劉 暢，姚晨虓，李小杰，李成軍，劉東升，陸施羽，李淑君*

1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，河南省許昌市魏都區(qū)青梅路永昌路交叉口461000

2.河南科技大學(xué)林學(xué)院，河南省洛陽市洛龍區(qū)開元大道263號471003

20世紀(jì)90年代 至21世 紀(jì)10年代，煙草黑 脛病、根黑腐病、立枯病和青枯病均為煙草生產(chǎn)上的主要根莖類病害［1-2］，鐮刀菌根腐病發(fā)生面積大，對煙草造成的產(chǎn)值損失較高，是一種具有潛在危害性的根部病害［3-6］。因此對煙田煙草黑脛病和鐮刀菌根腐病等根莖類病害的防治非常重要。除常規(guī)化學(xué)防治以外，生物防治因其安全性高是目前煙草病害防治上的研究熱點(diǎn)之一［7-9］。隨著生物技術(shù)的深入研究和不斷發(fā)展，生防微生物的研究已取得較大進(jìn)展［10］。然而在生物防治中，利用單一生防菌防治植物病害的報(bào)道很多，但是單一生防菌株的防病機(jī)制簡單，在環(huán)境中容易受到各種因素的影響，且其定殖能力差，適應(yīng)環(huán)境能力弱，難以發(fā)揮較大的作用，防治效果不理想［11］。而通過多種生防菌結(jié)合復(fù)配，不同菌株間可形成優(yōu)勢互補(bǔ)，進(jìn)而提高防治效果和穩(wěn)定性［12］。

隨著微生物純培養(yǎng)技術(shù)的逐步完善，以及微生物共生與互生機(jī)理研究的不斷深入，生防微生物制劑間的復(fù)配應(yīng)用也日益被關(guān)注和重視［13］。藍(lán)星杰等［14］復(fù)配的生防菌劑對西瓜枯萎病的盆栽防效達(dá)89.47%；許艷麗等［15］將多株生防木霉、毛殼霉與生防細(xì)菌進(jìn)行復(fù)配，通過菌株的生理特性及培養(yǎng)皿拮抗能力進(jìn)行適配，獲得有兩株木霉菌復(fù)配的C1組合，對大豆根腐病具有較好的防治效果，且對大豆有一定的促生作用；金雪菲［16］將5株生防菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，制成固態(tài)菌粉后將其進(jìn)行復(fù)配，盆栽試驗(yàn)中C4組合+多菌靈處理的綜合防治效果最好，對西瓜枯萎病、棉花枯萎病和茄子黃萎病的防效分別達(dá)到59.91%、71.31%和58.21%；張良等［17］試驗(yàn)表明，長柄木霉和涇陽鏈霉菌2菌株復(fù)配后在防治煙草黑脛病方面發(fā)揮了協(xié)同增效作用，防治效果達(dá)到69.3%，在促生效果上也表現(xiàn)出協(xié)同增效作用；李苗苗等［4］對3個生防菌劑進(jìn)行復(fù)配，復(fù)配后的菌劑盆栽防效顯著高于菌劑單獨(dú)處理。煙草根莖類病害生防菌的篩選、鑒定以及防效試驗(yàn)已有較多報(bào)道［18-22］。但前人研究多為單一生防菌劑的防效驗(yàn)證，且大田防效驗(yàn)證較少。為此，將實(shí)驗(yàn)室前期篩選出對煙草黑脛病和鐮刀菌根腐病病原菌具有較好拮抗效果的菌株復(fù)配，并進(jìn)行了復(fù)配菌劑的大田防效驗(yàn)證，旨在為復(fù)配生防菌劑防治煙田根莖類病害提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

