bp，長度符合目的基因序列。對測序片段進(jìn)行拼接，獲得Dmrta1基因的cDNA序列，長度為1408 bp。通過與美國國立生物技術(shù)信息中心上已知的白斑狗魚轉(zhuǎn)錄組測序基因序列比對，相似性達(dá)99.7%。運用美國國立生物技術(shù)信息中心上ORF Finder對白斑狗魚Dmrta1基因的開放閱讀框進(jìn)行查詢，得出1條序列長度為1302 bp的開放閱讀框，編碼433個氨基酸(圖2)。對開放閱讀框進(jìn)行生物信息學(xué)分析，得到Dmrta1蛋白的分子質(zhì)量為36.047 ku，理論等電點為5.94。運用SMART對該基因的結(jié)構(gòu)功能域進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，Dmrta1基因具有2個保守結(jié)構(gòu)域，分別為DM和DMA結(jié)構(gòu)域。說明該基因符合Dmrt基因家族成員特征，在進(jìn)化過程中具有高度的保守性。該DM結(jié)構(gòu)域共編碼47個氨基酸，將推導(dǎo)出的氨基酸序列與其他物種的DM結(jié)構(gòu)域進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)其與6種哺乳動物的DM結(jié)構(gòu)域完全一致(圖3)，而與其他3種動物僅有1個位點不同。運用Swiss-model預(yù)測白斑狗魚與黑猩猩(Pantroglodytes，XP_528576.1)Dmrta1基因的DM結(jié)構(gòu)域氨基酸的三維結(jié)構(gòu)模型圖(圖4)，對比發(fā)現(xiàn)，這1個氨基酸位點的差異并未影響DM結(jié)構(gòu)域的改變，表明Dmrta1基因的DM結(jié)構(gòu)域在不同物種的進(jìn)化上具有高度的保守性。

圖1 白斑狗魚Dmrta1基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 The PCR amplification result of Dmrta1 gene in northern pike E. lucius1.白斑狗魚擴增結(jié)果； M.DNA marker.1.the amplification result of E. lucius; M.DNA marker.

圖2 白斑狗魚Dmtra1基因的cDNA序列和推測的氨基酸序列Fig.2 cDNA sequence and the deduced amino acid sequence of Dmtra1 gene in northern pike E. luciusATG為翻譯起始子，*為翻譯結(jié)束終止子.ATG indicates translation initiation codon ，* indicates translation termination codon.

圖3 Dmrta1基因DM結(jié)構(gòu)域的序列多重比對Fig.3 Multiple sequence alignment of DM domain of Dmrta1 gene

圖4 白斑狗魚(a)和黑猩猩(b)Dmrta1基因的DM結(jié)構(gòu)域氨基酸序列模擬三維結(jié)構(gòu)Fig.4 Three dimensional structure comparison of DM domain in Dmrta1 gene from northern pike E. lucius (a) and chimpanzee P. troglodytes (b)

2.2 Dmrta1基因同源比較和進(jìn)化分析

通過BLAST對白斑狗魚的Dmrta1蛋白進(jìn)行氨基酸同源性分析發(fā)現(xiàn)，該氨基酸序列與美國國立生物技術(shù)信息中心上已公布的其他物種的Dmrta1氨基酸序列具有較高的相似性，結(jié)果顯示，氨基酸序列與銀大麻哈魚(XP_020326315.1)同源性為80.32%；與紅大麻哈魚(XP_029510939.1)同源性為80.09%；與虹鱒(XP_021433981.1)、大西洋鮭(Salmosalar，XP_014061928.1)的同源性分別為79.41%，79.64%，與黃金鱸(Percaflavescens，XP_028419844.1)同源性為63.95%。通過MEGA 5.1 軟件用鄰接建樹法對16個物種的Dmrta1氨基酸構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)，發(fā)現(xiàn)白斑狗魚與虹鱒、紅大麻哈魚的親緣關(guān)系最近，屬于同一分支。將該基因編碼的氨基酸序列與其他9個物種的氨基酸序列進(jìn)行比對(圖6)，根據(jù)比對結(jié)果推測其保守特征序列。

圖6 白斑狗魚與其他物種Dmrta1基因的氨基酸序列比對分析Fig.6 Multiple sequence alignment analysis of amino acid sequences of Dmrta1 gene in northern pike E. lucius and other species為Dmrta1保守序列位置.Black box is the conserved sequence position of Dmrta1.

2.3 Dmrta1基因的定量表達(dá)分析及其在不同時期的表達(dá)差異

通過檢測2對引物的擴增效率基本一致，運用2-ΔCt法計算Dmrta1基因的相對表達(dá)量。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，白斑狗魚Dmrta1基因在不同日齡期的不同組織中的表達(dá)具有差異，Dmrtal基因只在白斑狗魚的鰓、性腺、肌肉中表達(dá)，在腸道和肝臟、腦、腎臟、頭腎中各齡期幾乎不表達(dá)(圖7～8)。

圖7 實時熒光定量PCR檢測的Dmrta1基因在白斑狗魚180日齡期不同組織的相對表達(dá)量Fig.7 Relative expression levels of Dmrta1 gene detected in different tissues in 180 days old northern pike E. lucius by real-time PCR *為差異顯著(P<0.05)； **為差異極顯著(P<0.01)；下同.* indicates significant difference at P<0.05 level； ** indicates very significant difference at P<0.01 level； et sequentia.

