申仲健，郝永勝，吳永保，張 博，唐 靜，侯水生，謝 明

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所 動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京 100193)

維生素K是動物體生命活動不可缺少的一種脂溶性維生素[1-2]，畜牧業(yè)中常用維生素K3作為畜禽維生素K補充劑[3]。維生素K具有多種生理功能，如參與凝血過程[4]、維持骨代謝穩(wěn)態(tài)[5]、抑制血管鈣化[6]等，其中，凝血作用是維生素K最經(jīng)典也是最基本的生理作用。臨床研究上常用凝血酶原時間(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)和凝血酶時間(thrombin time，TT)的長短診斷是否存在凝血功能障礙[7]，當(dāng)機體缺乏維生素K時，部分凝血酶原無法活化將導(dǎo)致PT延長[8]。維生素K主要通過參與羧化維生素K依賴蛋白發(fā)揮生理作用，此過程中維生素K作為γ-谷氨酸羧化酶的輔助因子將維生素K依賴蛋白的特定谷氨酸殘基轉(zhuǎn)化為羧基谷氨酸殘基[9]。目前，已發(fā)現(xiàn)多種維生素K依賴蛋白，如與凝血功能相關(guān)的凝血酶原前體蛋白(protein induced in the vitamin K absence or antagonism-factor II，PIVKA-II)[4]、與骨代謝中成骨細胞活性相關(guān)的骨鈣素(osteocalcin，OC)[10]、與血管鈣化及軟骨發(fā)育相關(guān)的基質(zhì)Gla蛋白(matrix gamma-carboxyglutamate protein，MGP)[11]，三種維生素K依賴蛋白在血液循環(huán)中的羧化不全形式常被用來評價機體凝血功能[12]、預(yù)測骨折[13]和血管鈣化[14]風(fēng)險，同樣也可以作為評價維生素K營養(yǎng)狀況的參照指標(biāo)。美國NRC(1994)家禽營養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)和中國肉鴨飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(2012)中推薦不同生長階段北京鴨維生素K營養(yǎng)需要量分別為0.5和2.0 mg·kg-1，但目前尚未發(fā)現(xiàn)肉鴨維生素K試驗研究作為理論支撐。同時，家禽飼糧中維生素K3實際添加量往往是美國NRC(1994)推薦量的數(shù)倍[15]。因此，本試驗通過研究不同添加水平維生素K3對14日齡北京鴨凝血時間和維生素K依賴蛋白的影響，探討血液中反映肉鴨維生素K營養(yǎng)狀況的敏感指標(biāo)，并采用折線模型估算育雛期北京鴨飼糧維生素K3適宜添加量，為肉鴨飼料配制中維生素K的合理有效使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計及飼糧

試驗采用玉米-大豆分離蛋白型飼糧為基礎(chǔ)飼糧，飼料原料常規(guī)營養(yǎng)成分參考中國飼料成分及營養(yǎng)價值表(2018)，基礎(chǔ)飼糧營養(yǎng)水平參考中國肉鴨飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(2012)，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗采用單因子完全隨機試驗設(shè)計，通過在基礎(chǔ)飼糧中添加6個不同水平的亞硫酸氫鈉甲萘醌(0、0.98、1.96、3.92、5.88和7.84 mg·kg-1，甲萘醌含量為51%)配制成6種維生素K3添加水平(0、0.5、1、2、3和4 mg·kg-1)的試驗飼糧。將180只1日齡健康雄性北京鴨按照每處理每重復(fù)鴨只初始體重基本一致的原則隨機分為6個處理，每個處理5個重復(fù)，每重復(fù)6只鴨，試驗期為14 d。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗鴨網(wǎng)上平養(yǎng)，自由飲水，自由采食相應(yīng)的試驗飼糧，24 h光照，育雛期舍內(nèi)溫度從1日齡32 ℃逐漸降低至14日齡26 ℃，每隔兩天通過調(diào)整供暖設(shè)備溫度和通風(fēng)量的方式下調(diào)舍內(nèi)溫度1 ℃左右。

1.3 生長性能測定

于14日齡，稱取各處理組各重復(fù)鴨只空腹體重和剩余飼料重，計算1～14日齡鴨平均日增重(average daily gain，ADG)、平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)和料重比(feed/gain，F(xiàn)/G)。

1.4 凝血時間測定

于14日齡，從每處理每重復(fù)隨機挑選試驗鴨2只，使用無抗凝劑真空采血管頸靜脈采血5 mL，立即精確吸取全血2.7 mL置于裝有0.3 mL枸櫞酸鈉溶液的離心管中，3 500 r·min-1離心15 min，分離血漿，-80 ℃保存，并使用上海太陽UP1500全自動凝血分析儀測定PT、APTT和TT。

