何 花，董大立

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是我國40歲以上成年人最重要的致殘、致畸原因之一[1]。KOA在中醫(yī)學(xué)中屬“痹證”“骨痹”等范疇。痹者，三氣雜至，壅閉經(jīng)絡(luò)，氣血凝滯而血行不暢，故血瘀病機(jī)是KOA的致病關(guān)鍵[2]?；谥兴幘哂斜孀C施治和多靶點(diǎn)治療的特色，活血化瘀通絡(luò)藥物更有助于改善KOA患者的臨床癥狀和延緩疾病進(jìn)展。本研究擬通過建立KOA大鼠模型并分離軟骨細(xì)胞培養(yǎng)，觀察“磷酸化核因子B抑制蛋白激酶（phospho-inhibitor of NF-κB kinase，IKK）/核因子B抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）/核因子B（nuclear factor kappa B，NF-B）”信號通路相關(guān)因子的變化，并給予丹紫康膝沖劑干預(yù)，以闡述該中成藥對KOA大鼠滑膜組織IKK/IκB/NF-κB信號通路、炎癥因子及血瘀狀態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康8周齡SPF級SD雄性大鼠70只，體質(zhì)量200～220 g，購自湖南省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2016-0002。飼養(yǎng)溫度22～25℃，濕度45%～65%，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水，飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級，所有實(shí)驗(yàn)均按湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)和國際動(dòng)物福利標(biāo)準(zhǔn)的指導(dǎo)方針進(jìn)行[3]，倫理批號：2020-KY-021。

1.2 藥品與試劑 丹紫康膝沖劑由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科提供，方藥組成：紫河車，丹參，熟地黃，懷牛膝，補(bǔ)骨脂，巴戟天，桑寄生，土鱉蟲，血竭，獨(dú)活，乳香，白芍，6 g/包，使用時(shí)溶于蒸餾水，根據(jù)需要配置成相應(yīng)溶度懸混液；雙氯芬酸鈉腸溶片（廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號：20150404）；吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽（PDTC，核因子κB抑制劑）（美國Sigma公司，批號：1434953V）；兔抗鼠NF-κB抗體（北京奧森生物有限公司，批號：bs-1704R）；細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒（北京中杉金橋生物科技有限公司，批號：20160409）；一氧化氮（nitric oxide，NO）ELISA檢測試劑盒（批號：20170301）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）ELISA檢測試劑盒（批號：20170715）、低氧誘導(dǎo)因子-1a（hypoxia inducible factor-1a，HIF-1a）ELISA檢測試劑盒（批號：20180507）均購自上海賽默生物科技發(fā)展有限公司；anti-ColⅡ-IgG、IgG1和IgG2a ELISA試劑盒（北京中杉金橋生物科技有限公司，批號：20170209）；血栓素B2（thromboxane B2，TXB2）ELISA試劑盒（批號：201907）、6-酮-前列腺素F1α（6-keto-PGF1α）ELISA試劑盒（批號：201908）均購自上海西唐公司；白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β ELISA試劑盒（批號：ELK1372）、IL-18 ELISA試劑盒（批號：ELK13170）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號：ELK1458）均購自上海Elabscience公司；NF-κB p65抗體（批號：20170824A）、磷酸化NF-κB p65（phospho-NF-κB p65，p-NF-κB p65）抗體（批號：20180611A）、NF-κB抑制蛋白α（inhibitor of NF-κB α，IκBα）抗體（批號：20180509A）、磷酸化IκBα（phospho-IκBα，p-IκBα）抗體（批號：20190414A）、磷酸化IκB激酶α（phosphoinhibitor of NF-κB kinase α，p-IKKα）抗體（批號：20190920A）、磷酸化IκB激酶β（phospho-inhibitor of NF-κB kinase β，p-IKKβ）抗體（批號：20191123A）、Nod樣受體蛋白3（Nod-like receptor pyrin domain 3，NLRP3）抗體（批號：20180321A）均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 主要儀器Varioskan LUX型多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Mini-PROTEAN Tetra Cell型小型垂直蛋白電泳儀（美國Bio-Rad公司）；脫水機(jī)、包埋機(jī)、組織攤片機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；TGL-18R型臺(tái)式冷凍離心機(jī)（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）；病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；載玻片及蓋玻片（江蘇世態(tài)實(shí)驗(yàn)器材有限公司）。

