唐夢瑤，馬逸杰，田世茂，萬乾暉，楊桂紅

(福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)閩臺動(dòng)物病原生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350002)

A型流感病毒(influenza A virus, IAV)屬于正黏病毒科流感病毒屬的單股負(fù)鏈RNA病毒，其可通過空氣傳播引起多種動(dòng)物的急性上呼吸道感染和急性肺炎導(dǎo)致動(dòng)物死亡[1-5]。IAV基因組含8個(gè)片段，共編碼18種蛋白[6-8]，這種分節(jié)段的形式使得A型流感病毒在傳播過程中易受疫苗免疫或藥物選擇壓力而產(chǎn)生基因重組或氨基酸位點(diǎn)突變，導(dǎo)致原有的疫苗免疫失敗和新的耐藥毒株的產(chǎn)生，使流感疫情防控形勢日趨嚴(yán)峻，嚴(yán)重威脅著動(dòng)物的生命和我國養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[9-13]。相對于流感病毒的高度變異性，宿主的抗病毒因子比較保守，以禽流感病毒-宿主蛋白的相互作用為突破口，通過調(diào)控宿主因子的抗病毒作用達(dá)到阻止病毒入侵的目的[14-17]，為篩選新型抗流感藥物提供重要思路。

神經(jīng)介素B(neuromedin B, NMB)是一種含有32個(gè)氨基酸的生物活性肽[18-24]，可通過結(jié)合其特異性受體參與機(jī)體的多種生物學(xué)功能[25-30]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，IAV/H1N1/PR8亞型毒株感染宿主后會(huì)誘導(dǎo)NMB和NMBR表達(dá)出現(xiàn)顯著上升，并且NMB/NMBR通過調(diào)節(jié)PR8感染誘導(dǎo)的IL-6和IFN-α表達(dá)而抑制PR8在小鼠體內(nèi)的復(fù)制[31]。以上研究結(jié)果表明, NMB/NMBR是機(jī)體發(fā)揮抗IAV/H1N1感染的先天性免疫應(yīng)答系統(tǒng)的重要組成部分，但關(guān)于其抗IAV/H1N1感染的作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究從體內(nèi)和體外水平分別探索了介導(dǎo)NMB抗IAV感染的重要分子細(xì)節(jié)，以期揭露可能介導(dǎo)NMB發(fā)揮抗IAV/H1N1感染的信號途徑，從而為臨床研制新型的抗IAV藥物提供更充足的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗(yàn)材料

MLE-12傳代細(xì)胞(小鼠肺泡上皮細(xì)胞)為本實(shí)驗(yàn)室保存；A型流感病毒株：A/PR/8/34(H1N1)和A/WSN/33(H1N1)均為本實(shí)驗(yàn)室保存經(jīng)典模式毒株；SPF級野生型C57BL/6 J品系小鼠(18 g±2 g)購自上海吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；NucleoZol RNA提取試劑購自上?；蛏锛夹g(shù)國際貿(mào)易有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒(貨號：E047)購自上海近岸科技有限公司；Anti-GAPDH(貨號：HC301-01)購自TransGen biotech公司；Anti-NP 由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存；Anti-NMBR(貨號：ab134141)購自Abcam公司；Anti-NMB(貨號：ER60923)購自杭州華安生物技術(shù)公司；Anti-IκBα(貨號：sc-1643)購自Santa Cruz Biotechnology公司；Anti-P65(貨號：D14E12)、Anti-p-P65(貨號：93H1)購自Cell Signaling Technology公司；兔抗鼠、鼠抗兔二抗購自Jackson Immunoresearch公司，NF-κB抑制劑BAY11-7028(貨號：SF0011-10 mM)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司; 普通PCR儀、電泳凝膠成像儀購自美國伯樂公司；熒光定量LightCycler 96 PCR儀購自羅氏公司；細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱購自日本三洋公司；倒置顯微鏡購自上海尼康儀器有限公司；化學(xué)發(fā)光儀購自美國ProteinSimple公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇 細(xì)胞凍存管置于37 ℃水浴鍋內(nèi)快速解凍，取凍存管中的細(xì)胞至15 mL離心管中和2 mL完全培養(yǎng)基混勻，800 r·min-1離心5 min，棄上清，加入1 mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，轉(zhuǎn)移到含有7 mL完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中輕輕搖勻，置于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 BAY11-7028處理PR8或WSN感染MLE-12細(xì)胞 為研究NMB發(fā)揮抗IAV感染的天然免疫反應(yīng)是否與NF-κB信號通路關(guān)聯(lián)，分別用10 μL PR8(PFU=6.5×106)或10 μL WSN(PFU=1.3×107)感染MLE-12細(xì)胞后，添加1 μL 10 μmol·L-1NF-κB抑制劑BAY11-7028，分析NF-κB信號通路是否影響NMB/NMBR對IAV/H1 N1感染的調(diào)節(jié)作用。試驗(yàn)分為4組：①對照組；②對照組+BAY11-7028；③攻毒組；④攻毒組+BAY11-7028，每組重復(fù)6個(gè)孔。攻毒15 h后收取RNA樣和蛋白樣，通過RT-PCR和qRT-PCR檢測MLE-12細(xì)胞中NMB、NMBR、IL-6和IFN-α以及病毒NP基因表達(dá)變化，Western blot檢測MLE-12細(xì)胞中NMB、NMBR、P65/p-P65、IκBα以及病毒NP蛋白表達(dá)水平變化。

