高家榮，郭明飛，單 莉，魏良兵

[1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實(shí)驗(yàn)室)，安徽合肥 230012 ；2. 安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院]

T2DM是引起高血壓、高血糖、胰島素抵抗等一系列代謝綜合征的常見病理基礎(chǔ)[1-2]。肝臟是生物代謝的主要器官，對物質(zhì)的合成、分泌、代謝和排泄起著至關(guān)重要的作用[3]。胰島素抵抗(insulin resistance,IR)作為2型糖尿病發(fā)病中的核心病理生理機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)，胰島素抵抗是胰島素作用的靶器官(主要是肝臟、骨骼肌和脂肪組織等)對胰島素作用的敏感性降低而致血糖含量升高的病理狀態(tài)[4]。當(dāng)肝部分胰島素抵抗時(shí)，容易導(dǎo)致肝糖原合成受阻，糖代謝功能紊亂[5-6]。因此，增強(qiáng)胰島素敏感性、降低血糖水平和改善胰島素抵抗是治療T2DM的關(guān)鍵。黃地安消膠囊為安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院治療糖尿病的特色醫(yī)院制劑，臨床應(yīng)用多年，療效確切[7-8]，但其對改善胰島素抵抗的分子機(jī)制尚不明確。本文以高糖高胰島素為誘導(dǎo)條件，探究黃地安消膠囊改善HepG2細(xì)胞胰島素抵抗的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)藥物 黃地安消膠囊處方由麥冬，枇杷葉，三七，葛根等六味中藥組成，按組方比例稱取適量藥材，第一次加入十倍量的水加熱回流提取1.5 h，第二次加8倍量的水加熱回流提取1 h，合并兩次濾液，靜止24 h后，過濾，濾液濃縮干燥，制成干浸膏樣品，動(dòng)物灌胃給藥時(shí)備用。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200.0±10.0)g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(皖)2011-002。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均飼養(yǎng)于安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房，每籠5只，光照和黑暗各12 h交替循環(huán)。

1.3試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(FBS，Hyclone公司)，二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)，四甲基噻唑藍(lán)(MTT，Solarbio公司)，0.25 %胰蛋白酶(Amresco公司)，Trizol試劑(上海生工生物技術(shù)公司)，甲醇(上海國藥化學(xué)試劑有限公司)

1.4儀器 MCO-15AC CO2恒溫培養(yǎng)箱(SANYO公司)；潔凈工作臺(tái)(蘇凈安泰)；Neofuge 15R離心機(jī)(Heal Force公司);Theymo Forma 381型CO2培養(yǎng)箱(美國);Nikon Eclipse C1熒光顯微鏡(日本)；Nikon DS-U3成像系統(tǒng)(日本)；BioTek 酶標(biāo)儀(德國)

1.5方法

1.5.1含藥血清制備 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對照組和黃地安消膠囊組，每組各10只。黃地安消膠囊組按照10 g/kg劑量灌胃給藥，2次/d。對照組給予等量溶媒。給藥周期為3 d，第3 d一次給予全天劑量后1 h，按照2 mL/kg劑量腹腔注射給予水合氯醛進(jìn)行麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血。靜止2 h后，4 000 r/min離心15 min，分離血清，放置于56 ℃水浴鍋中滅菌30 min，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，分裝，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱備用。

1.5.2細(xì)胞培養(yǎng)和胰島素抵抗模型建立 將HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在含10 %滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5 %CO2的培養(yǎng)箱中，取對數(shù)期的細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞長至80 %～90 %融合后用于實(shí)驗(yàn)。在空白孔中加入無血清DMEM培養(yǎng)液，其余各孔中加入30 mmol/L濃度的高糖溶液，之后在100 mg/L胰島素中孵育24 h。

1.5.3MTT法測定HepG2的抑制作用 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用0.25 %胰蛋白酶消化后，用含有10 %胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞混懸，稀釋至8 ×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，200 μL/孔。細(xì)胞貼壁生長后棄培養(yǎng)液，分別加入5 %、10 %、15 %、20 %、25 %、30 %的含藥血清和10 %胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，調(diào)零孔中不加細(xì)胞，只加入200 μl完整培養(yǎng)液。常規(guī)培養(yǎng)24 h、48 h后，每孔加入濃度為5 g/L的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸取孔中廢液，加入DMSO 150 μL/孔，低速振蕩10 min，酶標(biāo)儀490 nm波長測定每個(gè)孔的吸光度A。細(xì)胞生長抑制率=(1-A給藥組/A對照組)×100 %。

