胡獻躍， 黃東緯， 陳笑笑， 朱興一

(1.金華職業(yè)技術學院，浙江 金華 321016；2.浙江工業(yè)大學藥學院，浙江 杭州 310014)

續(xù)斷又名川斷、川續(xù)斷，《神農(nóng)本草經(jīng)》列其為治療骨折、骨質疏松的上品，具有補肝腎、強筋骨、續(xù)折損等功效[1]，主要成分包括生物堿、揮發(fā)油、皂苷、環(huán)烯醚、萜糖苷、多糖等[2]，其中治療骨質疏松的代表性化合物為續(xù)斷皂苷Ⅵ。研究表明，續(xù)斷皂苷Ⅵ可誘導大鼠骨髓間充質干細胞向成骨細胞方向分化，促進成骨細胞分化和礦化[3]，能夠增加骨骼密度，改善骨小梁微觀結構，有效防治骨質疏松及其繼發(fā)性疾病[4]。

目前，續(xù)斷提取工藝以醇提法[5-6]為主，也有水提法[7-9]的報道，但水提物中續(xù)斷皂苷Ⅵ含量較低(34.9%)[9]，而在水飽和正丁醇中具有較高的溶解度。醇提后常用正丁醇萃取、水溶、石油醚脫脂、沉淀等工序，不僅消耗大量的機溶劑，并且提取過程時間長、次數(shù)多，導致能耗高、生產(chǎn)周期長、成本高昂。

離子液體是由陰陽離子組成的室溫或接近室溫時為液態(tài)的物質，與傳統(tǒng)有機溶劑和天然產(chǎn)物較單一的相互作用比較，它可與天然產(chǎn)物產(chǎn)生靜電、范德華力、氫鍵等多重相互作用，從而對后者具有較高的溶解度，故被廣泛應用于天然產(chǎn)物提取分離中[10]。超聲輔助離子液體提取結合了超聲產(chǎn)生的高效空化效應和離子液體溶解能力強的特點，是一種高效節(jié)能的綠色提取工藝[11]，故本實驗采用該方法提取續(xù)斷皂苷Ⅵ，并對工藝進行優(yōu)化，以期為該成分工業(yè)化生產(chǎn)提供經(jīng)濟環(huán)保的工藝路線。

1 材料

1.1 試劑與藥物 川續(xù)斷(產(chǎn)地四川涼州)購于四川鹽源縣醫(yī)藥有限責任公司，經(jīng)金華市食品藥品檢驗檢測研究院蔣士鵬副主任中藥師鑒定為正品。異綠原酸A(DST190918-036，純度>98.0%)、異綠原酸B(DST191008-037，純度>98.0%)、異綠原酸C(DST190904-038，純度>98.0%)、馬錢苷酸(DST191025-033，純度>98.0%)、綠原酸(DST190906，純度>98.0%)、咖啡酸(DST191030-013, 純度>98.0%)、馬錢苷(DST200628-038，純度>98.0%)、川續(xù)斷皂苷乙(DST191202-56，純度>98.0%)，川續(xù)斷皂苷Ⅵ(DST191126-041，純度>99.0%)對照品均由成都德思特生物技術有限公司提供。D101大孔樹脂(2019083188)購于安徽三星樹脂科技有限公司。1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([EMIM]BF4，純度≥99%)、1-丙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([PMIM]BF4，純度≥99%)、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([BMIM]BF4，純度≥99%)、1-丁基-3-甲基咪唑溴鹽([BMIM]Br，純度≥99%)離子液體均由中國科學院蘭州化學物理研究所提供。

1.2 儀器 Agilent 1260 HPLC色譜儀(美國Agilent公司)；LC2030C plus HPLC色譜儀(日本島津公司)；旋轉蒸發(fā)儀(上海耀特儀器設備有限公司)；電子電平(萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司)；GT-2227QTS超聲波清洗器(500 W，廣東固特超聲股份有限公司)；真空干燥箱(上海精密儀器儀表公司)。

2 方法

2.1 續(xù)斷皂苷Ⅵ含量測定

2.1.1 色譜條件 填充劑十八烷基硅烷鍵合硅膠；流動相乙腈-水(含0.15%三氟乙酸)(29∶71)；柱溫30 ℃；檢測波長215 nm；進樣量10 μL。理論塔板數(shù)按續(xù)斷皂苷Ⅵ計，不低于3 000[12]。