1.2.3 NMB和BAY11-7028共處理PR8或WSN感染MLE-12細(xì)胞 為探究抑制NF-κB信號通路后是否影響NMB對PR8或WSN感染的MLE-12細(xì)胞中IL-6和IFN-α以及病毒NP基因表達(dá)的調(diào)控，分別用10 μL PR8(PFU=6.5×106)或10 μL WSN(PFU=1.3×107)感染MLE-12細(xì)胞后添加外源性1 μL 1 nmol·L-1NMB和1 μL 10 μmol·L-1NF-κB抑制劑BAY11-7028。試驗(yàn)分為5組：①對照組；②攻毒組；③攻毒+NMB組；④攻毒+BAY11-7028組；⑤攻毒+BAY11-7028+NMB組，每組重復(fù)6個(gè)孔。攻毒15 h后收取RNA樣，通過qRT-PCR檢測MLE-12細(xì)胞中IL-6、IFN-α和病毒NP基因表達(dá)變化。

1.2.4 NMB對PR8或WSN感染誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)NF-κB信號通路的影響 為進(jìn)一步探究NMB對IAV感染小鼠體內(nèi)NF-κB信號通路的影響，選取6～8周齡(18 g±2 g)SPF級野生型C57小鼠，分別用100 μL PR8(PFU=6.5×106)或100 μL WSN(PFU=1.3×107)滴鼻感染，12 h后腿部肌肉分別注射100 μL 1 nmol·L-1NMB或100 μL 1 nmol·L-1NMBRA。試驗(yàn)分為6組：①對照組；②對照組+NMB；③對照組+NMB+NMBR拮抗劑(NMBRA)；④攻毒組；⑤攻毒組+NMB；⑥攻毒組+NMB+NMBRA，每組6只小鼠。攻毒96 h后取小鼠肺組織分別稱50 mg提取RNA和蛋白，通過RT-PCR和qRT-PCR檢測IL-6、IFN-α和病毒NP基因表達(dá)變化，Western blot分析P65/p-P65、IκBα和病毒NP蛋白表達(dá)水平變化。

1.2.5 RT-PCR和qRT-PCR 按照NucleoZol 總RNA提取試劑說明書提取各組樣品總RNA，然后根據(jù)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。使用NCBI數(shù)據(jù)庫在線引物設(shè)計(jì)工具Primer-BLAST設(shè)計(jì)引物，具體引物序列見表1。RT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55～60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共25～35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL 經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析目的條帶。qRT-PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，62 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 30 s；反應(yīng)結(jié)束后，對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 RT-PCR 和qPCR引物

1.2.6 Western blot(WB) 提取MLE-12細(xì)胞和小鼠肺組織樣品蛋白，用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜上；將(NC)膜置于5%牛奶中封閉2 h，1×TBS中漂洗干凈，一抗孵育2～3 h，再用1× TBS中漂洗30 min(每隔10 min換一次TBS)，二抗孵育2 h，再次用1×TBS中漂洗30 min(每隔10 min換1次TBS)，化學(xué)發(fā)光儀曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以上相關(guān)試驗(yàn)均進(jìn)行3次以上獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，運(yùn)用T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析差異顯著性。其中*.P<0.05 表示差異顯著；**.P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 BAY11-7028對PR8或WSN感染MLE-12細(xì)胞中相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