1.5.4免疫熒光分析 含藥血清處理HepG2細(xì)胞24 h，然后將細(xì)胞固定在的4 %多聚甲醛/PBS中15 min，浸泡在0.5 %Triton X-100/PBS中20 min，用PBS洗滌3次，用3 %胎牛血清白蛋白(BSA)在PBS中封閉30 min，滴加一抗IRS-1(1∶150)、PI3K(1∶200)、p-Akt(1∶200)、p-GSK-3β(1∶100)，4 ℃孵育過夜后將細(xì)胞在PBS中洗滌，然后滴加二抗(1∶500)在37℃下孵育1 h，用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。

1.5.5HepG2細(xì)胞IRS-1、PI3K、Akt、GSK-3β mRNA的表達(dá) 采用Trizol試劑提取HepG2細(xì)胞總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。各引物序列見表1。擴(kuò)增條件：95 ℃處理10 min，(95 ℃，變性60 s，60 ℃退火延伸30 s)×40個(gè)循環(huán)。采用相對定量法分析，結(jié)果以2-ΔΔCT表示。

1.5.6HepG2細(xì)胞p-IRS-1、PI3K、p-Akt、p-GSK-3β蛋白的表達(dá) HepG2細(xì)胞在PIPA緩沖液中溶解，細(xì)胞裂解液后10 000 r/min離心10 min，收集上清液并煮沸5 min，然后用SDS-PAGE分離蛋白，凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，封閉后滴加一抗p-IRS-1(1∶500)、PI3K(1∶1 000)、p-AKT(1∶5 000)、p-GSK-3β(1∶5 000)和β-actin(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜，滴加二抗(1∶1 000)在室溫下孵育1 h，使用HRP-ECL發(fā)光法進(jìn)行鑒定，并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1含藥血清對HepG2細(xì)胞增殖的影響 隨著血清濃度的增加，抑制率(IR)也升高。細(xì)胞代謝和增殖與血清濃度和培養(yǎng)時(shí)間呈正相關(guān)。當(dāng)血清濃度超過10 %時(shí)，細(xì)胞代謝受到明顯抑制，出現(xiàn)細(xì)胞死亡。比較培養(yǎng)時(shí)間、血清濃度和細(xì)胞代謝活性的影響，最終將10 %含藥血清和培養(yǎng)48 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。見表2。

表2 含藥血清對OD和IR的影響

2.2黃地安消膠囊對HepG2細(xì)胞IRS-1表達(dá)的影響 免疫熒光結(jié)果分析表明，p-IRS-1主要在細(xì)胞膜上表達(dá)，正常細(xì)胞中目標(biāo)蛋白表達(dá)明顯(圖1A，B)。與正常組(Control)相比，模型組(Model)IRS-1 mRNA和p-IRS-1蛋白表達(dá)降低；與模型組相比，含藥血清組(HDAXC)IRS-1 mRNA和p-IRS-1蛋白表達(dá)升高(P<0.05，圖1C，1D，1E)。

圖1 含藥血清對HepG2細(xì)胞IRS-1表達(dá)的影響

2.3黃地安消膠囊對HepG2細(xì)胞PI3K表達(dá)的影響 免疫熒光染色結(jié)果表明，與正常組相比，模型組PI3K蛋白表達(dá)降低(圖2A，2B)；與模型組比較，含藥血清組PI3K mRNA和蛋白表達(dá)均具有增加趨勢，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2C，2D，2E)。

圖2 黃地安消膠囊對HepG2細(xì)胞PI3K表達(dá)的影響

2.4黃地安消膠囊對HepG2細(xì)胞Akt表達(dá)的影響 免疫熒光分析顯示，p-Akt表達(dá)主要在細(xì)胞膜上，在模型組中表達(dá)含量較低(圖3A，3B)。與正常組相比，模型組Akt mRNA和p-Akt蛋白表達(dá)降低，與模型組相比，含藥血清組Akt mRNA和p-Akt蛋白表達(dá)升高(P<0.05，圖3C，3D，3E)。

