1986年 雞冠提取

公雞冠透明質(zhì)酸的制備及其理化性質(zhì) 沈渤紅 張?zhí)烀?/p>

摘要：選用我國(guó)尚未開發(fā)的動(dòng)物資源公雞冠為原料，設(shè)計(jì)了適于生產(chǎn)的制備工藝，并對(duì)所得產(chǎn)品進(jìn)行了理化分析，為透明質(zhì)酸制劑的生產(chǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

結(jié)論：為了保持透明質(zhì)酸的大分子特性，采用了一次蛋白酶解、Sevag技術(shù)與CPC分級(jí)沉淀技術(shù)配合使用，有效地除去了蛋白質(zhì)和核酸。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：在高鹽濃度下，大部分蛋白質(zhì)遇到有機(jī)溶劑可變性，或被鹽析沉出，或在乙醇沉淀之后不再溶于水，這一步可明顯地使提取液得到純化。根據(jù)多糖與蛋白質(zhì)的CPC復(fù)合物解離臨界鹽濃度不同的這一原理，我們進(jìn)一步采用CPC分級(jí)沉淀，以除去剩余蛋白質(zhì)與核酸。

實(shí)驗(yàn)中觀察到，乙醇沉淀透明質(zhì)酸水提液時(shí)，出現(xiàn)兩種形式的沉淀，主要部分為纖維狀，漂浮于上部，另一部分為粉末狀，沉于下部。當(dāng)在強(qiáng)酸條件下，用氯仿處理提取液后，再沉淀時(shí)，纖維狀沉淀消失，溶液黏度明顯降低，說明纖維狀沉淀與大分子特性和溶液濃度有關(guān)。透明質(zhì)酸溶液濃度在低于0.05%時(shí)，其分子在溶液中大多獨(dú)立存在;當(dāng)濃度大于0.1%時(shí)，部分交織成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。推測(cè)這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)沉淀下來呈現(xiàn)纖維狀，而部分散的分子沉淀下來呈粉末狀。

從保持其高分子量、高黏度和高純度等方面進(jìn)行了理化分析，結(jié)果表明：經(jīng)換算，本工藝制備的雞冠透明質(zhì)酸的分子量接近Healon（眼用黏彈劑），并具有高黏度及高純度特性，可用于配制透明質(zhì)酸制劑。

文獻(xiàn)來源：沈渤紅，張?zhí)烀?公雞冠透明質(zhì)酸的制備及其理化性質(zhì)[J].醫(yī)藥工業(yè)，1986，17（7）：291-294.

1986年 動(dòng)物眼玻璃體提取

牛眼玻璃體透明質(zhì)酸的研制及應(yīng)用 凌沛學(xué) 張?zhí)烀?張子剛

摘要：從牛眼玻璃體制備了透明質(zhì)酸，所得樣品的理化分析結(jié)果表明其質(zhì)量達(dá)到眼科用的要求，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及眼科臨床試用后認(rèn)為其制劑可用于眼科臨床。

結(jié)論：由于眼科用HA制劑要求具有高黏度，本工藝盡量采用溫和條件，避免可能使HA降解的處理，并且使雜質(zhì)含量低于國(guó)外產(chǎn)品。用乙醇沉淀HA時(shí)，可得到絮狀和粉狀兩種沉淀，將粉狀HA用水溶解，再用丙酮沉淀，可變成絮狀，說明兩者在結(jié)構(gòu)及分子量上并無顯著差異。制劑制備工藝中選用26%甘油等滲液作溶劑，既可增加制劑黏度，又可提高其穩(wěn)定性。

動(dòng)物眼科實(shí)驗(yàn)各項(xiàng)觀察結(jié)果表明，HA所致眼組織反應(yīng)均略低于對(duì)照組，證明所得制劑無抗原性及致炎性，眼組織可很好地耐受。眼科臨床試驗(yàn)表明，牛眼HA制劑可加深前房，維持前房一定深度，便于手術(shù)操作，保護(hù)角膜內(nèi)皮細(xì)胞，防止虹、角膜黏連，提高手術(shù)成功率。

文獻(xiàn)來源：凌沛學(xué)，張?zhí)烀?，張子?牛眼玻璃體透明質(zhì)酸的研制及應(yīng)用[J].醫(yī)藥工業(yè)，1987：18（7）：295-299

2005年 人臍帶提取

從人臍帶殘留物中分離、純化和表征透明質(zhì)酸

Guillermo Lagoa， Loida Orunab， Jose A.Crematac， Carlos Perezd，Gabriel Cotoa， Efren Lauzana，John F.Kennedye

摘要：本文的主要目的是討論分離透明質(zhì)酸的新程序。透明質(zhì)酸可以從人臍帶殘留中獲得，從其他生物制藥生產(chǎn)中獲得。該路線涉及用氯化鈉溶液處理人臍帶殘留物，然后用季銨鹽溶液沉淀;將固體重新懸浮在氯化鈣溶液中以解離透明質(zhì)酸季銨鹽復(fù)合物，然后乙醇誘導(dǎo)沉淀得到產(chǎn)物。產(chǎn)物經(jīng)氯仿抽提4次純化，并用化學(xué)方法如Blumenkrantz和Asboe-Hansen糖醛酸測(cè)定法、Elson Morgan己糖胺定性試驗(yàn)、特性黏度、離子交換色譜法、13C核磁共振譜等表征。結(jié)果表明，該產(chǎn)品可用于配制治療皮膚病的軟膏、乳液和乳膏。