1.4 造模與分組 將70只雄性SD大鼠飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組，模型組，雙氯芬酸鈉組，PDTC組及丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組，每組10只。假手術(shù)組大鼠僅模擬手術(shù)過程，其余6組大鼠建立KOA模型。根據(jù)Hulth法[4]建立膝骨關(guān)節(jié)炎模型：腹腔注射10%水合氯醛將大鼠麻醉，固定在手術(shù)操作臺(tái)上，沿右側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)入路，充分暴露關(guān)節(jié)腔，切斷前交叉韌帶，經(jīng)“前抽屜試驗(yàn)”驗(yàn)證呈陽性，則建模成功。縫合傷口。術(shù)畢，正常飼養(yǎng)，在傷口處涂抹抗生素，以防傷口感染。假手術(shù)組大鼠手術(shù)過程同模型組，但是不切斷前交叉韌帶。（見圖1）

圖1 假手術(shù)組和造模組大鼠交叉韌帶處理情況

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 丹紫康膝沖劑成人劑量為0.3 g/kg，按成人（60 kg）與動(dòng)物體表面積換算公式計(jì)算3組大鼠給藥劑量，根據(jù)低、中、高劑量組用藥量比例（1∶2∶4），丹紫康膝沖劑低劑量組大鼠每日劑量為0.15 g/kg（約相當(dāng)于成人臨床日用量按體表面積折算的等效劑量），丹紫康膝沖劑中、高劑量組大鼠以每日0.3、0.6 g/kg的劑量進(jìn)行灌胃；雙氯芬酸鈉組大鼠以每日5 mg/kg的劑量給予雙氯芬酸鈉灌胃；PDTC組以每日100 mg/kg的劑量進(jìn)行灌胃；而假手術(shù)組、模型組分別給予1 mL/kg生理鹽水灌胃。1次/d，連續(xù)灌胃28 d。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 HE組織染色[5]實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，頸椎脫臼處死大鼠，取膝關(guān)節(jié)軟骨組織，常規(guī)石蠟包埋，3 μm厚度做組織切片。經(jīng)蘇木素染核和伊紅復(fù)染，中性樹脂封片后觀察。

1.6.2 番紅-O-固綠組織染色[6]石蠟包埋組織切片方法同上。新鮮配置的Weigert染液染色，在固綠染色液內(nèi)浸染，加入番紅O染色，中性樹脂封固后觀察。

1.6.3 免疫組化法檢測軟骨組織NF-κB蛋白表達(dá)[7]收集膝關(guān)節(jié)軟骨組織，常規(guī)石蠟包埋組織切片。按照試劑盒說明書進(jìn)行免疫組化染色操作，將兔抗鼠NF-κB抗體按1∶50稀釋，觀察胞核和胞漿中陽性染色情況。

1.6.4 蛋白免疫印記法檢測軟骨組織胞核蛋白和胞漿蛋白NF-κB蛋白表達(dá)[8]收集新鮮的膝關(guān)節(jié)軟骨組織，迅速放入預(yù)冷的研缽中搗碎，分別提取胞核蛋白和胞漿蛋白，取20 μg蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，將NF-κB p65抗體和p-NF-κB p65抗體按1∶50稀釋，分別孵育過夜，ECL曝光后，對蛋白條帶進(jìn)行掃描。

