王天菊 齊 珺 李恒新 王滿妮 王小芳 （西安市中心血站HLA高分辨分型確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室，西安710061）

人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）位于染色體6p21.3 區(qū)域，與機(jī)體自我識(shí)別和免疫應(yīng)答密切相關(guān)，在人類遺傳學(xué)、移植免疫學(xué)、輸血醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用［1-5］。精準(zhǔn)的HLA 分型技術(shù)促使越來(lái)越多的HLA 等位基因被發(fā)現(xiàn)和鑒定，為造血干細(xì)胞移植、疾病相關(guān)性研究、群體遺傳學(xué)等提供數(shù)據(jù)支持。截至2020 年4 月，IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫(kù) 3.40 版（http：//www. ebi. ac. uk/ipd/imgt/hla/stats）報(bào)道已發(fā)現(xiàn)的HLA 等位基因有27 258 個(gè)，其中HLA-DQB1等位基因有1 826個(gè)。HLA-DQB1位點(diǎn)屬于HLA-Ⅱ類分子基因位點(diǎn)，與HLA-A/B/C/DRB1 位點(diǎn)相比，多態(tài)性較少，隨著對(duì)HLA-DQB1 位點(diǎn)研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)其與自身免疫性疾病、感染性疾病、腫瘤等有相關(guān)性。另外，HLA-DQB1抗原是移植免疫中最重要的抗原之一，2006 年HORN等［6］提出應(yīng)將HLA-DQB1 分型列入造血干細(xì)胞移植前的組織配型實(shí)驗(yàn)中，其在造血干細(xì)胞移植中的作用也逐漸被認(rèn)知和總結(jié)。

作者所在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-直接測(cè)序法（polymerase chain reaction-sequence based typing，PCR-SBT）和序列特異性寡核苷酸探針（polymerase chain reaction-sequence-specific oligonucleotide probes，PCR-SSOP）對(duì)臨床異基因造血干細(xì)胞移植前HLA 高分辨確認(rèn)分型時(shí)，發(fā)現(xiàn)HLA-DQB1 位點(diǎn)分型結(jié)果存在模棱兩可，進(jìn)一步采用基于Ion Torrent S5測(cè)序系統(tǒng)的下一代測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）進(jìn)行鑒別，鑒定出一個(gè)罕見(jiàn)HLADQB1 等位基因 HLA-DQB1*02：106，通過(guò)對(duì)變異氨基酸在其三級(jí)結(jié)構(gòu)中的位置比對(duì)和模擬分析，進(jìn)一步分析變異氨基酸是否影響分子的高級(jí)結(jié)構(gòu)。將罕見(jiàn)等位基因與經(jīng)家系調(diào)查總結(jié)出其相應(yīng)的HLAA/B/C/DRB1/DQB1 單體型，查詢其在不同人種中的分布，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 樣本來(lái)源 先證者為西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液內(nèi)科就診的一名急性髓細(xì)胞白血病患者，陜西籍，漢族，女性，在本實(shí)驗(yàn)室HLA 高分辨分型中因HLA-DQB1 位點(diǎn)分型結(jié)果存在模棱兩可而進(jìn)一步確認(rèn)。先證者及其親屬，包括父親、母親、弟弟均為陜西籍，經(jīng)患者及家屬知情同意后采集靜脈血2管（EDTA抗凝管，5 ml/管）。

1.1.2 主要試劑與設(shè)備 血液基因組DNA 提取試劑盒（北京TIANGEN，批號(hào)S7709）；Magcore DNA 提取試劑盒（中國(guó)臺(tái)灣芮寶公司）；HLA-A/B/C/DRB1/DQB1 SecoreTMSBT 分型試劑（美國(guó)Thermo Fisher Life Technologies 公司）；HLA-A/B/C/DRB1/DQB1 SSO 高分辨分型試劑（美國(guó) One Lambda 公司）；NX TypeTMNGS 測(cè)序試劑（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。核酸蛋白定量檢測(cè)儀（美國(guó)，GeneQuant pro）；全自動(dòng)核酸提取儀（中國(guó)臺(tái)灣芮寶公司）；PCR擴(kuò)增儀（德國(guó)SENSO 公司，Sensoquest Labcycler）；全自動(dòng)DNA 測(cè)序分析儀（美國(guó)ABI公司，ABI-3730xl）；FLEXMAP-3DTM熒光磁珠流式分析儀（美國(guó)Lunimex公司）；Ion Torrent S5TM測(cè)序儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 方法