1.5 血清維生素K依賴蛋白測定

采血管中剩余血液制備血清，于-20 ℃保存，用于測定血清PIVKA-II、羧化不全骨鈣素(undercarboxylated osteocalcin，ucOC)和羧化不全基質(zhì)Gla蛋白(undercarboxylated matrix Gla protein，ucMGP)含量，三種血清維生素K依賴蛋白含量均采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定，使用BiotekEpoch酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度，并根據(jù)吸光度和標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清中維生素K依賴蛋白含量。分別采用上海酶聯(lián)公司生產(chǎn)的PIVKA-II、ucOC試劑盒和江蘇酶免公司生產(chǎn)的ucMGP試劑盒進行指標(biāo)測定。

1.6 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，使用SAS 9.4軟件進行統(tǒng)計分析，按照單因子完全隨機試驗設(shè)計應(yīng)用GLM程序進行方差分析，運用Duncan氏法進行組間的多重比較，并且采用折線模型擬合曲線從而預(yù)測維生素K3需要量。

2 結(jié) 果

2.1 不同維生素K3添加水平對1～14日齡北京鴨生長性能的影響

如表2所示，各處理組之間ADG、ADFI和F/G均無顯著差異，因此飼糧中添加不同水平維生素K3對1～14日齡北京鴨ADG、ADFI和F/G均未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。

表2 不同維生素K3添加水平對1～14日齡北京鴨生長性能的影響

2.2 不同維生素K3添加水平對14日齡北京鴨凝血時間的影響

如表3所示，0和0.5 mg·kg-1維生素K3添加組PT顯著高于2、3、4 mg·kg-1維生素K3添加組(P<0.05)；不同維生素K3添加水平對APTT和TT均未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。

表3 不同維生素K3添加水平對14日齡北京鴨凝血時間的影響

2.3 不同維生素K3添加水平對14日齡北京鴨血清維生素K依賴蛋白的影響

如表4所示，0 mg·kg-1維生素K3添加組血清PIVKA-II含量顯著高于其他組(P<0.05)；0 mg·kg-1維生素K3添加組血清ucOC含量顯著高于2、3、4 mg·kg-1維生素K3添加組(P<0.05)；不同維生素K3添加水平對血清ucMGP含量未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。

表4 不同維生素K3添加水平對14日齡北京鴨血清維生素K依賴蛋白的影響

2.4 1～14日齡北京鴨維生素K3需要量估算

如表5所示，采用折線模型估算1～14日齡北京鴨維生素K3需要量，以PT、血清PIVKA-II和ucOC含量為評價指標(biāo)估算結(jié)果分別為2.00、0.56和1.27 mg·kg-1。

表5 折線模型估算1～14日齡北京鴨維生素K3需要量

3 討 論

3.1 不同維生素K3添加水平對1～14日齡北京鴨生長性能的影響

多項研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加維生素K3對各類畜禽及魚類生長性能的影響較為有限，試驗結(jié)果基本一致。Marchetti等[3]在生長育肥豬飼糧中添加不同水平的維生素K3，與未添加維生素K3的對照組相比，添加維生素K3組生長豬ADG、ADFI、F/G均無顯著差異；Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，提高飼糧維生素K3添加水平對1～5周齡肉雞生長性能無顯著影響；Cheng等[17]在魚類上的研究也表明，飼糧中添加維生素K3無法顯著提高大黃魚的生長速率。目前尚無飼糧添加維生素K3對肉鴨生長性能的研究，本試驗結(jié)果顯示，在玉米-大豆分離蛋白型基礎(chǔ)飼糧中添加不同水平維生素K3對1～14日齡北京鴨ADG、ADFI和F/G均無顯著影響，這與上述維生素K3對不同動物生長性能無顯著影響的研究結(jié)果相符。因此，評價肉鴨維生素K營養(yǎng)狀況還需要從維生素K對動物生理生化方面的影響為切入點進一步深入探究。

3.2 不同維生素K3添加水平對14日齡北京鴨凝血時間的影響

維持機體正常凝血功能是維生素K最早被發(fā)現(xiàn)的生理功能，維生素K因此也被稱為凝血性維生素[18]，在臨床研究上常用PT、APTT和TT作為評價凝血時間的檢測指標(biāo)[7]，其中PT延長是由凝血酶原的缺乏導(dǎo)致的凝血時間延長，而維生素K與凝血酶原的活化有著直接的聯(lián)系，因此，PT相較于另外兩種凝血指標(biāo)能夠更加準(zhǔn)確地反映由維生素K缺乏導(dǎo)致的凝血時間延長的情況[8,19-20]。Ferland等[21]通過給雄性小鼠飼喂不同維生素K水平的飼糧，發(fā)現(xiàn)飼喂低維生素K水平飼糧組的小鼠PT較高維生素K水平組延長，但小鼠體重?zé)o顯著差異。本試驗結(jié)果顯示，隨著飼糧維生素K3添加水平的降低PT顯著延長，APTT和TT無顯著變化。這一結(jié)果表明，飼糧低維生素K3添加水平組中14日齡北京鴨由于維生素K缺乏導(dǎo)致PT延長，需要在基礎(chǔ)飼糧中添加維生素K3增強育雛期肉鴨的凝血功能。