1.6.5 蛋白免疫印記法檢測軟骨組織總蛋白IκBα、p-IκBα、IKKα、p-IKKα、IKKβ、p-IKKβ、NLRP3蛋白表達(dá)[9]收集新鮮的膝關(guān)節(jié)軟骨組織，提取組織總蛋白，迅速放入預(yù)冷的研缽中搗碎，分別提取胞核蛋白和胞漿蛋白，取20 μg蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，加入IκBα抗體（1∶100稀釋）、p-IκBα抗體（1∶250稀釋）、p-IKKα抗體（1∶50稀釋）、p-IKKβ抗體（1∶300稀釋）、NLRP3抗體（1∶50稀釋），分別孵育過夜，TBST洗膜，ECL顯色，使用凝膠成像儀拍照，以被檢蛋白與GAPDH的吸光度比值作為其相對表達(dá)水平。

1.6.6 ELISA檢測血清炎癥因子[10]末次給藥后禁食24 h，摘眼球取血，離心分離血清，采用ELISA檢測試劑盒測定外周血炎癥因子（IL-1β、IL-18、TNF-α、HIF-1a、NO、PGE2）、抗-膠原抗體（anti-ColⅡ-IgG、anti-ColⅡ-IgG1和anti-ColⅡ-IgG2a）水平。

1.6.7 ELISA檢測血漿TXB2和6-keto-PGF1α水平[11]末次給藥后禁食24 h，摘眼球取血，用肝素鈉抗凝，離心機(jī)沉淀，留取血漿，采用ELISA檢測試劑盒測定血漿TXB2和6-keto-PGF1α水平，并計(jì)算比值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料均以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析和重復(fù)測量的方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 丹紫康膝沖劑對KOA大鼠軟骨組織損傷的影響 經(jīng)HE染色，假手術(shù)組大鼠膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)面光滑，軟骨滑膜組織完整，細(xì)胞排列整齊；模型組大鼠軟骨組織可見大量炎癥細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，而且深部軟骨細(xì)胞可見明顯細(xì)胞核壓縮，胞質(zhì)肥大，潮線消失，細(xì)胞排列不規(guī)則；與模型組比較，雙氯芬酸鈉組，PDTC組和丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組大鼠軟骨細(xì)胞排列均勻，胞核和胞質(zhì)逐漸恢復(fù)正常。（見圖2）

圖2 各組大鼠軟骨組織HE染色結(jié)果 （×100）

經(jīng)番紅-O-固綠染色，假手術(shù)組大鼠軟骨組織染色均勻，結(jié)構(gòu)清晰；模型組大鼠骨關(guān)節(jié)面不平，軟骨鈣化，膠原纖維增生，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)經(jīng)番紅O染色變淺，染色不均一，而且軟骨陷窩結(jié)構(gòu)擴(kuò)張；與模型組比較，雙氯芬酸鈉組，PDTC組和丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組大鼠軟骨組織番紅O稍淡染，潮線逐漸清晰，細(xì)胞排列逐漸均勻，尤其是丹紫康膝沖劑高劑量組大鼠軟骨組織改善明顯。（見圖3）

圖3 各組大鼠軟骨組織番紅-O-固綠染色結(jié)果 （×100）

2.2 丹紫康膝沖劑對KOA大鼠軟骨組織NF-κB蛋白核轉(zhuǎn)位的影響 經(jīng)免疫組化分析，假手術(shù)組大鼠軟骨組織中NF-κB蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，胞核中的表達(dá)量相對較少；模型組和雙氯芬酸鈉組大鼠軟骨組織中NF-κB蛋白主要濃集于胞核區(qū)；而PDTC組和丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組大鼠軟骨組織中NF-κB蛋白發(fā)生核轉(zhuǎn)移的數(shù)量明顯減少，主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，尤其是丹紫康膝沖劑高劑量組和PDTC組大鼠軟骨組織中NF-κB蛋白核轉(zhuǎn)移的數(shù)量明顯少于丹紫康膝沖劑低、中劑量組。（見圖4）

