朱 爽， 姜 濤， 張洪長， 韓燕燕， 張 哲， 王恩鵬， 陳長寶

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117)

抑郁癥的特點(diǎn)是思維遲鈍、情緒低落、語言行動(dòng)減少、缺乏活力和食欲不振等。隨著工作和生活的步伐加快，人類所受的壓力愈來愈大，抑郁癥的病發(fā)率逐漸上升。根據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測，抑郁癥將列為疾病負(fù)擔(dān)的第二重病，僅次于心臟病[1]。目前公認(rèn)的致病機(jī)制有單胺類神經(jīng)遞質(zhì)理論、下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)理論、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子理論、免疫功能異常理論及氧化應(yīng)激理論等[2-3]，其中前兩種假說已經(jīng)得到廣泛認(rèn)可，故本研究以兩種假說的常用指標(biāo)5-羥色胺(5-HT)和皮質(zhì)酮(CORT)作為判定抑郁癥的依據(jù)。紫外線是皮膚最常接觸的刺激源，過量照射產(chǎn)生的高濃度活性氧簇能夠引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致皮膚損傷、機(jī)體免疫抑制、甚至皮膚癌[4]。最新研究表明，中波紫外線(ultraviolet B，UVB)輻射可導(dǎo)致HPA軸活化，降低海馬神經(jīng)新生和突觸蛋白表達(dá)，并導(dǎo)致受照小鼠產(chǎn)生抑郁行為，而越來越多的證據(jù)表明，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的炎癥可能是誘發(fā)抑郁癥的重要因素[5-6]。

人參PanaxginsengC.A.Mey.為五加科植物，是我國珍貴滋補(bǔ)養(yǎng)生中藥，人參皂苷是其主要藥效成分，是一種固醇類化合物，含量在40.0%左右，主要成分包括人參皂苷Re、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd等，有抗衰老、抗老年癡呆、抗心律失常、抗腫瘤、降血糖血脂、抑制細(xì)胞凋亡等功效[7]。通過文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)篩選人參皂苷抗抑郁活性成分的研究較少，因此本研究采用體外單胺氧化酶篩選人參中抗抑郁作用單體皂苷，建立UVB輻射抑郁大鼠模型，研究其活性成分對大鼠行為學(xué)及生化指標(biāo)的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物 40只SD雄性大鼠，體質(zhì)量(180.0±10.0)g，購自長春生物制品有限公司動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK-(遼)2018-0001，飼養(yǎng)溫度20.0～25.0 ℃，相對濕度50.0%～60.0%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，期間飲食自由。

1.2 藥物與試劑 單胺氧化酶、氯吉蘭、犬尿胺二氫溴酸鹽(批號 SLBW9211、MKBW9449V、MKCF5310，美國 Sigma-Aldrich 公司)；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉(批號 20170429、20160806，分析純，北京化工廠有限責(zé)任公司)。人參皂苷Rg3、Rb1、Rc、Re、Rf、Rg1、Rh2對照品(純度大于98%，吉林大學(xué)有機(jī)化學(xué)教研室)；5-HT、CORT酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(批號 DG-050820R、DG-031538R，美國 R&D 公司)。

1.3 儀器 DK600B型保溫箱(上海森信儀器有限公司)；TCG16G型渦旋儀(上海安亭科學(xué)儀器廠)；Infinite M200PRO酶標(biāo)儀(瑞士 Tecan 公司)；Eppendorf 5804R高速離心機(jī)(德國 Eppendorf 公司)；BT25S天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]；-80 ℃超低溫冰箱MDF-U54 V[松下醫(yī)療器械(上海)有限公司]。

2 方法

2.1 人參皂苷對單胺氧化酶A抑制活性測定 參考文獻(xiàn)[8-9]，優(yōu)化反應(yīng)條件，確立反應(yīng)總體積為200 μL。分別向96孔酶標(biāo)板中加入20 μL樣品、30 μL底物和130 μL PBS緩沖液，振蕩均勻，于37.0 ℃恒溫條件下反應(yīng)10 min，加入20 μL的單胺氧化酶液(30 U/mL)，振蕩均勻，37.0 ℃恒溫環(huán)境下孵育40 min，立即檢測360 nm處的光密度值(OD)，平行試驗(yàn)3次得平均值，即為OD樣品，空白孔(不加樣品，其他步驟相同)的光密度值為OD空白，背景孔(不加酶試劑和底物，其他步驟相同)的光密度值為OD背景，底物孔(不加酶試劑和樣品，其他步驟相同)的光密度值為OD底物。酶的活性范圍(OD底物-OD空白)等于ΔOD，最后以下述公式計(jì)算抑制率。

