于明寨，楊春葆，巴桑玉珍

（省部共建青稞和牦牛種質(zhì)資源與遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)科研究所 西藏 拉薩 850032）

青稞占西藏農(nóng)作物播種面積的一半以上，是西藏最主要的糧食作物。在青藏高原上，青稞的種植約有3500年的歷史，具有廣泛的藥用以及營養(yǎng)價值，是西藏四寶之首糌粑的主要原料［1］。因此提高青稞品質(zhì)產(chǎn)量對西藏農(nóng)牧民增產(chǎn)增收具有重要意義［2］。

干旱是威脅世界作物栽培和生產(chǎn)的嚴(yán)重問題之一，是導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)的最嚴(yán)重制約因素，所造成減產(chǎn)超過其他非生物脅迫的總和。近年來，隨著全球變暖的影響，降雨不規(guī)律以及用水不當(dāng)都會導(dǎo)致全球農(nóng)作物生產(chǎn)面臨越來越嚴(yán)峻的干旱威脅，嚴(yán)重制約全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展［3］。因此，從西藏農(nóng)業(yè)發(fā)展以及西藏糧食安全來說，研究青稞對干旱脅迫的響應(yīng)及機(jī)制都有非常重要的意義。

本研究以前序研究得到的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與全基因組甲基化數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)［4］，挖掘其中差異表達(dá)的基因，并通過BLASTP 進(jìn)行比對，對候選目的基因進(jìn)行注釋，選擇水稻為受體材料，探究干旱脅迫對其生理、生化指標(biāo)表達(dá)水平的影響［5］，以期明確HVUL1H24632.2基因序列的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)儀器

試驗(yàn)儀器主要有：NanoDrop?One/OneC 超微量紫外分光光度計，冷凍離心機(jī)，凝膠電泳儀，PCR儀，恒溫水浴鍋，搖床酶標(biāo)儀（450 nm），高精度微量加樣器及槍頭（0.5～10 uL，2～20 uL，20～200 uL，200～1000 uL），37 ℃恒溫箱等。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

試驗(yàn)試劑包括：總RNA 提取試劑盒，Taq plus DNA 聚合酶，水飽和酚，cDNA 合成的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，DNA Marker DL 2000，SYBR?Premix Ex TaqTM、植物（Plant）過氧化物酶（POD）-微量測試Kit，植物（Plant）超氧化物歧化酶（SOD）-微量測試Kit，植物（Plant）脯氨酸（proline）-微量測試Kit等。

1.1.3 試驗(yàn)材料

青稞種子、水稻種子；載體：pBWA（V）BSCCDB。

1.2 方 法

1.2.1 目的基因篩選

通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與全基因組甲基化數(shù)據(jù)，挖掘其中差異表達(dá)基因，并通過BLASTP 進(jìn)行比對，對候選目的基因進(jìn)行注釋。

1.2.2 RNA提取及cDNA合成

以RNAprep Pure 植物總RNA 提取試劑盒方法的方法來提取總RNA（表1）［6］。然后以Roche 公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA（表2）［7］。

表1 總RNA提取

表2 反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA

1.2.3 目的基因的擴(kuò)增

按照表3、表4 中的體系和程序?qū)DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增完的PCR 產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測［8］。然后用QIAquick?Gel Extraction Kit試劑盒對目的條帶進(jìn)行切膠回收純化［9］。

表3 PCR反應(yīng)體系（20 μL）

表4 PCR的反應(yīng)程序

1.2.4 表達(dá)載體構(gòu)建

用Eco31I 酶切載體pBWA（V）BS-CCDB，擴(kuò)增的片段用Eco31I 進(jìn)行酶切，回收后連接（表5）。將連接好的重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5a 感受態(tài)細(xì)胞中［10］，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR 驗(yàn)證（表6）［11］，最后將驗(yàn)證結(jié)果陽性的菌液送去測序。將測序正確的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。

表5 連接反應(yīng)（10 μl）

表6 菌落陽性驗(yàn)證（20 μl）

1.2.5 抗性水稻苗的獲取

通過農(nóng)桿菌EHA105 侵染水稻愈傷組織的方法轉(zhuǎn)化水稻。之后用抗性基因特異引物，常規(guī)PCR法擴(kuò)增檢測水稻苗是否含有抗性基因。然后對水稻苗進(jìn)行轉(zhuǎn)基因篩選鑒定［12］。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因幼苗的抗性鑒定

經(jīng)過轉(zhuǎn)基因陽性篩選，對轉(zhuǎn)基因水稻和對照（非轉(zhuǎn)基因水稻）采用21%PEG 進(jìn)行模擬干旱處理。模擬干旱處理72 h 結(jié)束后，取葉片進(jìn)行POD，SOD，Pro的檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選基因分析