圖4 各組大鼠軟骨組織NF-κB蛋白在軟骨細(xì)胞中的定位情況 （免疫組化，×100）

2.3 丹紫康膝沖劑對KOA大鼠軟骨組織NF-κB蛋白核表達(dá)的影響定量分析 與假手術(shù)組比較，模型組、雙氯芬酸鈉組、丹紫康膝沖劑低劑量組、丹紫康膝沖劑中劑量組、丹紫康膝沖劑高劑量組和PDTC組大鼠軟骨組織胞核和胞漿中NF-κB蛋白表達(dá)量均明顯升高（P<0.05）。與模型組比較，丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組和PDTC組大鼠軟骨組織胞核和胞漿中NF-κB蛋白表達(dá)量均明顯降低（P<0.05或P<0.01），尤其是丹紫康膝沖劑高劑量組和PDTC組大鼠軟骨組織NF-κB蛋白變化更明顯（P<0.01）。與雙氯芬酸鈉組比較，丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組大鼠軟骨組織胞漿中NF-κB蛋白表達(dá)量和丹紫康膝沖劑高劑量組大鼠軟骨組織胞核中NF-κB蛋白表達(dá)量均明顯降低（P<0.05）。與PDTC組比較，丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組大鼠軟骨組織胞核中NF-κB蛋白表達(dá)量均明顯升高（P<0.05）。（見表1、圖5）

圖5 Western blotting法檢測胞核和胞漿中NF-κB蛋白的表達(dá)情況

表1 各組大鼠軟骨組織中NF-κB蛋白表達(dá)情況比較

表1 各組大鼠軟骨組織中NF-κB蛋白表達(dá)情況比較

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01；與雙氯芬酸鈉組比較，dP<0.05；與PDTC組比較，eP<0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 給藥劑量 胞漿NF-κB/GAPDH 胞核NF-κB/LaminB1假手術(shù)組 10 -模型組 10 -雙氯芬酸鈉組 10 5 mg/kg丹紫康膝沖劑低劑量組 10 0.15 g/kg丹紫康膝沖劑中劑量組 10 0.3 g/kg丹紫康膝沖劑高劑量組 10 0.6 g/kg PDTC組 10 100 mg/kg 0.02±0.01 0.39±0.05a 0.31±0.04a 0.10±0.03abd 0.12±0.05abd 0.08±0.01abcd 0.09±0.01abc 0.74±0.07 1.87±0.20a 1.65±0.17ab 1.76±0.18ae 1.62±0.15abe 1.19±0.12abcde 0.88±0.13abc

2.4 丹紫康膝沖劑對KOA大鼠軟骨組織總蛋白p-IκBα、IκKα、p-IKKα、IKKα、p-IKKβ、IKKβ、NLRP3蛋白表達(dá)的影響與假手術(shù)組比較，模型組，雙氯芬酸鈉組和丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組大鼠軟骨組織p-IκBα、p-IKKα、p-IKKβ、NLRP3蛋白相對表達(dá)量均明顯升高（P<0.05）。與模型組比較，雙氯芬酸鈉組，丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組和PDTC組大鼠軟骨組織p-IκBα、p-IKKα、p-IKKβ、NLRP3蛋白相對表達(dá)量均明顯降低（P<0.05）。與雙氯芬酸鈉組比較，丹紫康膝沖劑中劑量組大鼠軟骨組織p-IκBα、p-IKKβ和丹紫康膝沖劑高劑量組大鼠軟骨組織p-IκBα、p-IKKα、p-IKKβ蛋白相對表達(dá)量均明顯降低（P<0.05）；與PDTC組比較，丹紫康膝沖劑中、高劑量組大鼠軟骨組織p-IκBα、p-IKKα、p-IKKβ、NLRP3蛋白相對表達(dá)量均明顯升高（P<0.05），丹紫康膝沖劑低劑量組大鼠軟骨組織p-IκBα、p-IKKα、p-IKKβ蛋白相對表達(dá)量均明顯升高（P<0.05）。6組大鼠軟骨組織IκBα、IKKα、IKKβ蛋白相對表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見表2、圖6）

