高維龍 梁貴友 郭 強(qiáng) 陳開遠(yuǎn) （貴州醫(yī)科大學(xué)，貴陽550025）

2018 年全球癌癥研究中心數(shù)據(jù)顯示，肺癌是當(dāng)前對(duì)人類健康和生命威脅最嚴(yán)重的腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率位居各類惡性腫瘤前列［1］。肺癌包括小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），NSCLC 是肺癌的主要類型，占肺癌總 數(shù) 的 85%［2-3］。 肺 腺 癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是最常見的侵襲性NSCLC，約占所有肺癌的40%，且常規(guī)治療手段目前效果欠佳［4-5］。隨著篩選方法進(jìn)步、體檢率上升及煙草使用減少，肺癌早期診斷率提高，且最近由肺癌導(dǎo)致的死亡率在男性和女性中分別下降48%和23%。但由于疾病進(jìn)展的隱匿性，仍有多數(shù)患者在診斷時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會(huì)，且對(duì)化療和放療效果反應(yīng)不佳，5 年生存率低至15%［6-7］。盡管靶向治療和新型免疫治療給NSCLC，尤其是LUAD 患者帶來了新的希望，但預(yù)后較差。目前缺乏針對(duì)NSCLC 患者不良預(yù)后和治療預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物。因此，急需尋找新型生物標(biāo)志物鑒定肺癌患者中預(yù)后不良的高?；颊?，以便早期診斷，強(qiáng)化治療方案以改善其預(yù)后。

新近發(fā)現(xiàn)的前列腺跨膜上皮抗原1（six-transmembrane epithelial antigen of prostate-1，STEAP1）是由6 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域組成的細(xì)胞表面生物分子，作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)而發(fā)揮重要作用［8-10］。此外，STEAP1 可調(diào)節(jié)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平刺激腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［11-12］。目前，STEAP1在腫瘤組織和非腫瘤組織中表現(xiàn)出極大的組織特異性，在前列腺癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、腎癌等組織中表達(dá)增高，但在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)降低［8，12-19］。研究表明，STEAP1 水平與腫瘤患者臨床病理特征及不良預(yù)后顯著相關(guān)［9，13-14，18-19］。說明STEAP1 可能參與腫瘤發(fā)生發(fā)展，STEAP1 可能是早期疾病診斷及腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物。

此外，腫瘤與免疫系統(tǒng)相互作用在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和治療中起重要作用。近年免疫治療被認(rèn)為是腫瘤治療的新希望，如細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA4）、程序性死亡-1（PD-1）和程序性死亡配體-1（PD-L1）抑制劑等在惡性黑色素瘤和NSCLC中顯示出良好的抗腫瘤作用。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAM）和腫瘤浸潤(rùn)性中性粒細(xì)胞（TINS）影響腫瘤化療和免疫治療預(yù)后及療效。因此，尋找新型免疫相關(guān)治療靶點(diǎn)以改善LUAD 患者預(yù)后尤為重要。但STEAP1 在LUAD 中的表達(dá)、臨床病理特征、預(yù)后及可能發(fā)病機(jī)制尚未明確。因此，本研究通過多種在線數(shù)據(jù)庫分析STEAP1 與LUAD 患者臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性，探究其潛在價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 Onconine 分 析 Oncomine（https：//www. oncomine. org/resource/login. htm）基因表達(dá)微陣列數(shù)據(jù)庫是一種可訪問的在線微陣列數(shù)據(jù)庫，用戶可了解全基因組表達(dá)相關(guān)研究［20］。Oncomine 可用于分析LUAD 中STEAP1 RNA 水平，篩選條件為P＜0.000 1；倍數(shù)變化=1.5；數(shù)據(jù)類型為mRNA；分析類型：癌組織vs正常組織。

1.2 UALCAN 分 析 UALCAN （http：//ualcan.path.uab.edu）是對(duì)TCGA 基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行深層次分析的公開數(shù)據(jù)庫［21］。本研究通過UALCAN 分析STEAP1 在 LUAD 和正常樣本的表達(dá)、與 LUAD 臨床病理學(xué)特征（癌癥階段、腫瘤分級(jí)、種族、體重或分期等）的相關(guān)性及潛在預(yù)后價(jià)值。