復(fù)合生防菌劑A：由假單胞桿菌（Pseudomonas）和綠色木霉（Trichoderma viride）發(fā)酵液按體積比1∶1復(fù)配而成，其中假單胞桿菌發(fā)酵液活菌量為1.0×1010cfu/mL，綠色木霉發(fā)酵液孢子量為5.0×108個/mL。復(fù)合生防菌劑B：由芽胞桿菌（Bacillus）和哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）發(fā)酵液體積比1∶1復(fù)配而成，其中芽胞桿菌發(fā)酵液活菌量為1.0×108cfu/mL，哈茨木霉發(fā)酵液孢子量為4.0×106個/mL。所用菌株均為本實(shí)驗(yàn)室自主篩選并發(fā)酵制備的。

1.2 試驗(yàn)地基本情況

試驗(yàn)于2020年4月至9月在河南省許昌市襄城縣庫莊鎮(zhèn)黃莊村煙田進(jìn)行，土壤為壤土，肥力中等。供試品種中煙100，移栽期為4月29日，地膜覆蓋，按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行栽培管理。試驗(yàn)地前茬作物為煙草，連作煙田多發(fā)煙草黑脛病和煙草鐮刀菌根腐病。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)置3個處理，每個處理3次重復(fù)，共0.335 hm2。煙株行距1.1 m，株距0.55 m。常規(guī)施肥m（N）∶m（P）∶m（K）=1.0∶1.2∶3.0，有機(jī)肥和磷肥全部作為基肥施用，鉀肥基肥施用70%，追肥施用30%。處理A分別在移栽期和團(tuán)棵期灌根施用復(fù)合生防菌劑A，用量0.027 L/hm2，灌根前復(fù)合生防菌劑兌水量100 L/hm2攪勻；處理B分別在移栽期和團(tuán)棵期灌根施用復(fù)合生防菌劑B，用量1.34 L/hm2，灌根前復(fù)合生防菌劑兌水量100 L/hm2攪勻；處理C為清水對照（CK）。試驗(yàn)中的3個處理均不施用化學(xué)藥劑。

1.4 測定方法

1.4.1 煙株農(nóng)藝性狀

于煙株打頂后10 d，各處理隨機(jī)選擇長勢均勻的10株測定煙株的農(nóng)藝性狀指標(biāo)［23］。包括株高、莖圍、有效葉片數(shù)、最大葉長和最大葉寬，并計(jì)算葉面積。

1.4.2 煙株根系性狀

于煙株旺長期、現(xiàn)蕾期和打頂后10 d分別取樣，測定煙株根系生長發(fā)育指標(biāo)。包括根系鮮質(zhì)量、地上部鮮質(zhì)量、最大根長、側(cè)根數(shù)和根體積。選擇晴天進(jìn)行測定，每個處理隨機(jī)選擇長勢均勻的煙株3株，1 d內(nèi)完成取樣。取樣時間的確定以試驗(yàn)田中50%以上煙株長勢達(dá)到旺長、現(xiàn)蕾和打頂?shù)壬谝鬄闇?zhǔn)；各小區(qū)每次取樣時選取可代表該小區(qū)平均長勢的煙株3株，帶土挖出整個根系；將根系用水浸泡至土壤疏松時沖洗干凈，先用排水法測量根系體積，然后稱量根系鮮質(zhì)量。于105℃條件下殺青30 min，60℃烘干至恒質(zhì)量，稱取根系的干質(zhì)量，計(jì)數(shù)側(cè)根數(shù)量和須根數(shù)量。

1.4.3 煙株發(fā)病情況調(diào)查

結(jié)合當(dāng)?shù)責(zé)熖锏牟『Πl(fā)生特點(diǎn)，主要對煙草黑脛病和鐮刀菌根腐病進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)查，每個小區(qū)調(diào)查發(fā)病株數(shù)及發(fā)病級數(shù)［24］，并計(jì)算發(fā)病率，從煙田病害發(fā)病初期開始調(diào)查，每隔7～10 d調(diào)查1次，連續(xù)調(diào)查6次。

