汪瑞敏，楊娜，李博巖，張清海，3，劉丹丹，孫大利*

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州貴陽550025；2.環(huán)境污染與疾病監(jiān)控省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（貴州醫(yī)科大學(xué)），貴州貴陽550025；3.貴州醫(yī)科大學(xué)貴州省食品質(zhì)量與安全科技服務(wù)平臺(tái)，貴州貴陽550025）

黃秋葵[Abelmoschus esculentus（Linn.）Moench]又名糊麻、秋葵、羊角豆、補(bǔ)腎菜，是一年生藥食兩用的蔬菜。原產(chǎn)于非洲，現(xiàn)已在世界不同國家/地區(qū)種植，主要分布在熱帶、亞熱帶等地區(qū)[1]。近年來，黃秋葵在中國很多省份也得到廣泛的種植，如江蘇、湖南、江西、廣東、貴州等。秋葵嫩果富含多糖、多酚、黃酮等生物活性物質(zhì)，具有廣泛的生理功能，如抗氧化、降血脂和降血糖等[2-3]。

黃秋葵既可以作為日常蔬菜直接食用，又可以作為新型食品和藥品開發(fā)的新資源。目前黃秋葵的產(chǎn)品形式有秋葵飲料、秋葵泡菜、秋葵茶、秋葵脆等。未來黃秋葵的發(fā)展方向是通過合適的加工方式提高黃秋葵活性成分的利用率。乳酸菌本身不僅具有清除自由基的能力，并且可以通過發(fā)酵提高發(fā)酵液的抗氧化能力。有研究報(bào)道，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵的藍(lán)莓[4]、卷心菜[5]等發(fā)酵液中總多酚含量和抗氧化活性顯著提高；同時(shí)，不同乳酸菌發(fā)酵桂圓肉，桂圓肉中酚類物質(zhì)的釋放和清除自由基的能力也隨發(fā)酵劑的不同發(fā)生顯著變化[6]。因此，本研究利用不同乳酸菌發(fā)酵黃秋葵汁液，以求篩選合適的發(fā)酵劑，增加黃秋葵發(fā)酵汁液中活性成分的含量。但是，即使一種食物中含有豐富活性成分也不能反映其在體內(nèi)生物利用度。通過人體實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究活性成分在機(jī)體消化和吸收過程中的變化存在一定困難，體外模擬消化具有操作簡單、試驗(yàn)條件易于控制、試驗(yàn)周期較短等優(yōu)點(diǎn)，是研究食物在人體消化過程中變化的重要途徑。目前，體外模擬消化已廣泛應(yīng)用于食品營養(yǎng)素消化率、生物利用度、結(jié)構(gòu)變化以及對(duì)某些植物化學(xué)物質(zhì)和抗氧化活性的影響[7]。

目前不同發(fā)酵劑發(fā)酵對(duì)黃秋葵活性成分的釋放和利用率變化的影響研究基本空白，本研究以新鮮黃秋葵為原料，以植物乳桿菌、干酪乳酸桿菌、鼠李糖乳桿菌、長雙歧桿菌為發(fā)酵劑，對(duì)不同乳酸菌發(fā)酵的黃秋葵進(jìn)行體外消化，并對(duì)含量變化及抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。為豐富黃秋葵的加工形式、提高黃秋葵活性成分的利用、明確消化過程中乳酸菌發(fā)酵對(duì)酚類物質(zhì)和抗氧化穩(wěn)定性的影響、篩選更為合適的發(fā)酵劑提供基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)和思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃秋葵：市售。碳酸鈉、苯酚、濃硫酸、葡萄糖、乙醇、氯化鉀、磷酸二氫鉀、硫氰化鉀、硫酸鈉、氯化鈉、碳酸氫鈉、尿素、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH）（98%）、2，2'-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）[2，2'-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） diammonium salt，ABTS]：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；沒食子酸、福林酚、α-淀粉酶（380 U/mg）、胰酶（250 U/mg）、胃蛋白酶（3 000 U/mg）、膽汁鹽：北京索萊寶科技有限公司。以上試劑均為分析純。菌種（植物乳桿菌、干酪乳酸桿菌、鼠李糖乳桿菌、長雙歧桿菌）：山東中科嘉億生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T6型新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（ZQWY-218N型）：上海知楚儀器有限公司；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；PL3002電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JYL-Y912破壁機(jī)：杭州九陽生活電器有限公司；ST16R冷凍離心機(jī)：美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 黃秋葵發(fā)酵液制備