通過RT-PCR和qRT-PCR檢測各組細(xì)胞中NMB、NMBR、IL-6、IFN-α和NP基因轉(zhuǎn)錄水平的差異。結(jié)果顯示，BAY11-7028可誘導(dǎo)PR8感染的MLE-12細(xì)胞中NMB、NMBR、IL-6和IFN-α 基因表達(dá)水平均有所下降，NP表達(dá)水平有所上升(圖1)，其中NMB顯著下降(P<0.05)，NMBR、IL-6和IFN-α極顯著下降(P<0.01)，NP極顯著上升(P<0.01)。

A.RT-PCR分析結(jié)果；B～F.qRT-PCR分析結(jié)果；*.P<0.05，**.P<0.01

BAY11-7028對WSN感染后這些基因的表達(dá)呈現(xiàn)相似的作用，其中NMB、IL-6 和IFN-α極顯著下降(P<0.01)，NMBR顯著下降(P<0.05)，NP極顯著上升(P<0.01)(圖2)。這些結(jié)果表明，BAY11-7028能有效抑制PR8和WSN感染誘導(dǎo)的NF-κB信號通路，暗示了PR8和WSN感染誘導(dǎo)MLE-12細(xì)胞中NMB和NMBR基因表達(dá)變化與NF-κB信號通路直接相關(guān)。

A.RT-PCR分析結(jié)果；B～F.qRT-PCR分析結(jié)果；*.P<0.05，**.P<0.01

2.2 BAY11-7028對PR8或WSN感染MLE-12細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

收集并提取各組總蛋白，Western blot分析各組NMB、NMBR、p-P65、IκBα和NP蛋白表達(dá)變化。如圖3所示，與PR8或WSN感染組相比，BAY11-7028可促使PR8或WSN感染后的MLE-12細(xì)胞中NMB、NMBR和p-P65蛋白表達(dá)水平明顯降低，IκBα和NP蛋白表達(dá)水平上升。該結(jié)果表明，PR8和WSN感染誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞中NMB和NMBR蛋白表達(dá)水平均與NF-κB信號通路有關(guān)。

圖3 WB分析BAY11-7028處理PR8或WSN感染MLE-12細(xì)胞后相關(guān)蛋白表達(dá)情況

2.3 NMB和BAY11-7028對PR8或WSN感染MLE-12細(xì)胞中相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

qRT-PCR分析各組中IL-6、IFN-α和NP基因的轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果顯示，與PR8感染組相比，NMB和BAY11-7028可誘導(dǎo)PR8感染后的IL-6、IFN-α和NP基因的轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)變化(圖4)，其中IL-6(P<0.01)和NP(P<0.01)出現(xiàn)極顯著下降，IFN-α(P<0.01)顯著上升。NMB和BAY 11-7028也可誘導(dǎo)WSN感染后的IL-6、IFN-α和NP基因的轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)變化，其中IL-6(P<0.01)和NP(P<0.01)出現(xiàn)極顯著下降，IFN-α(P<0.05)顯著上升(圖5)。這些結(jié)果表明，BAY11-7025可削弱外源性NMB對PR8或WSN感染誘導(dǎo)的MLE-12細(xì)胞中IL-6和IFN-α 基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)作用。

*.P<0.05, **.P<0.01

*.P<0.05, **.P<0.01

2.4 NMB和NMBRA對PR8或WSN感染誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)相關(guān)蛋白的影響

收集并提取各組總蛋白，通過Western blot分析p-P65、IκBα和NP蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，PR8感染誘導(dǎo)小鼠肺組織p-P65和NP蛋白表達(dá)水平上升，IκBα蛋白表達(dá)水平下降；與PR8感染組相比，外源性NMB可抑制小鼠肺組織內(nèi)p-P65和NP蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)IκBα蛋白表達(dá)水平；WSN感染小鼠的結(jié)果與PR8感染的結(jié)果基本一致(圖6)。NMBR抑制劑NMBRA聯(lián)合NMB可抵消NMB對PR8或WSN感染后的這些蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用(圖6)，這反向證明了NMB的作用效果。這些結(jié)果表明，NMB可以調(diào)節(jié)NF-κB信號通路的p-P65和IκBα的表達(dá)而發(fā)揮抗IAV/H1N1的先天性免疫應(yīng)答反應(yīng)。