1.4.4 化學(xué)成分

中部煙葉采收編桿時，每個處理掛吊牌標(biāo)記10桿煙葉，煙葉烘烤結(jié)束，從標(biāo)記的10桿煙葉中選取C3F煙葉樣品，每個處理取樣1 kg。由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草所質(zhì)量檢測中心用流動分析儀測定煙葉常規(guī)化學(xué)成分含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010、STST方差分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合生防菌劑對煙株農(nóng)藝性狀的影響

從表1可知，處理A和B的株高，莖圍，最大葉葉長、葉寬和葉面積與CK相比差異均達(dá)到顯著水平。A和B處理間差異不顯著，說明復(fù)合生防菌劑A和復(fù)合生防菌劑B均可增加煙株株高、莖圍和最大葉面積，促進(jìn)煙株地上部生長發(fā)育。

表1 不同處理打頂后10 d煙株農(nóng)藝性狀指標(biāo)比較①Tab.1 Agronomic traits of tobacco plants on the 10th day after topping

2.2 復(fù)合生防菌劑對煙株根系性狀的影響

由表2、表3和表4可以看出，團(tuán)棵期A、B處理的煙株根系鮮質(zhì)量、根體積、側(cè)根數(shù)和須根數(shù)均高于CK，且處理A和CK間差異顯著。但現(xiàn)蕾期和打頂后10 d時A和B處理的地上部鮮質(zhì)量、側(cè)根數(shù)和須根數(shù)與CK間的差異均不顯著。說明施用復(fù)合生防菌劑A在團(tuán)棵期可促進(jìn)煙株根系生長發(fā)育，根系鮮質(zhì)量、根體積、側(cè)根數(shù)和須根數(shù)均增加。

表2 不同處理團(tuán)棵期煙株根系性狀指標(biāo)的比較Tab.2 Root trait indexes of tobacco plants at rosette stage under different treatments

2.3 復(fù)合生防菌劑對根莖類病害發(fā)生的影響

病害調(diào)查結(jié)果（表5）表明，復(fù)合生防菌劑A和B處理的煙株發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著低于CK。復(fù)合生防菌劑A和B處理間差異也達(dá)到極顯著水平。在根莖類病害發(fā)生初期，復(fù)合生防菌劑A處理能夠有效防控黑脛病的發(fā)生，防效達(dá)65%以上，復(fù)合生防菌劑B防效也達(dá)到49%，根莖類病害發(fā)病中后期，復(fù)合生防菌劑A和B處理的防效均有所下降，后期基本趨于穩(wěn)定，復(fù)合生防菌劑A和B處理的防效分別達(dá)到48.46%和34.71%。說明復(fù)合生防菌劑處理對煙草黑脛病的發(fā)生具有一定的防控效果，且復(fù)合生防菌劑A的防效優(yōu)于B。

表5 不同時期根莖類病害的發(fā)病情況Tab.5 Incidences of rhizomatic diseases at different stages

2.4 復(fù)合生防菌劑對煙葉化學(xué)成分的影響

由表6可見，復(fù)合生防菌劑A和B處理煙葉總糖、還原糖含量均高于CK，復(fù)合生防菌劑A和B處理煙葉煙堿較CK均有所降低。復(fù)合生防菌劑A和B處理煙葉鉀、氯含量均高于CK。復(fù)合生防菌劑A和B處理糖堿比、氮堿比、鉀氯比均高于CK。說明施用復(fù)合生防菌劑A和B的煙葉化學(xué)成分含量適宜，比例更趨協(xié)調(diào)。

表6 不同處理煙葉化學(xué)成分含量的比較Tab.6 Contents of chemical components in tobacco leaves under different treatments

