黃 闊，葉長文*，李 棟，李青常，賀 琛，楊國濤，王 勇，龍 崗，丁 偉

1.中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號450001

2.西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，重慶市北碚區(qū)天生路2號400715

3.四川省煙草公司涼山州公司，四川省西昌市山岔東路478號615000

4.涼山州煙草公司會理分公司，四川省會理縣順城東路68號615100

煙草根結(jié)線蟲病是由根結(jié)線蟲侵染所引起的土傳病害［1］，在世界范圍內(nèi)發(fā)生范圍廣、危害重、防治難［2］，嚴(yán)重影響煙葉的品質(zhì)和質(zhì)量，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［3］。

目前生產(chǎn)上煙草根結(jié)線蟲病防治仍然以化學(xué)藥劑為主，常采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的阿維菌素、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的噻唑膦或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的丁硫·克百威等，于移栽期穴施或者生長期灌根?；瘜W(xué)藥劑防效雖好，但靶向性較差，易破壞煙田土壤生態(tài)平衡，還可能造成煙葉農(nóng)殘超標(biāo)，根結(jié)線蟲抗藥性增強(qiáng)。研究表明，枯草芽孢桿菌［4］、熒光假單胞桿菌［5］、淡紫擬青霉［6］、哈茨木霉［7］等微生物菌劑作為植物根際促生菌，能夠通過改變根際微生物群落結(jié)構(gòu)，促進(jìn)微生物對碳源的代謝能力，同時抑制病原菌繁殖，促進(jìn)植物生長，且對煙草根結(jié)線蟲病具有一定的防治效果［8-9］。然而，關(guān)于防治煙草根結(jié)線蟲病的藥劑處理對煙株根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響和優(yōu)勢菌群的變化情況鮮見報道。為此，本研究中采用16S rRNA高通量測序技術(shù)，分析了防治煙草根結(jié)線蟲病藥劑處理后煙株的根際細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢菌群的變化，旨在探究藥劑處理對根際細(xì)菌群落的穩(wěn)定性、優(yōu)勢菌群及差異菌群的影響，探明藥劑調(diào)控的關(guān)鍵生物因子，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有效防治煙草根結(jié)線蟲病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地情況

供試品種為紅花大金元，由四川省涼山彝族自治州會理縣益門煙葉工作站提供。

試驗地位于四川省涼山彝族自治州會理縣益門鎮(zhèn)大磨村2組試驗煙田，海拔2 110 m、經(jīng)度E102°16'56''、緯度N26°49'44''，地塊平整，試驗田連續(xù)3年發(fā)生根結(jié)線蟲病。

試驗地面積為0.2 hm2，土壤類型為紅壤。土壤基本理化性狀：pH 5.0、有機(jī)質(zhì)36.9 g/kg、全氮1.99 g/kg、全磷1.27 g/kg、全鉀15.9 g/kg、堿解氮176 mg/kg、有效磷26 mg/kg、速效鉀400 mg/kg。

1.2 試驗設(shè)計

試驗地于2018年4月18日開始移栽，移栽當(dāng)天進(jìn)行施藥處理。

試驗設(shè)7個處理，每處理3次重復(fù)，共21個小區(qū)，每小區(qū)面積為72 m2（約120株煙），兩邊設(shè)置保護(hù)行。本試驗中各供試藥劑的畝（667 m2）用量，是在綜合考慮藥劑推薦用量、活孢子濃度、有效成分含量等因素后確定的。藥劑在移栽時拌土穴施或兌水灌根（見表1）。

表1 各處理編號及處理措施Tab.1 Numbers and measures of treatments

1.3 樣品采集

于煙草成熟期（移栽后120 d），采集試驗小區(qū)的各處理根際土壤樣品。采用五點(diǎn)取樣法，每個處理小區(qū)隨機(jī)選擇5株煙草，挖出完整的根系，輕輕抖去表層土后用細(xì)毛刷輕掃附著在根上的土壤，樣品分別標(biāo)記為HL1、HL2、HL3、HL4、HL5、HL6、HL7。將土壤過2 mm網(wǎng)篩以除去雜物，裝入1 000 mL無菌塑料袋中，一式3份手動混合均勻，24 h內(nèi)完成運(yùn)輸，并保存于西南大學(xué)微生態(tài)過程與調(diào)控實驗室2~4℃冰箱中。