2.5黃地安消膠囊對HepG2細(xì)胞GSK-3β表達(dá)的影響 免疫熒光結(jié)果表明p-GSK-3β主要在模型組表達(dá)較高(圖4A，4B)。與正常組相比，模型組GSK-3β mRNA表達(dá)的水平增加，與模型組相比，含藥血清組GSK-3β mRNA表達(dá)水平降低；與正常組相比，模型組p-GSK-3β蛋白表達(dá)增加，與模型組相比，含藥血清組p-GSK-3β蛋白表達(dá)降低(P<0.05，圖3C，3D，3E)。

圖4 黃地安消膠囊對HepG2細(xì)胞GSK-3β表達(dá)的影響

3 討論

肝臟是葡萄糖輸出和糖原合成的主要部位，肝臟胰島素抵抗易引起高胰島素血癥、糖原合成障礙、脂肪肝以及T2DM等癥狀產(chǎn)生[9-10]。因此，改善肝臟胰島素抵抗已成為治療T2DM等代謝綜合征的關(guān)鍵途徑[11]。

正常生理?xiàng)l件下，胰島素經(jīng)分泌入血后，與肝細(xì)胞膜上的特定受體結(jié)合，沿著IRS-1/PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，起著調(diào)節(jié)血糖穩(wěn)態(tài)的作用[12]。在這一傳遞過程中，胰島素首先與肝細(xì)胞膜上胰島素受體α亞單位結(jié)合，通過激活內(nèi)源性酪氨酸激酶產(chǎn)生磷酸化效應(yīng)從而激活β亞單位的活性。胰島素受體的激活會(huì)對IRS-1和PI3K的酪氨酸殘基位點(diǎn)磷酸化進(jìn)行催化[13-14]。在胰島素抵抗大鼠的肝臟組織中，IRS-1蛋白表達(dá)降低，引起肝糖原合成減少，糖異生作用增加，葡萄糖含量升高[15]。通過對C57BL/ksJ-db/db小鼠建立胰島素抵抗模型發(fā)現(xiàn)，經(jīng)藥物治療后，給藥組小鼠IRS-1、PI3K和Akt的表達(dá)明顯增加，同時(shí)肝臟葡萄糖攝取和糖原合成亦具有增加趨勢[16]。PI3K/Akt作為胰島素傳遞的下游靶點(diǎn)在這一過程中起著至關(guān)重要的作用。肝臟中PI3K和Akt蛋白表達(dá)水平的上調(diào)和PI3K/Akt通路的激活可抑制下游GSK-3β磷酸化的表達(dá)，降低GSK-3β活性和表達(dá)降低，從而促進(jìn)GSK-3β蛋白底物GS去磷酸化和過表達(dá)[17-18]。GSK-3β受PI3K和AKT的調(diào)控，激活的PI3K/Akt可以降低GSK-3β的表達(dá)，當(dāng)PI3K/Akt蛋白的表達(dá)降低時(shí)，這種現(xiàn)象可以逆轉(zhuǎn)。抑制GSK-3β去磷酸化可增加肝臟中GS的活化和糖原合成[19]。在HepG2細(xì)胞模型組中，我們觀察到IRS-1、PI3K、Akt的表達(dá)降低，GSK-3β的表達(dá)增加。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果均與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，表明黃地安消膠囊能夠增強(qiáng)HepG2細(xì)胞的胰島素信號(hào)通路活性，增加葡萄糖攝取，降低血糖水平，緩解糖尿病癥狀。

綜上所述，黃地安消膠囊能夠通過調(diào)控IRS-1/PI3K/Akt/GSK-3β介導(dǎo)的胰島素信號(hào)通路的激活，提高胰島素信號(hào)的傳導(dǎo)，促進(jìn)糖原合成，降低血糖。其結(jié)果表明黃地安消膠囊對胰島素信號(hào)通路的傳遞具有促進(jìn)作用，其機(jī)制可能與其調(diào)控IRS-1/PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路蛋白活性有關(guān)。