1.3 PrognoScan、Lung cancer explorer、Kaplan-Meier plotter 和GEPIA 數(shù)據(jù)庫 本研究通過PrognoScan（http：//www. abren. net/PrognoScan/）、Lung cancer explorer（http：//lce.biohpc.swmed.edu/）和Kaplan-Meier plotter（http：//kmplot. com/analysis/）在線數(shù)據(jù)庫分析STEAP1 表達(dá)與LUAD 患者預(yù)后的相關(guān)性［22-25］。 另 外 ，通 過 GEPIA（http：//gepia. cancerpku.cn/）分析鑒定數(shù)據(jù)庫中相關(guān)性較強(qiáng)的LUAD 浸潤(rùn)細(xì)胞免疫標(biāo)志物基因與STEAP1 表達(dá)的相關(guān)性。Spearman 法分析兩者相關(guān)性強(qiáng)弱。X 軸為STEAP1，其他Timer數(shù)據(jù)庫中顯著相關(guān)基因?yàn)閅軸。

1.4 Timer 數(shù) 據(jù) 庫 Timer（https：//cistrome. shinyapps. io/timer/）是一個(gè)系統(tǒng)分析多種腫瘤免疫浸潤(rùn)的數(shù)據(jù)庫［26］。免疫浸潤(rùn)細(xì)胞包括B 細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）等。通過基因表達(dá)模塊分析STEAP1 在不同類型癌癥中的表達(dá)及其表達(dá)水平與LUAD 免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的相關(guān)性。相關(guān)性分析評(píng)價(jià)STEAP1表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞免疫基因標(biāo)志物［B 細(xì)胞、M1 型巨噬細(xì)胞、M2 型巨噬細(xì)胞、DC、Th1 細(xì)胞、Th2 細(xì)胞、濾泡輔助T 細(xì)胞（Tfh）細(xì)胞、Th17 細(xì)胞］的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，GraphPad Prism5 軟件作圖。組間相關(guān)性采用相關(guān)性分析進(jìn)行檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 STEAP1在LUAD中表達(dá)升高 采用Oncomine數(shù)據(jù)庫比較NSCLC 組織和正常組織中STEAP1轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示，STEAP1 在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、乳腺癌、子宮頸癌、直腸癌、食管癌、胃癌、頭頸部癌癥、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤等腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，而在少數(shù)腫瘤，如膀胱癌、乳腺癌和肝癌中表達(dá)降低（圖1A）。采用Timer 數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分析STEAP1 在各種腫瘤中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)食管癌、胃癌、頭頸部癌癥、肺鱗癌、肺腺癌等癌癥中STEAP1 表達(dá)上調(diào)，而乳腺癌、膽管癌、腎細(xì)胞癌等腫瘤組織中STEAP1 表達(dá)降低（圖1B）。進(jìn)一步在Oncomine 數(shù)據(jù)庫中以P＜0.05，倍數(shù)變化1.5，數(shù)據(jù)類型mRNA 和類型為L(zhǎng)UAD vs 正常肺組織為篩選條件，發(fā)現(xiàn)有6 個(gè)數(shù)據(jù)集顯示STEAP1 在LUAD 組織中表達(dá)升高（圖2A）。多數(shù)據(jù)中心來源的Lung cancer explorer 數(shù)據(jù)庫中對(duì)STEAP1 表達(dá)水平進(jìn)行 Meta 分析發(fā)現(xiàn)，STEAP1 在LUAD 中表達(dá)升高（圖2B），提示高表達(dá)STEAP1 的患者預(yù)后不良。

圖1 STEAP1在人腫瘤組織中的表達(dá)Fig.1 STEAP1 expression in human tumor tissues

圖2 STEAP1在人LUAD中的表達(dá)Fig.2 STEAP1 expression in human LUAD

2.2 STEAP1 表達(dá)與LUAD 患者臨床病理特征相關(guān) 采用UALCAN 數(shù)據(jù)庫分析STEAP1 表達(dá)與LUAD 患者臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性以預(yù)測(cè)STEAP1 表達(dá)在LUAD 中的價(jià)值，結(jié)果顯示，STEAP1表達(dá)水平與患者吸煙、癌癥分期、組織亞型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，表明STEAP1表達(dá)水平與LUAD發(fā)生發(fā)展相關(guān)（表1）。