1.2.1 兩種方法提取基因組DNA 制備 分別采用血液基因組DNA 提取試劑盒（提取DNA 標(biāo)識(shí)此樣本①號(hào)）和Magcore自動(dòng)提取儀（提取DNA 標(biāo)識(shí)此樣本②號(hào)）嚴(yán)格按照試劑操作說(shuō)明提取血液基因組DNA，進(jìn)行濃度和純度的檢測(cè)并標(biāo)識(shí)，提取DNA的濃度范圍為20~80 ng/μl，純度A260n/mA280nm為1.6~1.9。

1.2.2 PCR-SBT 分型 采用 SeCore?HLA-SBT 分型試劑盒對(duì)該樣本進(jìn)行常規(guī)高分辨的HLA 基因分型（批號(hào) HLA-A：007，HLA-B：010，HLA-C：006，HLA-DRB1：008，HLA-DQB1：008）。對(duì) 1.2.1 提取的 DNA 進(jìn)行 HLA-A/B/C/DRB1/DQB1 位點(diǎn) PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用ExoⅠ/SAP 酶純化后，對(duì)HLA-A/B進(jìn)行第1~5外顯子正反向測(cè)序反應(yīng)，C 位點(diǎn)進(jìn)行1~7外顯子正反向測(cè)序反應(yīng)，HLA-DRB1 進(jìn)行第2 外顯子正反向及Condon86 正向測(cè)序反應(yīng)，DQB1 位點(diǎn)進(jìn)行2、3 外顯子正反向測(cè)序反應(yīng)。測(cè)序產(chǎn)物再經(jīng)乙醇/醋酸鈉沉淀，95℃熱變性迅速冷卻后的產(chǎn)物用ABI 測(cè)序儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，將電泳序列導(dǎo)入uTYPE 7.2 分析軟件進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)HLA-DQB1 位點(diǎn)存在模棱兩可組合，無(wú)法區(qū)分。

1.2.3 PCR-SSO 分型 采用 LABType SSO 試劑對(duì)1.2.1 提取的①號(hào)DNA 進(jìn)行HLA-A/B/C/DRB1/DQB1 5 個(gè)位點(diǎn)的特異性擴(kuò)增。在雜交板加入1.5 μl變性液，吸取3.0 μl擴(kuò)增產(chǎn)物與變性液混合，室溫反應(yīng)10 min。每孔加入中和液，將按比例稀釋的磁珠加入各孔，60℃孵育15 min 后加入洗滌液，4 000/rmin 離心 5 min，棄上清液，重復(fù) 3 次洗滌步驟。加入熒光標(biāo)記，60℃孵育5 min，洗滌1 次后加入緩沖液，轉(zhuǎn)移到上機(jī)板后放入Luminex 3D 熒光磁珠流式分析儀讀取數(shù)據(jù)，分析軟件為One Lambda HLA Fusion 4.2。

1.2.4 NGS 主要分為文庫(kù)制備、模板制備、測(cè)序反應(yīng)和數(shù)據(jù)分析三大步驟。

1.2.4.1 文庫(kù)制備 測(cè)定DNA 濃度后均一化，采用NXTypeTMNGS 試劑擴(kuò)增HLA-A/B/C 位點(diǎn)全長(zhǎng)，HLA-DRB1/DQB1 位點(diǎn)第2~6 外顯子。擴(kuò)增產(chǎn)物純化和定量后，濃度均一化。將處理好的產(chǎn)物片段化，接頭連接，末端修復(fù)，加標(biāo)簽，磁珠純化選擇300~1 000 bp 長(zhǎng)度的目標(biāo)片段。二次擴(kuò)增，純化和定量后，將HLAⅠ類和Ⅱ類產(chǎn)物進(jìn)行等摩爾混合。