1.4 DNA提取、PCR擴(kuò)增和測序

對于每個土壤樣品，使用FastDNA?SPIN土壤試劑盒（美國MP Biomedicals公司）從0.5 g土壤中提取總DNA。使用ThermoFisher Scientific（美國Multiskan GO公司）酶標(biāo)儀測量基因組DNA濃度和純度。上游引物515F：5’-GTGCCAGCMGCC GCGGTAA-3’，下游引物806R：5’-GGACTACHVG GGTWTCTAAT-3’；PCR的反應(yīng)總體積為20 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，循環(huán)27次；72℃延伸10 min。使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測PCR產(chǎn)物。標(biāo)記PCR產(chǎn)物并委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行IlluminaMiSeq測序［10］。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用QIIME v1.7.0對原始Illuminafastq數(shù)據(jù)文件進(jìn)行解復(fù)用、質(zhì)量過濾和分析。操作分類單元OTU（Operational taxonomic unit）選擇具有97%成對同一性的閾值。豐度比較時，使用基于分類法的OTU并通過Origin 9.0軟件進(jìn)行直方圖分析。

t檢驗（P＜0.05）分析樣本中的差異物種，找到顯著的微生物類群（相對豐度＞1%）。線性判別分析LDA（Linear discriminant analysis）效應(yīng)大小LEfSe（Linear discriminant analysis effect size）采用Kruskal-Wallis秩和檢驗（α=0.05）來識別類別之間具有顯著差異豐度的分類群，然后使用LDA值估計每個差異豐富特征的效應(yīng)大?。↙DA＞2.0）。

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素ANOVA方差分析（Analysis of Variance）以及Duncan顯著性檢驗（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 α多樣性分析

通過對各處理進(jìn)行OTUs（97%）、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)、Coverage指數(shù)的分析（表2），熒光假單胞桿菌（HL4）與阿維·丁硫（HL6）處理后，OTU數(shù)量、物種豐富度、多樣性之間均有顯著性差異。7個處理的Coverage指數(shù)（物種覆蓋度）無差異。

表2 不同土壤樣本的細(xì)菌α多樣性分析Tab.2 Analysis of bacterial alpha diversity for different soil samples

2.2 物種組成

2.2.1 不同分類水平細(xì)菌群落數(shù)量分布

在所有樣本中被檢出的4 325個細(xì)菌OTU中，分別被分到36個門、89個綱、194個目、371個科、686個屬、1 329個種。

從各分類水平的細(xì)菌群落數(shù)量來看（表3），淡紫擬青霉（HL3）處理后細(xì)菌群落的多樣性更加豐富，阿維·丁硫（HL6）處理后細(xì)菌群落的多樣性降低。各處理間的物種OTU數(shù)量無明顯變化規(guī)律。

表3 各處理不同分類水平細(xì)菌群落數(shù)量Tab.3 Number of bacterial communities at different classification levels in each treatment （個）

2.2.2 門水平群落組成

在門水平上，各處理中平均相對豐度≥1%的細(xì)菌類群共有9個（圖1）。所有土壤樣品中的主要細(xì)菌門是變形菌門（Proteobacteria），其次是放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteria），它們在各樣本中的平均相對豐度分別為35.13%、23.12%、13.84%、8.97%，在各樣本中共占總豐度約74%（圖1）。

圖1 細(xì)菌群落組成（門水平）Fig.1 Bacterial community composition（at phylum level）

2.2.3 屬水平群落組成

在屬水平上，各處理中平均相對豐度≥1%且為已知物種的共有14個（圖2）。鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）在各處理中所占比例最高，其平均相對豐度為5.67%。通過Silva數(shù)據(jù)庫（http：//www.arb-silva.de）對比，在已知的屬水平上，所占比例依次為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas，3.62%~6.81%）、芽 單 胞 菌 屬（Gemmatimonas，2.58%~4.01%）、Pseudarthrobacter（1.53%~9.58%）、Bryobacter（1.44%~3.21%）、根瘤菌屬（Bradyrhizobium，1.60%~2.63%）、Pseudolabrys（1.36%~1.85%）、鏈霉菌屬（Streptomyces，1.52%~2.13%）、Variibacter（1.48%~1.74%）、馬 賽 菌 屬（Massilla，1.60%~1.68%）、Acidibacter（0.51%~1.47%）、芽生球菌屬（Blastococcus，0.62%~1.12%）、克 洛 斯 氏 菌 屬（Crossiella，0.45%~1.19%）、粘液桿菌屬（Mucilaginibacter，0.17%~1.22%）、Chryseolinea（0.16%~1.31%）。