表2 各組大鼠軟骨組織中p-IκBα、IκBα、p-IKKα、IKKα、p-IKKβ、IKKβNLRP3蛋白表達(dá)比較

表2 各組大鼠軟骨組織中p-IκBα、IκBα、p-IKKα、IKKα、p-IKKβ、IKKβNLRP3蛋白表達(dá)比較

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與雙氯芬酸鈉組比較，cP<0.05；與PDTC組比較，dP<0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 給藥劑量 p-IκBα IκBα p-IKKα IKKα p-IKKβ IKKβ NLRP3假手術(shù)組 10 -模型組 10 -雙氯芬酸鈉組 10 5 mg/kg丹紫康膝沖劑低劑量組 10 0.15 g/kg丹紫康膝沖劑中劑量組 10 0.3 g/kg丹紫康膝沖劑高劑量組 10 0.6 g/kg PDTC組 10 100 mg/kg 0.03±0.01 0.47±0.02a 0.30±0.02ab 0.33±0.03abd 0.20±0.04abcd 0.18±0.03abcd 0.15±0.02ab 1.23±0.08 1.18±0.15 1.25±0.16 1.21±0.20 1.26±0.18 1.23±0.24 1.22±0.19 0.31±0.03 0.79±0.06a 0.50±0.05ab 0.57±0.04abd 0.50±0.03abd 0.42±0.02abcd 0.28±0.03b 2.31±0.16 2.24±0.29 2.38±0.30 2.40±0.27 2.37±0.28 2.39±0.40 2.44±0.42 0.11±0.02 0.48±0.09a 0.30±0.03ab 0.27±0.04abd 0.22±0.03abcd 0.20±0.02abcd 0.10±0.01b 1.45±0.11 1.39±0.14 1.48±0.22 1.40±0.15 1.43±0.12 1.42±0.10 1.45±0.13 0.54±0.08 0.87±0.08a 0.59±0.05ab 0.85±0.05ad 0.80±0.03abd 0.64±0.05ab 0.72±0.07abc

圖6 Western blotting法檢測軟骨組織中IκBα、p-IκBα、IKKα、p-IKKα、IKKβ、p-IKKβ、NLRP3蛋白表達(dá)情況

2.5 丹紫康膝沖劑對KOA大鼠炎癥狀態(tài)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組，雙氯芬酸鈉組，PDTC組和丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組大鼠外周血IL-1β、IL-18、TNF-α、HIF-1a、NO、PGE2、anti-ColⅡ-IgG、anti-ColⅡ-IgG2a水平均明顯升高（P<0.05）。與模型組比較，雙氯芬酸鈉組，PDTC組和丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組大鼠外周血IL-1β、IL-18、TNF-α、HIF-1a、NO、PGE2、anti-ColⅡ-IgG2a水平均明顯降低（P<0.05）。與雙氯芬酸鈉組比較，丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組大鼠外周血IL-1β、IL-18、TNF-α、HIF-1a、NO、PGE2、anti-ColⅡ-IgG2a水平均明顯升高（P<0.05）；與PDTC組比較，丹紫康膝沖劑高劑量組大鼠外周血IL-1β、TNF-α、HIF-1a、NO、PGE2、anti-ColⅡ-IgG水平均明顯降低（P<0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠外周血清細(xì)胞因子水平比較

表3 各組大鼠外周血清細(xì)胞因子水平比較

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與雙氯芬酸鈉組比較，cP<0.05；與PDTC組比較，dP<0.05