1.2.4.2 模板制備 將50 μl 制備好的文庫(kù)加入Ion S5 ExT Chef Reagents 試劑盒指定管中進(jìn)行單克隆擴(kuò)增。

1.2.4.3 測(cè)序反應(yīng)和數(shù)據(jù)分析 將擴(kuò)增產(chǎn)物加載至Ion 530TMChip 芯片，在Ion S5 測(cè)序平臺(tái)上加入4 種脫氧核苷酸，開(kāi)始測(cè)序反應(yīng)，采用Type Stream Visual 軟件指定 HLA-A/B/C/DRB1/DQB1 等位點(diǎn)基因型。

1.2.5 家系單體型分析及地區(qū)分布分析 通過(guò)家系分析，推導(dǎo)含有HLA-DQB1*02：106 的HLA-A/B/C/DRB1/DQB1 5 位點(diǎn)單體型。在HaploStats 網(wǎng)站（http：//www. HaploStats. org）查詢?cè)搯误w型在不同人種的分布情況。

1.2.6 HLA-DQB1*02：01：01：01 與 HLA-DQB1*02：106 編碼蛋白三維空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 IMGT/HLA 查詢 HLA-DQB1*02：106 氨基酸序列，提交SWISS MODEL（https：//swissmodel. expasy. org/）進(jìn)行同源建模，選定 PDB 數(shù)據(jù)庫(kù) ID 號(hào)為 5KSU［7］作為模板進(jìn)行兩分子間結(jié)構(gòu)和差異氨基酸的比較，找出差異氨基酸的位置并標(biāo)明氨基酸結(jié)構(gòu)差異。將HLA-DQB1*02：01：01：01 分子外顯子 2 的氨基酸、外顯子 2 和 3 的氨基酸，HLA-DQB1*02：106 分子外顯子2的氨基酸、外顯子2和3的氨基酸序列分別提交Phyre2蛋白折疊識(shí)別建模在線軟件（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/htm/lpage.cgi？id=index），下載得到的pdb 格式文件。將相應(yīng)文件導(dǎo)入FATCAT（http：//fatcat.godziklab.org/）［8］在線比對(duì)分析兩者結(jié)構(gòu)，以兩分子間的均方根偏差（RMSD，單位nm）作為表示兩分子結(jié)構(gòu)大小的參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 PCR-SBT 分型結(jié)果 先證者HLA-A/B/C/DRB1 位點(diǎn) PCR-SBT 分型結(jié)果分別為 A*02：06，31：01；B*13：01，35：08；C*03：04，04：01；DRB1*03：01，15：01。DQB1 位點(diǎn)的分型結(jié)果為模棱兩可組合02：01，06：109 與02：106，06：02，無(wú)法確定唯一高分指定結(jié)果，與常見(jiàn)等位基因組合02：01，06：02 組合相比，在619位核苷酸有差異。常見(jiàn)等位基因組合02：01，06：02 在619 位為G，模棱兩可組合為R（A+G），見(jiàn)圖1。

圖1 該樣本HLA-DQB1位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果Fig.1 Sequencing results of HLA-DQB1 locus of the sample

2.2 PCR-SSO 分型 先證者 HLA-A/B/C/DRB1 位點(diǎn)PCR-SSO 分型結(jié)果分別為A*02：06：01G，31：01：02G；B*13：01：01G，35：08：01G；C*03：04：01G，04：01：01G；DRB1*03：01：01G，15：01：01G。DQB1 位點(diǎn)分型結(jié)果為 DQB1*02：01：01G（G 組包含 02：106），06：02：01G（G 組包含06：109）。擴(kuò)增值良好，未發(fā)現(xiàn)有異常反應(yīng)的磁珠，但結(jié)果為模棱兩可組合，無(wú)法區(qū)分（圖2）。