將新鮮的黃秋葵去蒂洗凈，沸水中熱燙5 min，滅酶，切塊打漿后得到黃秋葵汁液，于90℃熱殺菌10min，然后水浴冷卻。將不同的乳酸菌按黃秋葵汁液質(zhì)量的5%進(jìn)行接種，置于37℃條件下培養(yǎng)24 h，得到黃秋葵發(fā)酵液，于-80℃冰箱下保存待測(cè)。

1.3.2 體外模擬消化試驗(yàn)

參考Wang等[8]、KOH等[9]的研究方法，略作修改。

口腔消化過程：用0.1mol/L的HCl將人造唾液培養(yǎng)基（290 mg α-淀粉酶，89.6 g/L KCl，175.3 g/L NaCl，88.8 g/L NaH2PO4，20.0 g/L KSCN，57.0 g/LNa2SO4，84.7 g/L NaHCO3，2.0 g/L尿素）的pH值調(diào)至6.8，備用。然后將20 mL發(fā)酵液樣品與6 mL人造唾液培養(yǎng)基混合均勻后放入含有40 mL蒸餾水的燒瓶中，并在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)5 min。然后將10 mL唾液培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到新的試管中并在沸水中保持5 min以停止反應(yīng)。冷卻后，將試管中培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至中性，然后在10 000×g、4℃下離心10 min。得到的上清液為口腔消化組樣品，之后進(jìn)行成分測(cè)定及活性檢測(cè)，所有試驗(yàn)平行測(cè)定3次。

模擬胃消化過程：用HCl（6 mol/L）將剩余培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至2.0，并加入溶解在0.1 mol/L HCl中的胃蛋白酶（15 mg）開始胃消化。然后將混合物在37℃下孵育2h。胃消化過程中，每隔30min取出10mL胃培養(yǎng)基，用NaOH（0.1 mol/L）將pH值調(diào)節(jié)至7.0以停止反應(yīng)。將取出的消化液在10 000×g、4℃下離心10 min，得到的上清液為胃消化樣品，之后進(jìn)行成分測(cè)定及活性檢測(cè)，所有試驗(yàn)平行測(cè)定3次。

模擬腸道消化過程：用NaHCO3（0.5 mol/L）將剩余胃培養(yǎng)基的pH值調(diào)節(jié)至6.5，并向溶液中加入5 mL胰酶（8 mg/mL）和膽汁鹽（50 mg/mL）的混合物。并在37℃下再孵育4h。腸道消化過程每隔60min取出10mL腸內(nèi)培養(yǎng)基。然后將取出的消化液在4℃、10 000×g條件下離心10 min，得到的上清液為腸道消化樣品，之后進(jìn)行成分測(cè)定及活性檢測(cè)，所有試驗(yàn)平行測(cè)定3次。

1.3.3 總多酚含量測(cè)定

參照Meda等[10]的方法并稍作修改。將1 mL樣品與5 mL 10%的福林酚試劑混合均勻，反應(yīng)6 min后，用4 mL 7.5%的碳酸鈉溶液中和。將上述混合物在室溫（25℃）、黑暗環(huán)境放置30 min，在765 nm處測(cè)定吸光度。對(duì)照組用蒸餾水代替樣品溶液和福林酚試劑，以沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算總多酚含量，線性回歸方程y=0.010 3x+0.003 7，R2=0.998 1。多酚含量以mg沒食子酸當(dāng)量（gallic acid equivalents，GAE）/100 g鮮重（fresh weight，F(xiàn)W），即 mg GAE/100 g FW 表示。

1.3.4 抗氧化能力測(cè)定

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

取1 mL樣品加入4 mL DPPH-乙醇（0.1 mmol/L）溶液，混合均勻并在室溫（25℃）下靜置20 min。以蒸餾水代替樣品作對(duì)照，并用蒸餾水作為空白調(diào)零[11]。在517 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算公式如下。

式中：A0為對(duì)照品吸光度；A1為樣品吸光度。

1.3.4.2 ABTS+自由基清除能力測(cè)定

參照Gowd等[12]方法，略作修改。將7.0 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液（1∶1，體積比）混合，并在室溫（25℃）下避光保存12 h～16 h以形成ABTS工作液。將新鮮制備的ABTS溶液在734 nm處的吸光度調(diào)為0.7±0.02。將1.3.2中制備的3種消化液、樣品和空白（甲醇）各0.5 mL加入ABTS工作液4.5 mL，并使用渦旋混合器充分混合，在黑暗中于25℃的水浴中孵育10 min。在734 nm波長處測(cè)定吸光度。ABTS+自由基清除率計(jì)算公式如下。