根據(jù)青稞基因組信息對HVUL1H24632.2 基因序列進(jìn)行提取，基因序列如下：ATGTCGTCGGAGA AACAGGAGACGACGGCGGCGGTGCGCGTGCTGG GCAGATGGCGGAGCCCGTTCGTGATCCGGGTGCT GATAGCCCTTGGGCTCAAGGGCGTCGACCACGAG CTCGTGGAGGAGGCGATGGGCAACAAGAGCGAG CTGCTGCTCGCCTCCAACCCGGTGCACAAGATGA TCCCCGTGCTCCTGCACCACGGCAGGCCCGTCTC CGAGTCCCTCATCATCGTCCAGTACGTCGACGAG GCCTGGTCCTCCCATGCCCCGGCGCTCCTCCCGTC CGACCCCTACGCCCGGGCGGCCGAGCGGTTCTGG GCGCAGTACGTCGACGACAAGTTTCCTACGGCGA TCAGGGTGCTGAGGGGAAGGCTGGGCGGAGACA AGGACGAAGCGGCGGTCCAGGTTCGCGCTGCTCT GCAGCGCCTGGAAGTCGCCTTGGTCGAGTGCGGC GGAGGGAAGGATTACTTCGGCGGCGACGGCGTC GGTTACCTGGACATTGCTCTGGGGTCGCACCTCG GCTGGATCAGGGCCGTCGAGAGGATCGCTGAACT CAGGCTTCTCGACGAGGCCAAGGTTCCTAAGCTG GCCGCGTGGGCGGATCGGTTCTGCGCCCACCCGG CGGTGGCGGACGCGATGCCTGGCGTGGAAAGGT TCGTGGAGTTCAGCGTCAAGAATGACGGCGTTCT GAAGGCGGCTAGTGCTAATTCCAAGTGA。對其序列進(jìn)行BLAST 分析，同源比對至tauschii glutathione S-transferase（谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶）。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶普遍參與植物體內(nèi)干旱、鹽、低溫、重金屬等多種非生物脅迫的調(diào)節(jié)，是一種植物應(yīng)對逆境時產(chǎn)生的多功能蛋白酶。當(dāng)生物體遇到逆境時，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶發(fā)揮其抗氧化的作用，保護(hù)生物體免受逆境的損害，從而提供生物體抗逆能力［13］。因此同源分析顯示該基因?qū)τ谇囡购稻哂兄匾饔谩?/p>

2.2 重組載體酶切和測序驗(yàn)證

將PCR產(chǎn)物與載體框架進(jìn)行酶切鏈接，構(gòu)建重組載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后挑取菌落經(jīng)PCR鑒定為陽性重組子的單菌落，接種到含卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基內(nèi)，抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后得到片段大小，均與預(yù)期大小相符，通過測序比較，序列正確，證明載體構(gòu)建成功。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳

2.3 菌落PCR檢測

載體構(gòu)建完成后進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，對農(nóng)桿菌進(jìn)行菌落PCR 檢測，結(jié)果如圖2，結(jié)果顯示已正確進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。

圖2 菌落PCR檢測結(jié)果

2.4 轉(zhuǎn)基因抗性苗篩選基因鑒定

經(jīng)過誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行抗性基因的篩選，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因苗中都含有潮霉素抗性基因，證明轉(zhuǎn)基因成功（圖3）。

圖3 轉(zhuǎn)基因抗性苗篩選基因鑒定結(jié)果

2.5 對轉(zhuǎn)基因F1檢測

對轉(zhuǎn)基因To進(jìn)行自交，收獲F1代，進(jìn)行陽性檢測，檢測結(jié)果如圖4。挑選陽性材料（有條帶材料）進(jìn)行模擬干旱處理。

圖4 F1代陽性檢測結(jié)果

2.6 抗逆能力評估

試驗(yàn)對POD，SOD，Pro 進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，對照（CK）組樣品逆境處理下POD，SOD，Pro 明顯上升，而轉(zhuǎn)基因材料有一定程度上升，上升速度較慢，說明轉(zhuǎn)基因水稻具有一定的抗逆能力（圖5）。

圖5 處理前后POD、SOD、Pro值的變化

3 結(jié)論

通過對HVUL1H24632.2基因的序列分析，評估其與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（tauschii glutathione S-transferase）同源，初步評判其具有一定抗旱能力。隨后通過載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化，對獲得的T0 植株進(jìn)行檢測，證明T0 轉(zhuǎn)基因成功。隨后通過繁種，對獲得F1 的T1 代材料進(jìn)行陽性檢測，對其中陽性材料進(jìn)行模擬干旱處理，結(jié)果顯示POD，SOD，Pro 含量上升較慢，而對照POD，SOD，Pro 含量上升較快，表明轉(zhuǎn)基因植株對干旱脅迫適應(yīng)能力較強(qiáng)，植株對干旱脅迫具有一定抵抗能力，證明HVUL1H24632.2基因具有一定抗旱能力。