表1 STEAP1表達(dá)與LUAD患者臨床病理特征相關(guān)性分析Tab.1 Correlation analysis between STEAP1 expression and clinical pathology of LUAD patients

2.3 STEAP1 在LUAD 患者中的預(yù)后價(jià)值 采用PrognoScan、Lung Cancer Explorer、GEPIA 和 Kaplan-Meier Plotter 等數(shù)據(jù)庫評(píng)估STEAP1表達(dá)對(duì)LUAD 患者生存率的影響，發(fā)現(xiàn)STEAP1表達(dá)與LUAD患者預(yù)后相關(guān)。HARVARD-LC 數(shù)據(jù)集顯示，STEAP1 低表達(dá) LUAD 患 者 OS 較 好（HR=1.67，95%CI=1.22~2.27，COXP=0.001 314，圖3A）。Jacob-00182-MSK、GSE13213、GSE13213、Jacob-00182-UM 數(shù)據(jù)集均顯示，STEAP1 低表達(dá) LUAD 患者 OS 更好（HR=1.90，95%CI=1.23~2.94，COXP=0.003 880；HR=1.25，95%CI=1.03~1.51，COXP=0.021 018；HR=1.26，95%CI=1.04~1.54，COXP=0.020 190；HR=1.47，95%CI=1.14~1.90，COXP=0.002 949，圖 3B~E）。GSE31210 數(shù)據(jù)集顯示，STEAP1 低表達(dá) LUAD 患者具 有 較 好 的 RFS（HR=1.49，95%CI=1.15~1.94，COXP=0.002 737，圖3F）。采用TCGA、Lung cancer explorer和Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)STEAP1 的LUAD 患者比低表達(dá)STEAP1的患者預(yù)后更差（圖4、5）。表明STEAP1 表達(dá)可能是LUAD預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。

圖3 PrognoScan數(shù)據(jù)庫評(píng)估STEAP1表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性Fig.3 Relationship assessment between STEAP1 expres?sion and prognosis by PrognoScan database

圖4 Meta 分析評(píng)估 Lung cancer explorer 數(shù)據(jù)庫中STEAP1水平與預(yù)后的相關(guān)性Fig.4 Relationship assessment between STEAP1 level in Lung cancer explorer database and prognosis by Meta analysis

2.4 STEAP1表達(dá)與LUAD 患者預(yù)后相關(guān)臨床病理學(xué)特征分析 采用Kaplan-Meier 繪圖儀中研究STEAP1 表達(dá)與LUAD 患者預(yù)后相關(guān)臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，STEAP1 表達(dá)水平與LUAD 患者預(yù)后相關(guān)性別、吸煙、癌癥分期、AJCC 分期相關(guān)，即STEAP1 表達(dá)水平與LUAD 患者OS 相關(guān)男性患者、 2 級(jí)臨床分期、AJCC T1 分期、AJCC N0 分期和AJCC M0 分期相關(guān)，STEAP1 表達(dá)水平與 LUAD 患者RFS 相關(guān)女性和男性患者、非吸煙患者、AJCC T2 分期、AJCC N0分期和AJCC M0分期相關(guān)（表2）。

表2 STEAP1表達(dá)與LUAD患者預(yù)后相關(guān)臨床病理學(xué)特征相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis between STEAP1 expression and clinical pathology related to prognosis in LUAD patients