圖2 HLA-DQB1位點(diǎn)Luminex SSO 分型結(jié)果Fig.2 HLA-DQB1 locus Lumines SSO results

2.3 NGS 結(jié)果 經(jīng)NGS 方法驗(yàn)證，該樣本HLA-A/B/C/DRB1 位點(diǎn)分型結(jié)果與PCR-SBT 和PCR-SSO兩種方法檢測(cè)結(jié)果相同，HLA-DQB1 結(jié)果確定為02：106，06：02。

2.4 DQB1*02：106 與 DQB1*02：01：01：01 核苷酸和氨基酸序列比對(duì) 與DQB1*02：01：01：01 相比，DQB1*02：106 在第 3 外顯子 619 位置有一個(gè)氨基酸的差異，DQB1*02：01：01：01 為 G，DQB1*02：106 為A，造成第175位氨基酸由非極性疏水性氨基酸纈氨酸Val（GTG）變成極性中性氨基酸蛋氨酸Met（ATG），見(jiàn)圖3。

圖3 DQB1*02：106 與 DQB1*02：01：01：01 差異核苷酸和氨基酸比較Fig.3 Comparison of nucleotide and amino acid differ?ence between DQB1*02：106 and DQB1*02：01：01：01

2.5 HLA-DQB1*02：01：01：01 與 HLA-DQB1*02：106 三維同源建模與分子間RMSD HLA-DQB1*02：106 分子與氨基酸序列最接近HLA-DQB1*02：01：01：01分子相比，差異氨基酸位于β2鏈β折疊的部分，接近β2 鏈的尾端。經(jīng)FATCAT 在線軟件對(duì)三維結(jié)果的比對(duì)分析，含有183 個(gè)氨基酸的HLADQB1*02：106 與 HLA-DQB1*02：01：01：01 分 子RMSD值為1.65，見(jiàn)圖4。

圖4 HLA-DQB1*02：106 與 HLA-DQB1*02：01：01：01 差異氨基酸和三維結(jié)構(gòu)比較Fig.4 Comparisons of difference amino acid and threedimensional structure of HLA-DQB1*02：106 and HLA-DQB1*02：01：01：01 molecule models

2.6 通過(guò)家系單體型分析及地區(qū)分布分析 根據(jù)家系分析先證者的HLA 兩條單體型為A*31：01-B*15：18-C*04：01-DRB1*03：01-DQB1*02：106 和 A*02：06-B*13：01-C*03：04-DRB1*15：01-DQB1*06：02。經(jīng)家系分析該等位基因遺傳于父親，見(jiàn)圖5。

圖5 先證者HLA-A/B/C/DRB1/DQB1 5 位點(diǎn)單體型家系分析Fig.5 Pedigree analysis of HLA-A/B/C/DRB1/DQB1 haplotype

2.7 查詢單體型地區(qū)分布 在HaploStats（http：//www.HaploStats.org）在線數(shù)據(jù)庫(kù)查詢單體型A*31：01-B*15：18-C*04：01-DRB1*03：01-DQB1*02：106在世界所有人群中的分布，未查詢到該單體型的分布。以HLA-DQB1*02：106 查詢無(wú)相關(guān)單體型。以單體型 A*31：01-B*15：18-DRB1*03：01-DQB1*02：01 查詢到的單體型有3 種，相關(guān)聯(lián)的C 位點(diǎn)等位基因不同，單體型和頻率如表1。A*31：01-C*03：03-B*15：18-DRB1*03：01-DQB1*02：01 在西班牙人種中頻率最高（5.712E-8），在高加索人種的頻率為2.391E-8，在非裔美國(guó)人頻率為7.542E-10，亞洲和太平洋島民和印第安人未發(fā)現(xiàn)該單體型。A*31：01-C*07：01-B*15：18-DRB1*03：01-DQB1*02：01 僅在非裔美國(guó)人種發(fā)現(xiàn)。A*31：01-C*07：04-B*15：18-DRB1*03：01-DQB1*02：01在非裔美國(guó)人種，高加索人種，西班牙人種都有發(fā)現(xiàn)。