2.1.2 方法學考察 取續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品適量，20%甲醇制成1 mg/mL溶液，精密移取1、2、3、4、5 mL至10 mL量瓶中，20%甲醇稀釋至刻度，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定。以峰面積為縱坐標(Y)，對照品質量濃度為橫坐標(X)進行回歸，得方程為Y=189 400X-108.36(r=0.999 8)，在0.1～0.5 mg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。另外，續(xù)斷皂苷Ⅵ平均加樣回收率為98.6%(RSD=0.9%)，精密度RSD為0.4%。

2.2 離子液體種類篩選 取粉碎后過10目篩的藥材10 g，加入離子液體([EMIM]BF4、[PMIM]BF4、[BMIM]BF4、[BMIM]Br)溶液(0.8 mol/L)各100 mL，浸泡2 h后超聲(500 W)處理30 min，離心，加水定容至100 mL，取上清液2 mL，加水稀釋至100 mL，測定續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率。

2.3 單因素試驗

2.3.1 離子液體濃度 配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L離子液體溶液，固定提取功率500 W，料液比1∶10，提取時間30 min，測定續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率。

2.3.2 料液比 固定離子液體種類為[BMIM]BF4，濃度為0.8 mol/L，超聲功率為500 W，提取時間為30 min，選擇料液比1∶3、1∶5、1∶8、1∶10、1∶15，測定續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率。

2.3.3 提取時間 固定離子液體種類為[BMIM]BF4，濃度為0.8 mol/L，超聲功率為500 W，料液比為1∶8，選擇提取時間30、45、60、90、120 min，測定續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率。

2.4 響應面法 在單因素試驗基礎上，通過Design-Expert 11.0.6軟件對離子液體濃度(A，0.6、0.8、1.0 mol/L)、料液比(B，1∶6、1∶8、1∶10)、提取時間(C，30、60、90 min)進行3因素3水平響應面分析。

2.5 指紋圖譜建立

2.5.1 色譜條件 參考文獻[13]報道。Agilent C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-水(含0.05%磷酸)(B)，梯度洗脫(0 min,2%A;0～5 min,2%～6%A;5～18 min,6%～10%A;18～40 min,10%～20%A;40～70 min,20%～25%A;70～80 min,25%～35%A;80～90 min, 35%～50%A;90～110 min,50%～60%A;110～120 min,60%～70%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長212 nm；進樣量20 μL。

2.5.2 對照品溶液制備 取異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、馬錢苷酸、綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、川續(xù)斷皂苷乙、續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品適量，20%甲醇制成4 mg/mL溶液，各取1 mL置于20 mL量瓶中，20%甲醇稀釋至刻度，即得(質量濃度為0.2 mg/mL)。

2.5.3 水提、醇提液制備 將藥材粉碎后過10目篩，準確稱取100 g，分別加入10倍量水、70%乙醇，90 ℃回流提取1 h，重復3次，合并提取液，取上清液3 mL，加水稀釋至50 mL，即得。

2.6 柱層析分析 將離子液體提取液濃縮，上樣大孔樹脂柱，分別用水和不同體積分數(shù)乙醇洗脫，分段收集洗脫液，測定續(xù)斷皂苷Ⅵ含量，確定柱層析條件。富集續(xù)斷皂苷Ⅵ的洗脫液用旋轉蒸發(fā)儀蒸干后真空干燥，即得離子液體提取物。

3 結果

3.1 離子液體種類篩選 圖1顯示，離子液體提取物中含有續(xù)斷皂苷Ⅵ，表明超聲輔助離子液體可對該成分進行有效提取。

1.續(xù)斷皂苷Ⅵ

圖2～3顯示，離子液體對續(xù)斷皂苷Ⅵ都有較高的提取率，這是因為它可與該成分進行氫鍵、范德華力等多重相互作用；以BF4-為陰離子，咪唑陽離子烷基取代鏈長度從C2增加到C4時，續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率逐漸上升，這是因為隨著離子液體烷基鏈長度增加，它與續(xù)斷皂苷Ⅵ的范德華力加強，可提高提取率；以[BMIM]+為陽離子時，BF4-對續(xù)斷皂苷Ⅵ的提取效果優(yōu)于Br-，這是因為前者極性大于后者，與含多個羥基該成分的相互作用更強。