圖8 實時熒光定量PCR檢測的Dmrta1基因在白斑狗魚320日齡期不同組織的相對表達(dá)量Fig.8 Relative expression levels of Dmrta1 gene detected in different tissues in 320 days old nothern pike E. lucius by real-time PCR

180日齡期，Dmrta1基因在精巢、鰓中有較高表達(dá)(圖7)。精巢的表達(dá)量顯著高于肌肉(P<0.05)，其他組織之間表達(dá)量不存在顯著性差異(P>0.05)。在180日齡的雌魚卵巢幾乎不表達(dá)；對比同一時期的雌雄性腺表達(dá)量可知，Dmrta1基因在精巢中的表達(dá)量顯著高于卵巢(P<0.05)。

在320日齡期，Dmrta1基因在精巢中的表達(dá)依然顯著高于卵巢(P<0.05)(圖8)，并且在320日齡期卵巢中開始出現(xiàn)微量的表達(dá)。對比兩個時期精巢的表達(dá)量可知，在320日齡期精巢的表達(dá)量是180日齡期的2倍，Dmrta1基因在精巢中的表達(dá)呈明顯增長趨勢。

3 討 論

3.1 白斑狗魚Dmrta1基因結(jié)構(gòu)預(yù)測及進(jìn)化位的關(guān)系

Dmrta1基因是Dmrt基因家族中的一員，Dmrt家族成員共同特征是都含有一個鋅指DM結(jié)構(gòu)域[3]，作為性別決定機制中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子可以與特異的DNA序列結(jié)合。通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測，本試驗中的Dmrta1基因同樣存在著一個鋅指結(jié)構(gòu)的保守結(jié)構(gòu)域，推測其可以與DNA進(jìn)行特異結(jié)合，從而在性別的分化及發(fā)育過程中起到調(diào)節(jié)作用。在本試驗中，白斑狗魚Dmrta1基因與其他6種哺乳動物的DM結(jié)構(gòu)域一致，說明在進(jìn)化過程中該結(jié)構(gòu)域高度保守。在人類中，Dmrt基因位于人常染色體區(qū)域的9P24.3[4]，它的表達(dá)模式與性別決定基因SRY相似，參與了雄性的性別決定過程，僅在雄性性腺中表達(dá)。而魚類的原始生殖腺具有雙向發(fā)展?jié)摿?，分為雌雄異體型和雌雄同體型[16]。因此研究魚類的性別控制機制更加復(fù)雜。

通過氨基酸同源性的比對可知，白斑狗魚Dmrta1基因同目前已報道的眾多物種Dmrta1氨基酸序列具有75%以上的同源性，表明Dmrta1基因在不同物種中是高度保守的。通過選擇處于動物分類系統(tǒng)中不同進(jìn)化位的各類動物Dmrta1基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)白斑狗魚與同屬鮭科的魚類聚為一個分支，遺傳距離最近，與兩棲綱、爬行綱、哺乳綱的分支遺傳距離較遠(yuǎn)。從分子進(jìn)化關(guān)系上看該基因符合傳統(tǒng)的物種進(jìn)化理論。

3.2 Dmrta1基因的表達(dá)模式分析

通過實時熒光定量PCR技術(shù)獲得了白斑狗魚Dmrta1基因在不同時期不同組織的相對表達(dá)量，結(jié)果表明，Dmrta1基因在精巢中表達(dá)，在卵巢中幾乎無表達(dá)。Dmrta1基因在白斑狗魚精巢的不同時期表達(dá)量有所差異，隨著日齡期的增加，表達(dá)量呈上升趨勢。表明Dmrta1(Dmrt4)基因?qū)Π装吖肤~的精巢生長發(fā)育可能具有維持作用。有研究表明，在小鼠的各個組織中，Dmrt1基因只在睪丸中表達(dá)，其他組織中不表達(dá)，說明該基因?qū)π坌跃驳姆只鹬匾饔肹3]；黑斑蛙(Rananigromaculata)[17]Dmrt4基因在雌、雄成體中的各組織表達(dá)無明顯差異；周麗青等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)性別決定機制中，pyDmrt4基因與雄性的性別形成有關(guān)；吳啟迪等[19]對菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)Dmrt4-like-2基因的研究發(fā)現(xiàn)，通過雌二醇處理，該基因在精巢中的表達(dá)量顯著上調(diào)，說明其與性別分化、性腺發(fā)育形成有關(guān)。白斑狗魚Dmrta1(Dmrt4)基因在精巢中的表達(dá)量顯著高于卵巢，這與紅鰭東方鲀[20]、青鳉(Oryziaslatipes)[21]Dmrt4基因在精巢中表達(dá)量高于卵巢，Dmrt4基因在精巢中較高表達(dá)，在卵巢中較低表達(dá)情況相一致。在本試驗中，Dmrta1基因在雌、雄白斑狗魚的鰓中均有較高表達(dá)，并且表達(dá)量隨時間的延長而呈現(xiàn)上升趨勢，這與Wen等[22]的研究結(jié)果——Dmrta1基因在褐牙鲆(P.olivaceus)的精巢中表達(dá)量顯著高于雌性卵巢，并且在鰓中表達(dá)也顯著高于其他組織相符合。這說明Dmrta1基因可能與性別的形成和分化有關(guān)，并且在一定程度上對鰓弓的形成和發(fā)育過程起重要作用。

4 結(jié) 論

本試驗通過克隆得到白斑狗魚Dmrta1基因，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，該基因具有典型的DM、DMA保守結(jié)構(gòu)域。運用實時熒光定量PCR對Dmrta1基因在雌、雄各組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，得到Dmrta1基因在精巢及卵巢中的表達(dá)量存在顯著差異，并且在雌、雄的鰓中均有表達(dá)；可以推斷，該基因在維持精巢的發(fā)育及鰓弓的形成中具有重要的支持作用，而有關(guān)Dmrta1基因在白斑狗魚精巢中的作用機理，則有待今后進(jìn)一步研究。