表1 A*31：01-B*15：18-DRB1*03：01相關(guān)單體型在不同人種的分布Tab.1 Distribution of A*31：01-B*15：18-DRB1*03：01 related haplotypes in different races

3 討論

目前，應(yīng)用于臨床HLA 的檢測(cè)方法主要有序列特異性寡核苷酸探針、序列特異性引物、PCR-SBT、NGS 等［9-11］。PCR-SBT 被譽(yù)為 HLA 基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)，由于測(cè)序結(jié)果存在多種等位基因組合在檢測(cè)區(qū)域內(nèi)具有相同的雜合序列，模棱兩可組合出現(xiàn)越來(lái)越多［12-13］。NGS技術(shù)應(yīng)用于HLA 等位基因測(cè)序主要有兩個(gè)優(yōu)勢(shì)，第一，針對(duì)HLA 單鏈測(cè)序，分別得到特定單一等位基因序列，很大程度上減少了模棱兩可的結(jié)果；第二，NGS 技術(shù)針對(duì)HLA 位點(diǎn)整個(gè)基因組序列進(jìn)行測(cè)定，得到的HLA 分型結(jié)果更精準(zhǔn)。本次臨床HLA 檢測(cè)工作中，HLA-DQB1 測(cè)序分析的結(jié)果為常見(jiàn)等位基因+罕見(jiàn)等位基因模棱兩可組合（DQB1*02：01：01+06：109 和DQB1*02：106+06：02：01：01），PCR-SSO 及檢測(cè)結(jié)果為 DQB1*02：01G（包含DQB1*02：106）+06：02G（包含DQB1*06：109），這兩種方法均無(wú)法確定唯一高分辨結(jié)果。經(jīng)NGS 技術(shù)鑒定，該樣本HLA-DQB1 位點(diǎn)最終結(jié)果為DQB1*02：106，06：02：01：01。至此，最終確定該樣本HLADQB1 位點(diǎn)的結(jié)果為罕見(jiàn)等位基因DQB1*02：106 與常見(jiàn)等位基因DQB1*06：02：01：01組合。

根據(jù) IMGT/HLA 數(shù)據(jù)庫(kù)（版本 3.40.0，2020 年4 月發(fā)布），共有1 826 種HLA-DQB1 等位基因，根據(jù)中國(guó)常見(jiàn)及確認(rèn)HLA 等位基因CWD 表2.4 版，HLA-DQB1 位點(diǎn)常見(jiàn)及確認(rèn)等位基因有60 種，罕見(jiàn)等位基因占95.36%。HLA-DQB1*02組共有228種等位基因，常見(jiàn)等位基因有4 種：HLA-DQB1*02：01，HLA-DQB1*02：02，HLA-DQB1*02：03，HLADQB1*02：12，提示雖然HLA 等位基因眾多，但罕見(jiàn)等位基因占了大多數(shù)，約40%的HLA 等位基因只被報(bào)道過(guò) 1 次。DQB1*02：106 在 2018 年首次被瑞士報(bào)道后，未查詢到在其他實(shí)驗(yàn)室和人種的關(guān)于此等位基因和單體型的相關(guān)報(bào)道，直到本次被再次檢測(cè)到并且有相關(guān)單體型，因此需要在臨床檢測(cè)工作中不斷地對(duì)罕見(jiàn)等位基因和單倍型進(jìn)行分析和總結(jié)，對(duì)于研究人群特異性免疫遺傳學(xué)基礎(chǔ)和臨床移植免疫有重要意義。