3.3 不同維生素K3添加水平對14日齡北京鴨血清維生素K依賴蛋白的影響

維生素K發(fā)揮其生理生化作用的方式主要是通過作為γ-谷氨酸羧化酶的輔助因子參與羧化反應(yīng)使維生素K依賴蛋白活化，獲得生理活性[1]，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的維生素K依賴蛋白主要包括PIVKA-II、骨鈣素和基質(zhì)Gla蛋白[22]。PIVKA-II也被用于評價機體凝血功能和維生素K營養(yǎng)狀況[4, 20]，PIVKA-II經(jīng)維生素K羧化為具有生物活性的凝血酶原，從而參與凝血過程。研究表明，維生素K攝入量與血清PIVKA-II水平呈高度負相關(guān)[23]，本試驗結(jié)果也顯示，飼糧添加維生素K3可顯著降低14日齡北京鴨血清PIVKA-II水平。

骨鈣素作為骨形成標(biāo)志物，同時是維生素K依賴蛋白，在骨骼礦化的生理過程中發(fā)揮重要的作用[24]，骨鈣素由成骨細胞分泌后部分進入血液，當(dāng)體內(nèi)缺乏維生素K時，部分骨鈣素?zé)o法羧化，失去結(jié)合羥基磷灰石能力[25-26]。Vergnaud等[27]研究發(fā)現(xiàn)，ucOC水平伴隨著衰老會逐漸升高，并與骨折風(fēng)險顯著正相關(guān)；也有研究表明，在飲食中補充維生素K，血清ucOC水平較未補充組顯著降低，增強骨形成，降低骨吸收能力[28]；ELISA法測定血清ucOC水平可預(yù)測中老年婦女髖骨骨折風(fēng)險[13]。因此，血清ucOC水平也能夠方便和靈敏地評價維生素K營養(yǎng)狀況。本試驗結(jié)果表明，飼糧添加維生素K3可顯著降低血清ucOC含量，間接促進肉鴨骨骼發(fā)育并降低骨折風(fēng)險。

基質(zhì)Gla蛋白也是一種維生素K依賴蛋白，主要在軟骨細胞和血管平滑肌細胞中表達和產(chǎn)生[29]，羧化基質(zhì)Gla蛋白通過與鈣晶體結(jié)合抑制異位礦化，在血管和軟骨中起到抑制鈣化的作用[30]，機體缺乏維生素K可能會導(dǎo)致患心血管疾病[11]。Cranenburg等[14]發(fā)現(xiàn)，患有心血管疾病或有血管鈣化傾向的患者，其循環(huán)ucMGP水平明顯較低。同樣地，Silaghi等[31]采用ELISA法測定血清ucMGP含量，發(fā)現(xiàn)膝關(guān)節(jié)炎患者血清ucMGP水平顯著低于非炎癥組。本試驗結(jié)果顯示，飼糧添加維生素K3對14日齡北京鴨血清ucMGP含量無顯著影響，這可能與機體維生素K缺乏程度未導(dǎo)致血管鈣化和軟骨異位鈣化有關(guān)，有待進一步研究。

3.4 1～14日齡北京鴨維生素K3需要量的確定

PT和PIVKA-II均能較好地反映機體的凝血功能[7]，血清ucOC水平常被用來評估骨折風(fēng)險[13]。本試驗采用上述三個指標(biāo)進行折線模型擬合需要量，結(jié)果顯示，以PT和血清PIVKA-II為評價指標(biāo)擬合曲線的P值小于0.05，PT作為評價指標(biāo)估算維生素K3需要量為2.00 mg·kg-1，在此維生素K3添加水平下肉鴨血清PIVKA-II和ucOC可維持較低水平。因此，以PT為評價指標(biāo)，采用折線模型估測1～14日齡北京鴨維生素K3需要量為2.00 mg·kg-1。

4 結(jié) 論

提高飼糧維生素K3添加水平可顯著提高肉鴨凝血功能，降低PIVKA-II、ucOC等維生素K依賴蛋白水平，并且以PT為評價指標(biāo)，采用折線模型估測1～14日齡北京鴨維生素K3需要量為2.00 mg·kg-1。