圖2 細(xì)菌群落組成（屬水平）Fig.2 Bacterial community composition（at genus level）

2.3 β多樣性分析

β多樣性分析可以用來比較各處理之間微生物群落構(gòu)成，用于確定各處理間的群落差異關(guān)系。在OTU水平，對各樣本進(jìn)行層級聚類分析，和對照相比，不同處理之間的距離較遠(yuǎn)，重復(fù)之間距離相近（圖3），可以進(jìn)一步分析不同群落之間的細(xì)菌群落差異。

圖3 各樣本層級聚類分析（OTU水平）Fig.3 Hierarchical cluster analysis of samples（at OTU level）

在OTU水平上將7個處理進(jìn)行PCoA分析（圖4），不同顏色代表不同處理條件下的樣本組，圖中的箱線圖代表不同組樣本在PC1軸上的分布離散情況。其中淡紫擬青霉（HL3）處理較其他處理離散距離最遠(yuǎn)，分布情況最為明顯。表明淡紫擬青霉處理相較于其他處理的細(xì)菌群落差異性更大。

圖4 OTU水平上各樣本PCoA分析Fig.4 PCoA analysis at OTU level for each sample

2.4 差異性分析

使用LEfSe分析檢測具有顯著豐度差異的類群，并采用線性判別分析（LDA）來估算每個組分（物種）相對豐度對差異效果影響的大小。在能夠檢測到的屬水平上（排除Norank和Unclassified的類群）各樣本之間LDA值＞2.0的細(xì)菌類群中，HL1有9個，HL2有8個，HL3有37個，HL4有9個，HL5有9個，HL6有10個，HL7有10個。各處理LDA值前3名的類群見表4。

表4 不同處理土壤樣本在屬水平上LDA值排序前3位的物種Tab.4 Top three species in LDA value at genus level for soil samples under different treatments

組間差異顯著性檢驗結(jié)果表明，在屬水平上（排除Norank和Unclassified的類群），豐度在前10的物種類別及其分別在各樣本中的相對豐度見圖5，分別為：鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、假節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter）、Bryobacter、慢 生 根 瘤 菌 屬（Bradyrhizobium）、Pseudolabrys、鏈霉菌屬（Streptomyces）、Variibacter、馬賽菌屬（Massilia）、芽生球菌屬（Blastococcus）。

圖5 表明，假節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、馬賽菌屬（Massilia）、芽生球菌屬（Blastococcus）4個屬在各樣本中具有顯著性差異。在各處理中的相對豐度分別如圖6所示。假節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter）、馬賽菌屬（Massilia）在阿維·丁硫處理（HL6）時相對豐度最高，鏈霉菌屬（Streptomyces）、芽生球菌屬（Blastococcus）在哈茨木霉處理（HL5）時相對豐度最高。

圖5 屬水平上各樣本的組間差異顯著性檢驗Fig.5 Significance test of differences between groups of each sample at genus level