HLA 抗原具有高度遺傳多態(tài)性，主要表現(xiàn)在同一基因座位等位基因的高度多態(tài)性，在機(jī)體的免疫應(yīng)答啟動(dòng)和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，HLA-DQB1*02：01 與疾病間的相關(guān)性研究已有諸多報(bào)道。HJELMSTR?M 等［14］報(bào)道 HLA-DQB1*02：01 與重癥肌無(wú)力發(fā)病呈陽(yáng)性關(guān)聯(lián)，Ala57β于早期發(fā)病患者中頻率升高。HLA-DQB1*02：01 在伊朗人群中與1 型糖尿病顯著相關(guān)，與韓國(guó)兒童1 型糖尿病抗胰島素抗體相關(guān)［15-16］。在印度南部人群中HLA-DQB1*02：01是自身免疫性甲狀腺疾病的保護(hù)性等位基因，Ala86β、Tyr87β、Gly26β、Ser74β、Phe9β和 Ser57β是 自 身免 疫性甲狀腺疾病的保護(hù)性氨基酸殘基［17］。HLADQB1*02 與慢性丙型肝炎感染和干燥綜合癥相關(guān)［18］。關(guān)于HLA-DQB1 位點(diǎn)的等位基因和氨基酸殘基與疾病相關(guān)的研究都是針對(duì)HLA-DQB1 等位基因 Exon2 編碼的 β1 鏈的 90 個(gè)氨基酸，因?yàn)?β1 鏈?zhǔn)亲罹叨鄳B(tài)性的部位，同時(shí)也是與抗原肽結(jié)合的部位。Exon3 編碼的β2 鏈?zhǔn)敲庖咔虻鞍讟訁^(qū)，作用主要為與T 細(xì)胞的CD4 分子結(jié)合和穩(wěn)定HLA Ⅱ類分子的結(jié)構(gòu)。DQB1*02：106 核苷酸序列與DQB1*02：01：01：01 相比，只在 619 位有一個(gè)核苷酸的差異（G＞A），導(dǎo)致 β2 鏈 175 位氨基酸由纈氨酸（GTG，Val）變?yōu)榈鞍彼幔ˋTG，Met），該位置的氨基酸變化是否會(huì)影響HLA 分子與抗原肽結(jié)合，還需在后續(xù)的研究中探討。在對(duì)HLA 等位基因與疾病相關(guān)性研究中，為了確保檢驗(yàn)效能，一般不統(tǒng)計(jì)分析頻率小于2%的等位基因，罕見(jiàn)等位基因如HLA-DQB1*02：106 通常不被計(jì)算。自 2010 年 4 月起，HLA 命名委員會(huì)基于抗原結(jié)合槽核苷酸序列相同（HLAⅠ類等位基因外顯子2、3 核苷酸序列相同和HLA Ⅱ類抗原外顯子2 序列相同）將HLA 等位基因分為不同的G 組，HLA-DQB1*02：106 屬于 HLA-DQB1*02：01：01G，在病例對(duì)照研究中，是否應(yīng)該基于G 組進(jìn)行頻率的差異統(tǒng)計(jì)，分析與疾病相關(guān)性的等位基因組，有待于進(jìn)一步研究。

