田平平，潘 穎，施 維，劉 佳，于春雷*

（1.安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，安徽合肥 230601；2.川北醫(yī)學(xué)院，四川南充 637000）

食管癌是最常見的胃腸道惡性腫瘤之一，目前尚無有效的治療方法，發(fā)病呈逐年上升趨勢[1]。在我國90%以上食管癌病例為鱗狀細(xì)胞癌亞型，少數(shù)為腺癌亞型，且絕大多數(shù)食管癌患者確診時(shí)已處于癌癥中晚期[2]。目前，食管癌的治療手段主要有包括手術(shù)、放射治療和化療等，然而上述治療措施的臨床療效有限[3]。食管癌復(fù)發(fā)患者一般會(huì)對(duì)曾用化療藥物表現(xiàn)出一定程度的耐藥性，因此，研發(fā)新型高效低毒的食管癌治療藥物是改善當(dāng)前食管癌治療困境的一種有效途徑。

當(dāng)前，有關(guān)新型天然抗腫瘤藥物的開發(fā)越來越受到關(guān)注[4]。地黃（Rehmannia glutinosa）是玄參科多年生草本植物，有悠久的藥用歷史。近年來隨著提取分離技術(shù)的革新，對(duì)于地黃的藥用價(jià)值認(rèn)識(shí)更加透徹[5]。益母草苷（Ajugol）是一種環(huán)烯醚糖苷化合物，能從地黃中分離提取，已被證明是多種中藥的有效成分[6]，已被證實(shí)具有護(hù)肝、清熱涼血、抗菌功效[7]。該次研究中，采用不同濃度的Ajugol 在體外作用于食管癌TE-1 細(xì)胞、Eca-109 和KYSE-150 細(xì)胞，通過CCK-8 試劑盒檢測Ajugol 對(duì)食管癌細(xì)胞生長抑制作用。為了進(jìn)一步探究其抑制細(xì)胞增殖作用機(jī)制，筆者采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率，確定Ajugol 是否通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡，影響細(xì)胞周期來誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞死亡，以期為地黃在食管癌的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑

人食管癌細(xì)胞TE-1、Eca-109、KYSE-150 均購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

Ajugol 試劑購于成都瑞芬思生物技術(shù)有限公司，用DMSO（購于上海生物工程技術(shù)有限公司），溶解分裝后-80℃保存。RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化液、青霉素及鏈霉素雙抗均購自Hyclone 公司。CCK-8 試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。Annexin V-FITC 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、RIPA 裂解液（強(qiáng)）、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

熒光倒置顯微鏡（CKX41）為Olympus 公司產(chǎn)品，Spectramax190 酶標(biāo)儀為Molecular Devices 公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀為BD 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)。將TE-1、Eca-109、KYSE-150 細(xì)胞培養(yǎng)在加有10%胎牛血清及雙抗（青霉素及鏈霉素）的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基中，置于37℃，含5% CO2且箱底有無菌去離子水的恒溫培養(yǎng)箱中。所有細(xì)胞相關(guān)操作均在無菌操作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。

1.2.2 CCK-8 比色法。將生長狀態(tài)良好的TE-1、Eca-109、KYSE-150 細(xì)胞，按3×104/mL的密度接種在96 孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，用不同濃度的Ajugo（100、25、6.25、1.56、0.39 μM）處理細(xì)胞；以未經(jīng)任何藥物處理的TE-1、Eca-109、KYSE-150 細(xì)胞作為空白對(duì)照組（Ajugo 0 μM）：以體積分?jǐn)?shù)為0.6% DMSO 處理TE-1、Eca-109、KYSE-150細(xì)胞作為對(duì)照組，每組均設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。將孔板放入培養(yǎng)箱內(nèi)藥物作用48 h 后取出，在每孔內(nèi)加入CCK-8 溶液10 μL，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)1 h。取出孔板，使用酶標(biāo)儀測定各孔吸光度OD 值，波長選擇490 nm。用相關(guān)軟件計(jì)算細(xì)胞生長的存活率：細(xì)胞存活率（%）=（試驗(yàn)組OD值-空白組OD 值）/（試照組OD 值-空白組OD 值）×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測Ajugol 對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。當(dāng)10 cm培養(yǎng)皿中的Eca-109 細(xì)胞生長融合度為80%時(shí)，收集并消化細(xì)胞，將大概1×106細(xì)胞接種到六孔板中，接種24 h后給予不同處理，試驗(yàn)組加入不同濃度的Ajugol（0、2、4、8 μM），以DMSO 為空白對(duì)照，處理結(jié)束后將6 孔板放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。48 h 后吸掉舊的培