2.5 STEAP1表達(dá)水平與LUAD 免疫浸潤(rùn)細(xì)胞水平相關(guān) 為進(jìn)一步探究STEAP1 表達(dá)在腫瘤免疫浸潤(rùn)方面的價(jià)值，分析Timer 數(shù)據(jù)庫中STEAP1 表達(dá)水平與LUAD 浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞相關(guān)性，結(jié)果顯示，STEAP1表達(dá)水平與LUAD 免疫浸潤(rùn)細(xì)胞（腫瘤純度）、B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和 DC 顯著相關(guān)（P＜0.05，圖6）。為研究STEAP1 與LUAD 免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的相關(guān)性，課題組采用Timer 和GEPIA數(shù)據(jù)庫重點(diǎn)分析STEAP1 與LUAD 各種免疫細(xì)胞（CD8+T 細(xì)胞、T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、單核細(xì)胞、TAMs、M1、M2型巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞和DC等）免疫標(biāo)志物的相關(guān)性。Timer 數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示，STEAP1表達(dá)水平與LUAD 免疫浸潤(rùn)細(xì)胞（CD8+T 細(xì)胞、T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、單核細(xì)胞、TAM、M1、M2 型巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC、Th1、Th2、Tfh、Th17細(xì)胞、Treg 和衰竭T 細(xì)胞）免疫標(biāo)志物顯著相關(guān)，即LUAD中，STEAP1 表達(dá)水平與CD8A、CD8B、CD3D、CD3E、CD2、CD19、CD79A、CD86、CSF1R、CCL2、CD68、IL-10、IRF5、PTGS2、CD163、VSIG4、MS4A4A、CEACAM8、ITGAM、KIR2DL3、KIR2DL4 等免疫標(biāo)志物顯著相關(guān)。進(jìn)一步采用GEPIA 數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證STEAP1表達(dá)與LUAD 免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的相關(guān)性，結(jié)果顯示，STEAP1 表達(dá)與 LUAD 浸潤(rùn)細(xì)胞 CD8+T 細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞等顯著相關(guān)，即STEAP1 表達(dá)與LUAD 免疫標(biāo)志物CD8A、CD8B、CD3D、CD2、CD86、CSF1R、CCL2、CD68、IL-10、IRF5、CD163、VSIG4、MS4A4A、CEACAM8、ITGAM、KIR2DL4、TBX21、STAT1、IFNG、STAT6、BCL6、IL21、CCR8、STAT5B、PDCD1、LAG3、HAVCR2 和 GZMB 顯著相關(guān)（圖 7）。GEPIA 分析結(jié)果與Timer 數(shù)據(jù)庫結(jié)果一致（表3），表明STEAP1 在LUAD 免疫浸潤(rùn)細(xì)胞中具有重要調(diào)節(jié)作用，可能是腫瘤免疫逃逸過程中的重要一員。

表3 STEAP1表達(dá)與LUAD腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞免疫標(biāo)志物相關(guān)性分析Tab.3 Correlation between STEAP1 expression and im?mune markers of tumor infiltrating cells in LUAD

圖6 STEAP1表達(dá)與LUAD腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞相關(guān)性Fig.6 Correlation between STEAP1 expression and tumor infiltrating cells in LUAD

圖7 STEAP1表達(dá)水平與LUAD腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞免疫標(biāo)志物相關(guān)性分析Fig.7 Correlation analysis between STEAP1 expression and immune markers of tumor infiltrating cells in LUAD

3 討論

近年STEAP1 逐漸被人們熟知，在多種腫瘤中的表達(dá)及功能已有相繼報(bào)道，其中前列腺癌研究較多。多項(xiàng)研究表明，STEAP1 是前列腺癌的潛在生物標(biāo)志物和免疫治療靶點(diǎn)。STEAP1 在前列腺癌組織中表達(dá)增高，STEAP1 基因表達(dá)增高與前列腺癌患者高Gleason 評(píng)分、精囊侵襲、復(fù)發(fā)及預(yù)后不良顯著相關(guān)［8，13-14］。同時(shí)，敲低前列腺癌細(xì)胞中 STEAP1基因表達(dá)，可抑制癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡［8］。此外，STEAP1262-270肽可誘導(dǎo)具有活力和功能的抗原特異性CTL，有望成為晚期前列腺癌治療的新方法［27-28］。但STEAP1在LUAD 中的表達(dá)及其對(duì)LUAD患者的潛在作用和預(yù)后的影響鮮有報(bào)道。因此，本研究著重探討STEAP1 在LUAD 中的作用及潛在臨床價(jià)值。