在異基因造血干細(xì)胞移植中，HLA-A/B/C/DRB1/DQB1 是影響移植存活率的主要因素之一。與HLA-A/B/C 分子相比，HLA-DQB1 分子在細(xì)胞表面的表達(dá)量少，多態(tài)性少，與HLA-DRB1 位點(diǎn)的等位基因呈強(qiáng)連鎖不平衡，直到2006年才被確認(rèn)為異基因造血干細(xì)胞移植前必須檢測(cè)的HLA 等位基因之一。隨著異基因造血干細(xì)胞移植技術(shù)的廣泛開(kāi)展，HLA 不完全相合移植在逐漸增多。HLA-A/B/C/DRB1/DQB1 等位基因錯(cuò)配對(duì)異基因造血干細(xì)胞移植后效果的評(píng)估由只是單純統(tǒng)計(jì)不相合等位基因的個(gè)數(shù)逐漸向基因功能和表達(dá)量分析轉(zhuǎn)變［19-20］。目前對(duì)DQB1 位點(diǎn)異基因移植錯(cuò)配后是否會(huì)引起移植物抗宿主?。╣raft versus host disease，GVHD）還沒(méi)有統(tǒng)一的結(jié)論。在一項(xiàng)德國(guó)人群移植后回顧性分析發(fā)現(xiàn)，DQB1 等位基因不相合與其他HLA 等位基因不相合有相同的危險(xiǎn)比［21］，但在一項(xiàng)HLA-A/B/C/DRB1/DQB1 9/10 匹配臨床回顧性研究發(fā)現(xiàn)，與HLA-A，-B，-C 位點(diǎn)的不相合相比，DRB1/DQB1 有些錯(cuò)配是允許的［22］。目前在可允許錯(cuò)配方面還沒(méi)有建立統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，一些采用交叉反應(yīng)組，還有一些采用氨基酸殘基匹配方案。這兩種方案都是建立在抗原結(jié)合槽的基礎(chǔ)上，分析HLA-Ⅰ類抗原α1和 α2 區(qū)域和 HLA-Ⅱ類抗原的 β1 區(qū)域。HLA 分子關(guān)鍵位置的氨基酸替換會(huì)引起嚴(yán)重的急性GVHD［20，23］。與HLA-DQB1*02：01氨基酸序列相比，HLA-DQB1*02：106 盡管只在 175 位有一個(gè)氨基酸的差異，由非極性疏水性氨基酸纈氨酸（GTG，Val）變?yōu)闃O性中性氨基酸蛋氨酸（ATG，Met），但氨基酸側(cè)鏈大小不同可能會(huì)導(dǎo)致HLA 分子空間結(jié)構(gòu)不同，僅1個(gè)氨基酸的差別也可引起HLA分子三維結(jié)構(gòu)明顯變化；而HLA-DQB1*02：106 與HLA-DQB1*02：01的RMSD 值為1.65，分子間結(jié)構(gòu)差異較大。既往研究表明，供受體之間HLA-Ⅱ類分子間RMSD 值大于0.02 nm，極有可能發(fā)生嚴(yán)重的 GVHD［24］。DQB1*02：106 與 DQB1*02：01 分子錯(cuò)配移植是否會(huì)發(fā)生GVHD，需要建立在HLA 三維結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)上的對(duì)異基因造血干細(xì)胞移植后GVHD、總生存率、移植后是否產(chǎn)生HLA 分子的抗體產(chǎn)生等方面回顧性研究來(lái)最終確定。

HLA 高度的多態(tài)性使得異基因造血干細(xì)胞移植供受者之間HLA-A/B/C/DRB1/DQB1 位點(diǎn)10/10 完全匹配的可能性降低，尤其是攜帶罕見(jiàn)等位基因的患者，找到全相合無(wú)關(guān)異基因捐獻(xiàn)者的可能性更低。某些罕見(jiàn)基因可能與某些單體型關(guān)聯(lián)或僅存在于保守的單體型中，本次臨床檢測(cè)樣本HLADQB1 位點(diǎn)的結(jié)果為 HLA-DQB1*02：106，家系分析其 相 關(guān) 單 體 型 為 A*31：01-B*15：18-C*04：01-DRB1*03：01-DQB1*02：106，來(lái)源于先證者父親，并且穩(wěn)定遺傳至先證者和弟弟，可以進(jìn)行親緣的半相合造血干細(xì)胞移植。基于家系分析等位基因和單體型，在相同的遺傳背景下更容易找到相合的供者。

本研究基于在臨床HLA 高分辨確認(rèn)分型實(shí)驗(yàn)中檢出HLA-DQB1 模棱兩可組合，經(jīng)NGS 確認(rèn)為HLA-DQB1*02：106，進(jìn)一步分析該等位基因核苷酸和氨基酸序列及對(duì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)和比對(duì)分析，同時(shí)對(duì)先證者進(jìn)行家系分析確定HLA-DQB1*02：106 相關(guān)的單體型并查詢?cè)搯误w型在不同人群的分布，對(duì)罕見(jiàn)等位基因和單體型的總結(jié)研究為臨床指導(dǎo)非親緣造血干細(xì)胞移植供者的選擇提供理論依據(jù)，保證攜帶確認(rèn)和罕見(jiàn)等位基因的患者最大可能地找到匹配的供者。