養(yǎng)基，加入0.25%胰酶消化細(xì)胞，然后收集細(xì)胞懸液于離心管內(nèi)，1 000 rpm，5 min，去掉上清液，以PBS 液洗滌，再次離心，反復(fù)操作2 次。用PBS 輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取5 萬～10 萬重懸的細(xì)胞，1 000 rpm，5 min，棄掉上清液，加入195 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入5 μL Annexin V-FITC 輕輕混勻之后，再加入10 μL 碘化丙啶染色液，室溫（20℃～25℃）避光孵育10～20 min，隨后置于冰浴中，上機(jī)（BD FACScaliber）檢測。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測Ajugol 對(duì)細(xì)胞周期的影響。取對(duì)數(shù)生長期的Eca-109 細(xì)胞，將大概1×106細(xì)胞接種到六孔板中，接種24 h 后給予不同處理，實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的Ajugol（0、2、4 μM），以DMSO 為空白對(duì)照，將6 孔板放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，消化收集細(xì)胞于離心管中，低溫4℃，300 rpm 離心5 min，去上清液，加入2 mL PBS 重懸細(xì)胞，低溫4℃，300 rpm 離心5 min。細(xì)胞固定：去上清液，加入1 mL PBS 重懸細(xì)胞，移液器吹打均勻后，輕柔渦旋的同時(shí)緩慢加入3 mL 無水乙醇（預(yù)冷至-20℃），4℃固定2 h，離心10 min，棄去乙醇。加入5 mL PBS 洗滌細(xì)胞，低溫4℃，300 rpm 離心10 min，棄去上清液，殘留約50 μL 左右的PBS，加入0.5 mL RNaseA 溶液（PBS，200 μg/mL RNaseA）重懸細(xì)胞，在37℃放置5～10 min以去除RNA。加入0.5 mL PI 染色液（PBS，100 μg/mL PI），避光37℃孵育15 min，過濾后置冰上，避光，上機(jī)（BD FACScaliber）檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ajugol 抑制食管癌細(xì)胞的增殖

用不同濃度的Ajugol（0.39、1.56、6.25、25、100 μM）處理TE-1、KYSE-150、Eca-109 細(xì)胞48 h 后，采用CCK8 法檢測。結(jié)合表1、2 及圖1 可以看出：在體外試驗(yàn)中，Ajugol對(duì)3 種食管癌細(xì)胞均有抑制作用，當(dāng)藥物濃度從低濃度至高濃度，生存率呈降低趨勢，其抑制作用呈濃度依賴型。

圖1 不同濃度Ajugol 對(duì)食管癌細(xì)胞增殖作用的劑量-效應(yīng)曲線

表1 CCK-8 法檢測不同Ajugol 濃度作用于食管癌細(xì)胞的OD 值

2.2 Ajugol 對(duì)食管癌細(xì)胞凋亡具有促進(jìn)作用

不同濃度（0、2、4、8 μM）Ajugol 作用于Eca-109 細(xì)胞48 h 后，由圖2 可見細(xì)胞均有不同程度的凋亡，且隨著藥物的濃度從低到高細(xì)胞的凋亡率增加，表明細(xì)胞的凋亡率與藥物濃度成正相關(guān)。Eca-109 細(xì)胞各組的凋亡率分別為（3.82±1.31）%、（8.64±1.82）%、（24.28±4.35）%、（70.34±3.85）%，見圖2。

圖2 不同濃度Ajugol 對(duì)Eca-109 細(xì)胞凋亡率變化的影響

2.3 Ajugol 使食管癌細(xì)胞周期被阻滯在G2/M 期

不同濃度Ajugol（0、2 和4 μM）作用于食管癌細(xì)胞48 h 后，結(jié)果如圖3，F(xiàn)ACS 結(jié)果顯示細(xì)胞周期G1，S 期的細(xì)胞隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞數(shù)目出現(xiàn)減少的趨勢，即與藥物濃度呈負(fù)相關(guān)，而G2 期細(xì)胞隨著藥物濃度的升高，其細(xì)胞數(shù)目呈現(xiàn)增加的趨勢，表明細(xì)胞增殖周期被阻滯在G2/M 期。描述各細(xì)胞周期的具體比例變化如表3所示。

表3 Eca-109 細(xì)胞周期中各期所占比例 %

圖3 不同濃度Ajugol 對(duì)Eca-109 細(xì)胞周期的影響

表2 CCK-8 檢測不同濃度Ajugol 對(duì)食管癌細(xì)胞生存率的影響 %

3 討論

食管癌（EC）是癌癥發(fā)病率世界排名第7、致死率排名第6的一種消化道癌癥，由于飲食習(xí)慣、環(huán)境因素、應(yīng)激等因素，每年都有更多的人被診斷為食管癌[8]。該次研究發(fā)現(xiàn)Ajugol 在體外對(duì)食管癌細(xì)胞增殖抑制作用呈濃度依賴型。生物體內(nèi)各種細(xì)胞組織通過凋亡與增值來維持體內(nèi)的平衡，一旦平衡被打破就會(huì)導(dǎo)致身體出現(xiàn)很多疾病比如腫瘤癌癥等[9]，而抗腫瘤藥物可以使細(xì)胞出現(xiàn)程序性死亡從而達(dá)到治療腫瘤的效果[10]。該次研究證明Ajugol 作用于食管癌細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的凋亡且與藥物濃度成正相關(guān)，并讓癌細(xì)胞增殖周期被阻滯在G2/M 期。綜上所述，Ajugol 表現(xiàn)出較好的抗腫瘤細(xì)胞活性。

該次研究加強(qiáng)了人們對(duì)傳統(tǒng)中藥抗癌的認(rèn)識(shí)，如研究已發(fā)現(xiàn)地黃可以提高宮頸癌、乳腺癌患者免疫調(diào)節(jié)機(jī)制[11-12]，而地黃中可大量提取Ajugol，為地黃作為抗食管癌的新型藥物提供理論依據(jù)。后續(xù)研究可進(jìn)一步對(duì)Ajugol體內(nèi)抗癌活性及作用機(jī)制探索，并可結(jié)合臨床放射治療和化療技術(shù)，探討中西醫(yī)結(jié)合新療法，這將為天然植物來源的抗癌藥物研發(fā)提供新的方向。