本研究采用多數(shù)據(jù)庫分析RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)，探究STEAP1 在LUAD 中的潛在臨床價(jià)值，發(fā)現(xiàn)STEAP1在LUAD患者癌組織中表達(dá)增高，高表達(dá)STEAP1與LUAD 臨床病理特征（患者吸煙、癌癥分期、組織亞型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）和生存時(shí)間相關(guān)，且STEAP1 高表達(dá)患者多預(yù)后不良。Meta 分析進(jìn)一步證實(shí)其結(jié)果的可靠性，表明STEAP1有望成為L(zhǎng)UAD治療的新靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物。

此外，免疫浸潤(rùn)和腫瘤微環(huán)境對(duì)各種腫瘤發(fā)生發(fā)展起重要作用，腫瘤分子特征和免疫微環(huán)境的動(dòng)態(tài)相互作用可產(chǎn)生不同臨床結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者腫瘤組織中OPN 與PD-L1 表達(dá)和TAM 浸潤(rùn)呈正相關(guān)，OPN 可促進(jìn)巨噬細(xì)胞趨化作用和選擇性活化，并通過激活巨噬細(xì)胞中的CSF1-CSF1R 通路促進(jìn) HCC 中 PD-L1 表達(dá)，抗 PD-L1 和 CSF1R 抑制劑聯(lián)用可增強(qiáng)OPN 抗裸鼠成瘤能力，延長(zhǎng)生存期［29］。VISTA 體外可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞因子生成，體內(nèi)降低腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+T 細(xì)胞數(shù)。抗VISTA 抗體顯著延長(zhǎng)成瘤小鼠存活時(shí)間［30］。本研究發(fā)現(xiàn)，STEAP1 與 LUAD 浸潤(rùn) B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和DC 顯著相關(guān)，即STEAP1 表達(dá)水平與免疫標(biāo)志物 CD8A、CD8B、CD3D、CD3E、CD2、CD19、CD79A、CD86、CSF1R、CCL2、CD68、IL-10、IRF5、PTGS2、CD163、VSIG4、MS4A4A、CEACAM8、ITGAM、KIR2DL3、KIR2DL4 等顯著相關(guān)，表明STEAP1 在腫瘤免疫浸潤(rùn)細(xì)胞中具有重要調(diào)節(jié)作用，與腫瘤免疫逃逸有關(guān)。

STEAP1 在腫瘤發(fā)生過程中的調(diào)節(jié)功能可能是雙重的，取決于性別、組織類型和癌癥發(fā)展階段等。乳腺癌組織中STEAP1 mRNA 和蛋白表達(dá)增高，高表達(dá)STEAP1 與ER（estrogen receptor）和腫瘤分級(jí)明顯相關(guān)［15，31］。但STEAP1在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)較低，低表達(dá)STEAP1 與惡性表型和預(yù)后不良有關(guān)［9］。STEAP1 高表達(dá)可抑制EMT 相關(guān)基因 MMP2、MMP9、MMP13、VIM 和 CDH2 表達(dá)，增加 CDH1 表達(dá)，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移。反之，敲低STEAP1基因表達(dá)促進(jìn)EMT相關(guān)基因表達(dá)，CDH1表達(dá)減少，進(jìn)而增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力。此外，STEAP1 在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)下調(diào)，可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移和侵襲［9］。本研究初步分析STEAP1在LUAD 中的表達(dá)，表明其具有重要臨床預(yù)后價(jià)值。受條件限制，課題組暫時(shí)無法獲得相關(guān)標(biāo)本并對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。但ZHUANG 等［32］研究中，免疫組化結(jié)果顯示，STEAP1 在肺癌組織中升高，一定程度上證實(shí)本研究結(jié)果的可靠性。

綜上所述，STEAP1可能是LUAD 預(yù)后不良的潛在分子標(biāo)志物，其表達(dá)與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤(rùn)細(xì)胞相關(guān)，有助于免疫逃逸的發(fā)生。為臨床LUAD 治療提供了新思路。課題組將在以后工作中進(jìn)行STEAP1功能及機(jī)制研究。