3 討論

假單胞桿菌在植物根部定殖，產(chǎn)生的植物保護(hù)素等物質(zhì)可提高植物體的抗性［25-27］，也可利用難溶性磷酸鹽，提高植物對肥料的利用率，促進(jìn)植物根系生長發(fā)育［28-29］。芽胞桿菌可以通過生物固氮、促進(jìn)植物對營養(yǎng)元素的吸收、合成分泌植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、釋放揮發(fā)性物質(zhì)等方式促進(jìn)植物生長［30-31］。而經(jīng)過綠色木霉處理的植物可以提高體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性［32］，也可以提高植物葉片葉綠素、類胡蘿卜素和總色素含量［33］。這些物質(zhì)含量的多少和植物生長發(fā)育的好壞呈正相關(guān)性。本研究中假單胞桿菌和綠色木霉復(fù)配、芽胞桿菌與哈茨木霉復(fù)配均能改善煙田農(nóng)藝性狀，促進(jìn)煙株根系生長。說明假單胞桿菌和綠色木霉復(fù)配、芽胞桿菌和哈茨木霉復(fù)配保留了單個菌株的促生效果，在防病的同時可以促進(jìn)煙株生長。

本研究中煙田兩個復(fù)配菌劑灌根時間為移栽期和團(tuán)棵期，且共灌根兩次，防效均呈現(xiàn)出前期高后期低，中間出現(xiàn)防效下降的現(xiàn)象，這可能是因?yàn)闊煵輬F(tuán)棵期一般是煙田根莖類病害初發(fā)階段，本研究中復(fù)配菌劑灌根剛結(jié)束，煙根及土壤中生防菌活菌數(shù)高，病原菌活菌量低，對病原的拮抗作用高，所以防效相對較強(qiáng)；后期煙株現(xiàn)蕾，根莖類病害發(fā)生量處于上升期，此時距離復(fù)配菌劑灌根時間已過半月之久，且夏季高溫條件對未定殖成功的生防菌產(chǎn)生影響，導(dǎo)致防效相對降低，成熟期及打頂后防效低亦是同樣的道理。另外本研究中兩個復(fù)配菌劑中單一菌株的防病效果較好，但復(fù)配后在大田發(fā)病穩(wěn)定后防效卻不高，已有研究發(fā)現(xiàn)［12，34-35］，復(fù)配生防菌劑的防病機(jī)制復(fù)雜，不是簡單的疊加累積效應(yīng)。兩株防病作用的較強(qiáng)的菌株復(fù)配后其防病效果不一定更強(qiáng)。因此如何提高兩株防病作用強(qiáng)的生防菌株復(fù)配后的防病效果尚需深入研究。另外在不同生防菌劑間的配制、同一配制方法不同的配比以及復(fù)合菌劑灌根量、灌根時機(jī)對煙田根莖類病害的影響方面還有待進(jìn)一步試驗(yàn)。

施用兩種復(fù)合生防菌劑后煙株農(nóng)藝性狀得到改善，煙株抗病性增強(qiáng)。煙葉煙堿含量降低，還原糖、總糖和K2O含量增加，并且提高了煙葉糖堿比，鉀氯比。這與陳玉國等［36］的研究結(jié)果一致。施用菌肥或生防菌劑改善了煙葉內(nèi)在化學(xué)成分，可能是因?yàn)榫屎蜕谰鷦┑氖┤胩岣吡藷熤甑目共⌒?，煙株長勢良好，煙葉成熟度高且成熟時期均勻一致，使煙葉內(nèi)在化學(xué)成分協(xié)調(diào)性得到改善。

4 結(jié)論

假單胞桿菌和綠色木霉復(fù)配能夠降低煙田根莖類病害發(fā)病率和病情指數(shù)，可以減緩病害的發(fā)生，減輕煙草根莖類病害的危害。假單胞桿菌和綠色木霉復(fù)配、芽胞桿菌與哈茨木霉復(fù)配均可改善煙株農(nóng)藝性狀，增加煙株根系鮮質(zhì)量、根體積、側(cè)根數(shù)和須根數(shù)；施用假單胞桿菌和綠色木霉復(fù)配、芽胞桿菌與哈茨木霉復(fù)配菌劑的煙株，煙葉化學(xué)成分含量適宜，比例更趨協(xié)調(diào)。