圖2 陽離子種類對續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率的影響

圖3 陰離子種類對續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率的影響

3.2 單因素試驗

3.2.1 離子液體濃度 圖4顯示，隨著離子液體濃度升高，續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率先迅速上升后緩慢增長，低濃度下更明顯，其原因可能為離子液體與該成分的范德華力、氫鍵作用促進了后者轉移，而當其濃度達到一定程度時溶液黏度增加，反而影響了提取效率。綜合考慮成本及提取率，選擇離子液體濃度為0.8 mol/L。

圖4 離子液體濃度對續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率的影響

3.2.2 料液比 圖5顯示，隨著料液比增加，續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率升高，但在1∶8后反而降低，其原因可能為此時該成分基本提取完全，而提取液的增加反而會消耗功率，導致提取量下降。因此，選擇料液比為1∶8。

圖5 料液比對續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率的影響

3.2.3 提取時間 圖6顯示，隨著提取時間延長，續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率升高，但在60 min后程度不明顯。綜合考慮提取效率，選擇提取時間為60 min。

圖6 超聲時間對續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率的影響

3.3 響應面法 結果見表1，二次多項回歸方程為Y=-424.16+494.29A+36.05B+3.19C+5.5AB-0.65AC-0.029 6BC-249.75A2-2.15B2-0.015 4C2，方差分析見表2。

表1 試驗設計與結果

表2 方差分析

最終確定，最優(yōu)工藝為離子液體濃度0.905 6 mol/L，料液比1∶9.03，提取時間77.8 min，續(xù)斷皂苷Ⅵ提取率為100.39%。

3.4 指紋圖譜建立 以續(xù)斷皂苷Ⅵ為對照，測定其他成分相對峰面積，結果見表3、圖7。由此可知，水提、醇提、離子液體提取對續(xù)斷皂苷乙、咖啡酸的提取率均很低，并且離子液體提取、醇提對續(xù)斷皂苷Ⅵ的提取效率明顯優(yōu)于水提。

表3 各成分相對峰面積

注：A～D分別為對照品、醇提物、水提物、離子液體提取物。

3.5 柱層析分析 取離子液體提取液100 mL，旋轉蒸發(fā)儀濃縮(80 ℃，-0.07 MPa)至30 mL左右，上D101大孔樹脂柱，依次用水及10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%乙醇洗脫，洗脫液用量為4倍柱體積，分段收集，每個柱體積收集1瓶，HPLC法測定續(xù)斷皂苷Ⅵ含量，計算累積回收率，結果見表4。由此可知，水和3個柱體積20%乙醇中不含續(xù)斷皂苷Ⅵ，但可洗脫離子液體和極性較強的雜質，而2個柱體積60%乙醇基本可將續(xù)斷皂苷Ⅵ回收完全。

表4 續(xù)斷皂苷Ⅵ累積回收率測定結果(%)

取水、20%乙醇、60%乙醇洗脫液，在“2.5.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖8。由此可知，水主要洗脫離子液體和極性成分(如馬錢苷酸)，20%乙醇主要洗脫綠原酸、咖啡酸、馬錢苷，60%乙醇主要洗脫續(xù)斷皂苷Ⅵ及異綠原酸A、B、C。

注：A～D分別為對照品、水洗脫液、20%乙醇洗脫液、60%乙醇洗脫液。

3.6 驗證試驗 根據(jù)工藝優(yōu)化、柱層析分析結果，進行3批驗證試驗，每批1 000 g藥材，結果見表5，可知該工藝穩(wěn)定可靠，重復性良好。

表5 驗證試驗結果(n=3)

4 討論與結論

本實驗采用超聲輔助1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽離子液體提取川續(xù)斷活性成分續(xù)斷皂苷Ⅵ，測得提取物收率為12.57%，續(xù)斷皂苷Ⅵ質量分數(shù)79.30%，提取率為99.68%，表明工藝高效可行。離子液體價格昂貴，對其回收利用可大大降低成本，本實驗利用大孔樹脂進行洗脫，發(fā)現(xiàn)續(xù)斷皂苷Ⅵ主要集中于60%乙醇洗脫液中，不僅實現(xiàn)了離子液體的分離與回收，同時也使提取物得到了純化。

綜上所述，本實驗利用離子液體與皂苷的多種相互作用力結合超聲輔助提取技術，使川續(xù)斷皂苷Ⅵ的提取能高效完成，并且未使用正丁醇、石油醚等有機溶劑，減輕了耗能、環(huán)保、安全生產(chǎn)壓力，同時也解決了提取過程中能源、有機溶劑損耗所帶來的成本過高問題，是一種綠色節(jié)能的提取工藝。