結(jié)論：本文描述了一種從用有機(jī)溶劑處理過的人臍帶產(chǎn)生的副產(chǎn)品中分離HA鈉鹽的來源，迄今為止從未報(bào)道過。與其他已知方法相比，所采用的程序更簡(jiǎn)單，并具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)。例如，開發(fā)Balazs方法（1979）需要許多步驟。在Balazs方法的第一階段，原材料用水洗滌，直到從組織中去除血液，然后壓碎并儲(chǔ)存。在第二階段，組織用20倍體積的水和1倍體積的氯仿處理，攪拌24小時(shí)并過濾以提取HA和其他多糖。在我們的方法中，不需要第一個(gè)Balazs階段，因?yàn)槭褂昧似渌a(chǎn)中剩余的原材料，并且使用0.2%w/v氯化鈉水溶液作為HA提取的主要溶劑。這種濃度的氯化鈉溶液在萃取極性化合物（包括HA）時(shí)更有效。

這種方法也可以與Danishevsky和Bella（1966）的方法進(jìn)行比較，因?yàn)橥瑯邮褂?.2%氯化鈉溶液作為從原料中提取HA的溶劑，但在我們的案例中，人類臍帶殘留物被用作生物來源和0.9 M氯化鈣溶液，僅用于解離HA-CTAB復(fù)合物。這些方面以前沒有報(bào)道過。

文獻(xiàn)來源：Guillermo Lago，Loida Oruna，Jose A.Cremata，Carlos Perez，Gabriel Coto，Efren Lauzan，John F.Kennedy.Isolation，purification and characterization of hyaluronan fromhuman umbilical cord residues[J].Carbohydrate Polymers，2005.62：321-326.

2006年發(fā)酵法生產(chǎn)

發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸 張玉 張朝中

摘要：透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA），又名玻璃酸，是一種酸性黏多糖。1934年美國(guó)Meyer等首先從牛眼玻璃體中分離出該物質(zhì)。此后，人們利用現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)和設(shè)備，以提高HA產(chǎn)率為目的，對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)HA進(jìn)行了較全面地研究。

HA發(fā)酵的一般工藝流程：[培養(yǎng)]→[移種]→[醇沉]→[溶解]→[絡(luò)合沉淀]→[醇沉]→[脫水干燥]

結(jié)論：發(fā)酵法生產(chǎn)的HA在菌體外的溶液中游離存在，與從動(dòng)物組織提取相比，無需提取步驟，易于分離純化。HA的發(fā)酵水平從2～4g/L，提高到6～7g/L，發(fā)酵法生產(chǎn)HA比提取法有較大優(yōu)勢(shì)。

目前所用的菌種是經(jīng)過誘變處理鏈球菌，其的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)目前所用的氮源為各種肉浸膏、蛋白胨、氨基酸、酵母膏等，其中酵母膏最常用。在發(fā)酵液中添加一定量的谷氨酸和精氨酸，可以提高HA的產(chǎn)率。碳源主要是各種單糖、蔗糖和淀粉水解物，最常用的是葡萄糖。其它還有磷酸鹽、硫酸鹽，鉀、鈉等無機(jī)鹽，鐵、錳等微量元素。

HA的發(fā)酵有需氧發(fā)酵也有厭氧發(fā)酵。目前看來，多傾向于有氧發(fā)酵，專利文獻(xiàn)中HA產(chǎn)率較高的多采用通氣需氧發(fā)酵，而且分子量高。厭氧發(fā)酵產(chǎn)率低，分子量也低。在整個(gè)發(fā)酵過程中通常保持一個(gè)適當(dāng)?shù)娜苎趿?，而在不同的階段采用不同的溶氧量，也是提高HA產(chǎn)率的手段之一。

在HA的發(fā)酵生產(chǎn)中，pH值是一個(gè)重要的因素，一股控制在6.0～8.5范圍內(nèi)，低于6.0或高于8.5，會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)，降低HA的產(chǎn)率和分子量。在發(fā)酵過程中，需要用氫氧化鈉或碳酸鈉溶液進(jìn)行中和，以維持適當(dāng)?shù)腄H值。

發(fā)酵生產(chǎn)HA具有產(chǎn)量不受原料資源限制、成本低、分離純化工藝簡(jiǎn)捷、易于規(guī)模化生產(chǎn)等特點(diǎn)，是HA生產(chǎn)的發(fā)展方向，應(yīng)進(jìn)一步深入研究和提高。

文獻(xiàn)來源：張玉，張朝中發(fā)酵法生產(chǎn)透明質(zhì)酸[J].北方藥學(xué)，2006，3（02）：10-11.