圖6 4個屬在各處理中的豐度差異Fig.6 Abundance differences of four genera under each treatment

3 討論

已有研究表明，土壤中添加化學(xué)藥劑后細(xì)菌群落的物種豐富度和多樣性均顯著下降，且在一定時期內(nèi)波動幅度較大，細(xì)菌群落穩(wěn)定性降低［11-13］。張保國等［14］和趙靜等［15］研究表明，化學(xué)藥劑能夠明顯改變微生物的群落結(jié)構(gòu)和組成，減少微生物的生物量，這與本研究中所發(fā)現(xiàn)的化學(xué)藥劑阿維·丁硫處理煙草根部，根際土壤中細(xì)菌群落的物種數(shù)量、豐富度和多樣性明顯降低的結(jié)果一致。此外，本研究中發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌和熒光假單胞桿菌處理后細(xì)菌群落的物種豐富度和多樣性顯著提升，且淡紫擬青霉處理也能夠提高物種多樣性。據(jù)報道，枯草芽孢桿菌可以提高土壤細(xì)菌群落的物種多樣性和豐富度指數(shù)，提高群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性［16-17］；熒光假單胞桿菌能夠提高土壤微生物功能多樣性［18-20］；淡紫擬青霉也能夠提高根際土壤中細(xì)菌群落的物種多樣性［10，21］，且肖順等［22］、劉曉莉［23］、喬月靜［24］均研究表明淡紫擬青霉處理能夠提高根際土壤中真菌和細(xì)菌群落的物種多樣性，使得細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。上述報道均與本研究結(jié)果一致。

對優(yōu)勢細(xì)菌類群進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，各處理間優(yōu)勢物種的相對豐度差異不大。在門水平，變形菌門（Proteobacteria）是所有土壤樣品中的主要細(xì)菌門，其次是放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteria）。付琳等［25］發(fā)現(xiàn)根際土壤中優(yōu)勢菌群為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）；趙帆等［26］發(fā)現(xiàn)根際土壤中優(yōu)勢菌種也包含變形菌門（Proteobacteria），放線菌門（Actinobacteria）。以上研究中部分優(yōu)勢菌群與本研究結(jié)果一致。本研究中在屬水平的分析結(jié)果表明，鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和芽單胞菌屬（Gemmatimonas）是優(yōu)勢菌屬。這與姚城城等［27］發(fā)現(xiàn)果園土壤微生物群落的組成中芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、類似牙球菌屬（Blastocatella）是優(yōu)勢菌屬的結(jié)論基本一致，表明根際土壤中鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和芽單胞菌屬（Gemmatimonas）是其優(yōu)勢菌屬。

不同藥劑處理會對根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響［28-29］。本研究結(jié)果表明，田間藥劑處理煙草根結(jié)線蟲病后，假節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter）、馬賽菌屬（Massilia）、鏈霉菌屬（Streptomyces）和芽生球菌屬（Blastococcus）在各處理中的相對豐度多組比較具有顯著性差異。其中假節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter）、馬賽菌屬（Massilia）在阿維·丁硫處理后相對豐度最高，鏈霉菌屬（Streptomyces）、芽生球菌屬（Blastococcus）在哈茨木霉處理后相對豐度最高。李苗等［30］、李娟等［31］、楊恩東等［32］對假節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter）和馬賽菌屬（Massilia）進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其與土壤性質(zhì)密切相關(guān)。鏈霉菌屬（Streptomyces）作為產(chǎn)生抗生素等生物活性物質(zhì)種類最多的一類微生物［33-34］，芽生球菌屬（Blastococcus）作為稀有放線菌屬［35-36］，它們在抗逆機(jī)制研究、環(huán)境修復(fù)治理等方面均表現(xiàn)出潛在優(yōu)勢。以上研究表明，本研究中發(fā)現(xiàn)的4種差異菌屬在土傳病害防控和土壤修復(fù)調(diào)控過程中均有潛在價值。

4 結(jié)論

藥劑處理后根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化較大，化學(xué)藥劑能夠降低細(xì)菌群落穩(wěn)定性，生防菌劑能夠提高細(xì)菌群落的物種豐富度和多樣性，其中枯草芽孢桿菌、熒光假單胞桿菌、淡紫擬青霉對根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的促進(jìn)效果最為明顯。各藥劑處理對根際土壤細(xì)菌組成中優(yōu)勢物種的影響不大，優(yōu)勢菌門主要是變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteria），平均相對豐度分別為35.13%、23.12%、13.84%、8.97%。優(yōu)勢菌屬主要是鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和芽單胞菌屬（Gemmatimonas），平均相對豐度分別為5.67%和3.29%。各藥劑處理后根際土壤中假節(jié)桿菌屬（Pseudarthrobacter）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、馬賽菌屬（Massilia）、芽生球菌屬（Blastococcus）的相對豐度都存在顯著性差異。