圖6 Western blot分析NMB和NMBRA處理PR8或WSN感染小鼠后相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討 論

NMB通過特異性結(jié)合受體NMBR參與調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)的生物學(xué)功能。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，外源性NMB可以調(diào)控PR8感染誘導(dǎo)的宿主細(xì)胞和動(dòng)物體內(nèi)的IL-6和IFN-α基因的表達(dá)而發(fā)揮抗PR8感染的先天性免疫應(yīng)答反應(yīng)[31]，但其詳細(xì)作用機(jī)制尚不清楚。研究表明，神經(jīng)肽家族的成員可通過誘導(dǎo)NF-κB表達(dá)而調(diào)節(jié)天然免疫和獲得性免疫[20-21]。NF-κB信號通路是體內(nèi)抗病毒感染的信號通路，具有調(diào)控炎癥因子、干擾素和多種抗病毒因子表達(dá)的功能[27-29,32-35]，其活性能夠被NF-κB抑制劑有效抑制，如：BAY11-7028[36-37]等。A型流感病毒感染激活NF-κB信號通路后，可誘導(dǎo)IκBα蛋白表達(dá)和P65蛋白磷酸化及核轉(zhuǎn)移，從而影響下游細(xì)胞因子的表達(dá)[38-39]。這些研究暗示NMB參與宿主發(fā)揮抗IAV/H1N1感染可能與NF-κB信號通路密切相關(guān)。

為剖析NF-κB信號通路是否介導(dǎo)NMB發(fā)揮抗IAV/H1N1感染的先天性免疫應(yīng)答反應(yīng)，本研究發(fā)現(xiàn)BAY11-7028能夠抑制PR8和WSN感染MLE-12細(xì)胞中IκBα表達(dá)，增強(qiáng)P65活性，降低NMB和NMBR表達(dá)水平，這表明NMB和NMBR表達(dá)變化與PR8和WSN感染激活的NF-κB信號通路直接相關(guān)。因此，NMB/NMBR是如何通過NF-κB信號通路參與抗IAV感染誘導(dǎo)的先天性免疫應(yīng)答反應(yīng)值得進(jìn)行研究。進(jìn)一步的體外試驗(yàn)結(jié)表明，外源性NMB可促使IAV/H1N1感染的MLE-12細(xì)胞中IL-6基因表達(dá)下降和IFN-α基因表達(dá)上升，這與前期的研究結(jié)果一致[31]。然而，外源性NMB和BAY11-7028共處理后誘導(dǎo)PR8和WSN感染MLE-12細(xì)胞中IL-6和IFN-α基因表達(dá)水平極顯著下降，該結(jié)果表明外源性NMB可通過NF-κB信號通路參與IAV/H1N1感染誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果也表明，外源性NMB可抑制PR8或WSN感染小鼠誘導(dǎo)的肺組織p-P65和NP蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)IκBα蛋白表達(dá)水平。NMBR抑制劑NMBRA聯(lián)合NMB可抵消NMB對PR8和WSN感染后的這些蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用，反向證實(shí)了上述NMB作用的可靠性。體內(nèi)外試驗(yàn)結(jié)果一致表明，NMB可通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路上的p-P65和IκBα的表達(dá)而影響IAV感染誘導(dǎo)的IL-6和IFN-α的表達(dá)，從而發(fā)揮抗IAV/H1N1的先天性免疫應(yīng)答反應(yīng)。

4 結(jié) 論

本文分別從體內(nèi)和體外水平研究發(fā)現(xiàn)NMB/NMBR與IAV/H1N1感染誘導(dǎo)的NF-κB信號通路存在直接關(guān)聯(lián)，并且外源性NMB可通過調(diào)節(jié)IAV/H1N1感染誘導(dǎo)的p-P65和IκBα表達(dá)的作用，進(jìn)而影響IAV/H1N1感染誘導(dǎo)的IL-6和IFN-α基因的表達(dá)水平。綜合這些結(jié)果表明，IAV/H1N1感染誘導(dǎo)的NMB和NMBR表達(dá)可通過NF-κB信號通路參與機(jī)體發(fā)揮抗IAV感染的先天性免疫應(yīng)答反應(yīng), 這為深入了解宿主抗IAV/H1N1感染的免疫反應(yīng)機(jī)制和開發(fā)新型抗IAV/H1N1的藥物提供更充足的理論依據(jù)。