式中：A0為對(duì)照品吸光度；A1為樣品吸光度。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，使用Origin pro 2018C軟件繪圖，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，平均值的差異性采用單因素方差分析（one-way ANOVA）中的最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）進(jìn)行檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著。數(shù)值用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外模擬消化過程中總多酚含量變化規(guī)律

黃秋葵模擬體外消化過程中總多酚釋放量的變化見圖1。

圖1 黃秋葵模擬體外消化過程中多酚釋放量的變化Fig.1 Changes in total polyphenols of okra in vitro digestion

模擬體外消化前，由圖1可知，經(jīng)植物乳桿菌（70.74mg GAE/100gFW）和鼠李糖乳桿菌（64.45mg GAE/100 g FW）發(fā)酵以后的黃秋葵汁液總多酚含量比未發(fā)酵組（60.86 mg GAE/100 g FW）顯著升高（P＜0.05），分別提高了1.16倍和1.06倍。而經(jīng)干酪乳酸桿菌（60.07 mg GAE/100gFW）和長雙歧桿菌（58.42mg GAE/100 g FW）發(fā)酵的黃秋葵汁液中總多酚含量與未發(fā)酵組對(duì)比，并未發(fā)生顯著變化。有研究表明微生物可以產(chǎn)生果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶，這些酶可以有效地將不溶性的結(jié)合酚轉(zhuǎn)化為可溶性多酚[13]。

模擬口腔消化過程，發(fā)酵黃秋葵與未發(fā)酵組的多酚釋放量在消化5 min內(nèi)，有一定的提高，但差異均不顯著（P＞0.05）。模擬體外胃消化過程中，黃秋葵多酚釋放量在消化30min內(nèi)顯著升高，達(dá)到釋放最高點(diǎn)（P＜0.05），各乳酸菌發(fā)酵后的多酚釋放量分別為76.79、63.95、69.80、62.98mg GAE/100g FW，并在之后的胃消化過程中，多酚釋放量趨于穩(wěn)定（P＞0.05）；其中經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵的黃秋葵在胃消化的30min內(nèi)多酚釋放量最大，未發(fā)酵組多酚釋放量變化最顯著，由65.85mg GAE/100g FW降低至49.95 mg GAE/100 g FW，減少24.15%。在胃消化結(jié)束時(shí)，經(jīng)過不同乳酸菌發(fā)酵的多酚釋放量分別為64.53、59.66、59.27、56.41 mg GAE/100 g FW。

在體外模擬腸道消化過程中，未發(fā)酵的黃秋葵多酚釋放量從47.89mg GAE/100g顯著降低到40.28mg GAE/100 g FW（P＜0.05）。植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、長雙歧桿菌發(fā)酵的黃秋葵多酚釋放量經(jīng)過腸消化以后雖然也顯著降低，但是顯著高于未發(fā)酵組。在腸消化結(jié)束時(shí)，經(jīng)過不同乳酸菌發(fā)酵的多酚釋放量分別為46.42、40.36、44.22、49.20 mg GAE/100 g FW。由上述結(jié)果可知，模擬人體消化后植物乳桿菌發(fā)酵的消化液中多酚的損失量最低，為29.92%。

經(jīng)過模擬口腔消化，發(fā)現(xiàn)多酚釋放量小幅增加，可能是由于與多糖結(jié)合的酚類物質(zhì)在淀粉酶的作用下被釋放出來。模擬胃液消化后的多酚類物質(zhì)釋放量在前30 min達(dá)到最高值，后續(xù)明顯減少，表明模擬胃消化初期，強(qiáng)酸環(huán)境和胃蛋白酶的存在下，胃蛋白酶會(huì)分解蛋白質(zhì)，從而使一些與蛋白質(zhì)結(jié)合的多酚類物質(zhì)釋放出來，同時(shí)酸水解破壞酚類物質(zhì)與其它物質(zhì)之間的化學(xué)鍵，促進(jìn)多酚的釋放，隨著消化時(shí)間的延長，多酚長時(shí)間暴露在強(qiáng)酸環(huán)境造成多酚的降解，但是無明顯變化[14]。在模擬腸道消化過程中，多酚釋放量明顯減少，可能是多個(gè)酚羥基結(jié)構(gòu)的多酚在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定，易發(fā)生降解[15]。有研究表明，柑橘[16]、南酸棗[17]等食物中的酚物質(zhì)主要在模擬胃消化過程中釋放，大部分多酚在模擬胃液條件中穩(wěn)定存在，而在模擬腸液條件下發(fā)生降解，與本文研究結(jié)果一致。