動(dòng)物數(shù) IL-1β IL-18 TNF-α Anti-ColⅡ(OD) HIF-1a NO PGE2（只） (pg/mL) (pg/mL) (pg/mL) IgG IgG1 IgG2a (ng/L) (μmol/L) (ng/L)假手術(shù)組 10 -模型組 10 -雙氯芬酸鈉組 10 5 mg/kg丹紫康膝沖劑低劑量組10 0.15 g/kg丹紫康膝沖劑中劑量組10 0.3 g/kg丹紫康膝沖劑高劑量組10 0.6 g/kg PDTC組 10 100 mg/kg組別 給藥劑量6.57±3.10 27.41±7.65a 10.36±3.48ab 25.33±3.21acd 21.05±3.79abcd 16.59±3.21abcd 19.70±4.25abc 1.33±0.24 6.77±1.49a 2.19±0.43ab 6.18±0.59abcd 6.02±0.47abcd 4.76±0.55abc 3.49±0.56abc 0.78±0.27 2.61±0.45a 0.96±0.34ab 2.51±0.48acd 2.26±0.29abcd 1.72±0.35abcd 2.04±0.62abc 1.31±0.03 1.90±0.07a 1.48±0.05ab 1.87±0.06a 1.85±0.10a 1.57±0.05abcd 1.82±0.04ab 0.78±0.03 0.75±0.02 0.76±0.01 0.74±0.02 0.77±0.05 0.74±0.02 0.77±0.03 0.53±0.02 1.20±0.04a 0.72±0.03ab 1.14±0.03abc 1.02±0.02abc 0.97±0.04abc 1.04±0.03abc 2189.47±697.32 4916.56±1374.25a 2954.83±729.46ab 4470.53±931.74acd 4055.12±799.21abc 3412.47±668.59abcd 4032.58±1285.97abc 17.40±2.81 35.40±4.16a 21.45±3.13ab 32.20±2.89abcd 31.77±3.65abcd 24.82±3.46abcd 27.33±4.27abc 105.69±18.72 187.67±24.75a 129.32±23.29ab 160.64±19.55abcd 151.30±25.38abcd 133.26±17.64abcd 180.94±19.62bc

2.6 丹紫康膝沖劑對KOA大鼠血瘀狀態(tài)相關(guān)因子的影響 與假手術(shù)組比較，模型組，雙氯芬酸鈉組，PDTC組和丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組大鼠血漿TXB2含量明顯升高，6-keto-PGF1a含量明顯降低，TXB2/6-keto-PGF1a比值明顯升高（P<0.05）。與模型組比較，雙氯芬酸鈉組，PDTC組和丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組大鼠血漿TXB2含量明顯降低，6-keto-PGF1a含量明顯升高，TXB2/6-keto-PGF1a比值明顯降低（P<0.05）。與雙氯芬酸鈉組比較，丹紫康膝沖劑低、中劑量組大鼠血漿TXB2含量明顯升高，TXB2/6-keto-PGF1a比值明顯升高（P<0.05）。與PDTC組比較，丹紫康膝沖劑低劑量組大鼠血漿TXB2含量明顯升高，6-keto-PGF1a含量明顯降低，TXB2/6-keto-PGF1a比值明顯升高（P<0.05）；丹紫康膝沖劑高劑量組大鼠血漿TXB2含量明顯降低，TXB2/6-keto-PGF1a比值明顯降低（P<0.05）。（見表4）

表4 各組大鼠外周血漿TXB2和6-keto-PGF1a水平比較

表4 各組大鼠外周血漿TXB2和6-keto-PGF1a水平比較

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與雙氯芬酸鈉組比較，cP<0.05；與PDTC組比較，dP<0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 給藥劑量 TXB2（ng/L） 6-keto-PGF1a（pg/mL） TXB2/6-keto-PGF1a假手術(shù)組 10 -模型組 10 -雙氯芬酸鈉組 10 5 mg/kg丹紫康膝沖劑低劑量組 10 0.15 g/kg丹紫康膝沖劑中劑量組 10 0.3 g/kg丹紫康膝沖劑高劑量組 10 0.6 g/kg PDTC組 10 100 mg/kg 176.44±34.10 279.61±37.65a 206.35±35.48ab 264.11±25.73abcd 236.29±28.64abcd 203.59±40.21abd 248.70±41.35abc 61.33±0.97 53.72±1.49a 55.19±1.03ab 55.16±1.18ab 55.25±0.92ab 55.89±1.17ab 56.49±3.56ab 2.88±0.19 5.20±0.67a 3.55±0.32ab 4.92±0.81abcd 4.26±0.86abc 3.46±0.38abd 4.40±0.54abc