2.2 體外模擬消化過程中抗氧化活性的變化規(guī)律

由于模擬體外消化過程對(duì)抗氧化成分的含量和結(jié)構(gòu)都產(chǎn)生很大的影響，所以研究消化過程抗氧化能力的變化也十分重要。本文采用DPPH、ABTS法測(cè)定乳酸菌發(fā)酵黃秋葵樣品在模擬人體消化過程中抗氧化能力的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果見圖2、圖3。

圖2 黃秋葵模擬胃腸消化過程中抗氧化活性（DPPH·）的變化Fig.2 Changes in antioxidant activity（DPPH·）of citrus okra in vitro digestion

模擬消化前，由圖2可知，0 min經(jīng)不同乳酸菌發(fā)酵以后的黃秋葵汁液對(duì)DPPH自由基清除率都顯著高于未發(fā)酵組樣品（P＜0.05）。消化前各乳酸菌發(fā)酵組DPPH自由基的清除率分別為61.06%、52.05%、55.17%、59.62%。黃秋葵發(fā)酵液對(duì)DPPH自由基清除率隨著消化過程中總多酚含量的變化而變化。在經(jīng)過體外模擬胃消化30 min時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)到最高；之后隨著消化時(shí)間的延長，總多酚的含量不斷降低，清除率也不斷降低。但是在消化結(jié)束時(shí)，植物乳桿菌（49.26%）和干酪乳酸桿菌（41.39%）發(fā)酵的樣品對(duì)DPPH自由基清除率顯著高于未發(fā)酵組（34.10%）（P＜0.05）。

圖3 黃秋葵模擬胃腸消化過程中抗氧化活性（ABTS+·）的變化Fig.3 Changes in antioxidant activity（ABTS+·）of citrus okra in vitro digestion

模擬消化前，由圖3可知，經(jīng)不同乳酸菌發(fā)酵后的黃秋葵汁液對(duì)ABTS+自由基清除率都顯著高于未發(fā)酵組樣品（P＜0.05）。消化前各乳酸菌發(fā)酵組的ABTS+自由基清除率分別為57.06%、47.32%、50.35%、55.26%。黃秋葵發(fā)酵液對(duì)ABTS+自由基清除率隨著消化過程中總多酚含量的變化而變化。在消化結(jié)束時(shí)，由植物乳桿菌（44.56%）發(fā)酵的樣品對(duì)ABTS+自由基清除率顯著高于未發(fā)酵組（29.14%）（P＜0.05）。由上述結(jié)果可知，在消化終點(diǎn)，植物乳桿菌發(fā)酵的黃秋葵消化液清除DPPH自由基、ABTS+自由基的能力是未發(fā)酵組的1.44、1.53倍。

結(jié)果表明發(fā)酵液的抗氧化能力與總多酚含量呈正相關(guān)。Bouayed等[18]和Jiao等[19]研究了蘋果和藍(lán)莓模擬胃腸道消化過程中多酚類和抗氧化活性的變化，同樣發(fā)現(xiàn)抗氧化能力與酚類化合物的含量成正比關(guān)系。發(fā)酵后抗氧化能力增強(qiáng)可能是乳酸菌發(fā)酵釋放具有抗氧化能力的酶或者促進(jìn)發(fā)酵樣品中結(jié)合態(tài)的活性成分釋放，還有可能是由于乳酸菌本身具有的抗氧化能力。

3 結(jié)論

通過對(duì)比不同乳酸菌發(fā)酵的黃秋葵樣品，在模擬體外消化過程中總多酚及抗氧化性的動(dòng)態(tài)變化，以求篩選合適的發(fā)酵劑，為豐富提高黃秋葵活性成分吸收的加工方式提供數(shù)據(jù)支撐。結(jié)果表明，經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵以后的黃秋葵汁液中總多酚含量是未發(fā)酵組的1.16倍。模擬人體消化后植物乳桿菌發(fā)酵的消化液中多酚的損失量最低，為29.92%。在消化終點(diǎn)，植物乳桿菌發(fā)酵的黃秋葵消化液清除DPPH自由基、ABTS+自由基的能力是未發(fā)酵組的1.44、1.53倍。綜上，植物乳桿菌發(fā)酵是提高黃秋葵中多酚含量和生物可及性的有效方式。