3 討 論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病與肝腎虧虛，風(fēng)、寒、濕及瘀血客于局部有關(guān)，因局部氣滯血瘀，經(jīng)脈痹阻不通而發(fā)病[12]。膝骨關(guān)節(jié)炎屬“痹證”范疇，腎虛、血瘀是“痹證”的主要病因，其病機(jī)腎虛為本，血瘀為標(biāo)，因此中醫(yī)在治療痹證上，根據(jù)辨證，合理運(yùn)用活血化瘀、祛風(fēng)除濕、補(bǔ)益肝腎等藥物[13]。丹紫康膝沖劑是我院治療OA的經(jīng)驗(yàn)方，具有補(bǔ)肝益腎、活血通絡(luò)、柔肝止痛之功效[14]。經(jīng)多年臨床研究證實(shí)，該方配伍精當(dāng)，正中病機(jī)。此外，該方劑中丹參、土鱉蟲、血竭可活血化瘀，但是對于改善患者血瘀狀態(tài)的研究甚少，為臨床推廣帶來了一定的局限性。

在本研究中，我們建立KOA大鼠模型后，經(jīng)軟骨組織病理觀察證實(shí)，丹紫康膝沖劑可以顯著改善大鼠軟骨組織的損傷狀態(tài)，而且其療效與非甾體類抗炎藥物雙氯芬酸鈉基本一致。從作用機(jī)制分析，該方劑對于IKK/IκB/NF-κB信號通路具有一定的抑制作用。NF-κB是參與機(jī)體炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡等過程的重要轉(zhuǎn)錄因子，可在胞質(zhì)中與NF-κB抑制蛋白（如IκBα）結(jié)合，形成無活性聚合體；而IKK是促進(jìn)胞質(zhì)IκBα蛋白磷酸化的重要上游激酶，可導(dǎo)致NF-κB蛋白發(fā)生核轉(zhuǎn)位，增強(qiáng)某些靶基因的轉(zhuǎn)錄。IKK/IκB/NF-κB信號通路激活后可誘導(dǎo)大量細(xì)胞因子如IL-1β、IL-18、TNF-α等大量分泌，造成軟骨損傷。此外，NLRP3炎癥小體在IKK/IκB/NF-κB信號通路激活過程中發(fā)揮著協(xié)同作用。在本研究中，丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組大鼠軟骨組織中p-IκBα、p-IKKα、p-IKKβ、NLRP3蛋白表達(dá)量均明顯低于模型組，且NF-κB核轉(zhuǎn)位減弱，尤其是丹紫康膝沖劑高劑量組改善最明顯，說明丹紫康膝沖劑對于IKK/IκB/NF-κB信號通路具有一定的抑制作用。此外，談冰等[15]證實(shí)NF-κB信號通路激活是OA患者凝血異常的原因之一。一方面NF-κB的激活可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，另一方面可通過促進(jìn)促炎因子的分泌，進(jìn)一步放大血小板聚集、活化。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組大鼠血漿TXB2/6-keto-PGF1a比值均低于模型組，且逐漸恢復(fù)至假手術(shù)組大鼠狀態(tài)。

綜上所述，丹紫康膝沖劑不僅可抑制KOA大鼠的炎癥反應(yīng)，減輕軟骨組織病理損傷，同時(shí)也可有效改善大鼠的血瘀狀態(tài)，其作用機(jī)制之一與抑制IKK/IκB/NF-κB信號通路的活化有關(guān)。在本研究中，我們通過Hulth法建立的大鼠模型證實(shí)了丹紫康膝沖劑對骨關(guān)節(jié)炎的治療作用部分依賴于對IKK/IκB/NF-κB信號通路的抑制，但不能完全闡明丹紫康膝沖劑治療膝骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。在后續(xù)的研究中，我們將構(gòu)建更多的動(dòng)物模型，并從體外細(xì)胞層面和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)兩方面進(jìn)一步證實(shí)丹紫康膝沖劑的藥理作用，并綜合分析其作用機(jī)制，為丹紫康膝沖劑的臨床應(yīng)用提供更可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。