2.2 人參皂苷Rg3對單胺氧化酶A抑制活性動(dòng)力學(xué)研究

2.2.1 人參皂苷Rg3對單胺氧化酶A結(jié)合可逆性分析 許多抑制劑通過形成一種抑制劑-酶復(fù)合物來抑制目標(biāo)酶的活性，而此過程在含有大量抑制劑環(huán)境中會(huì)加速進(jìn)行。為了分析抑制劑與單胺氧化酶A結(jié)合的可逆性，可將酶與高濃度抑制劑(人參皂苷Rg3或陽性對照藥物氯吉蘭)一起孵育，然后對酶-抑制劑復(fù)合物進(jìn)行廣泛透析，恢復(fù)酶的活性，并分析比較透析前后其活性的變化。將5.0 μmol/mL人參皂苷Rg3與單胺氧化酶A一起孵育，總反應(yīng)體系1.0 mL，37.0 ℃保溫40 min后，測定其在360 nm波長下光密度值。通過在冰上冷卻控制反應(yīng)的終止，樣品保持在4 ℃下用PBS緩沖液透析14 h(更換3次)。空白組與陽性對照組進(jìn)行同樣操作，透析前后測定酶活性，判斷抑制劑對單胺氧化酶A的抑制活性類型，即可逆性或非可逆性。

2.2.2 人參皂苷Rg3的單胺氧化酶A抑制活性類型 反應(yīng)體積200 μL不變，固定反應(yīng)體系中酶溶液的量，改變底物和樣品濃度，以底物濃度倒數(shù)(1/[S])為X軸、反應(yīng)速率倒數(shù)(1/V)為Y軸，繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線，判斷人參皂苷Rg3對單胺氧化酶A可逆抑制類型，即競爭抑制、反競爭抑制、非競爭抑制或者是混合抑制。

2.3 人參皂苷Rg3對抑郁大鼠行為學(xué)及生化指標(biāo)的影響

2.3.1 動(dòng)物模型制備與分組 取雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(180.0±20.0)g，禁食12 h稱定質(zhì)量，用剃毛器剃除大鼠背部絨毛，間隔2 d剃除1次，實(shí)驗(yàn)前隨機(jī)分為空白組，UVB模型組，人參皂苷Rg3低、高劑量組(40.0、80.0 mg/kg)，每組10只。UVB照射劑量和造模方法與文獻(xiàn)[10-11]類似，分別將模型組SD大鼠放于自制的盒子中，使其固定背部朝上，期間禁食禁水。給藥組在UVB照射前30 min給予藥液，模型組與空白組同時(shí)給予生理鹽水。UVB輻射時(shí)，大鼠背部距離光源30.0～42.0 cm，照射劑量每次366.0 mJ/cm2，持續(xù)照射5 d，第6天后，每2 d進(jìn)行1次輻射，共14 d(10次)，總輻射劑量5.12 J/cm2。收集第14天空白組、UVB模型組及給藥組的血清樣品，于-80 ℃冰箱保存。

2.3.2 糖水偏好實(shí)驗(yàn) 糖水偏好是快感缺失的評價(jià)指標(biāo)。建模前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在安靜房間內(nèi)適應(yīng)含糖飲水。第1天給予大鼠兩瓶1.0%蔗糖水，第2天給予1瓶純水和1瓶1.0%蔗糖水，并在中間點(diǎn)更換兩瓶位置。禁食禁水24 h后，進(jìn)行動(dòng)物的基本自來水消耗試驗(yàn)，每只大鼠給予預(yù)定量的1.0%蔗糖水和純水，大鼠自由飲水24 h，并在中間時(shí)間更換兩瓶位置。24 h后統(tǒng)計(jì)大鼠飲水情況。計(jì)算糖水偏好率并取平均值。糖水偏好率計(jì)算公式如下。

2.3.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)反應(yīng)大鼠的絕望程度。制備圓柱形容器(直徑11.0 cm，高25.0 cm)，水深20.0 cm，水溫保持在(25.0±1.0)℃。將大鼠放于水中6 min，并記錄不動(dòng)時(shí)間，不動(dòng)標(biāo)準(zhǔn)為大鼠漂浮在水面，身體不掙扎。試驗(yàn)結(jié)束后，用毛巾擦干大鼠的毛發(fā)，保持體溫，清洗漂浮在水面上的糞便。

2.3.4 血清5-HT和皮質(zhì)酮水平測定 行為學(xué)測試后，進(jìn)行大鼠眼眶取血，取血2.0 mL，在4 ℃血液冷卻后3 000 r/min離心10 min，取上清-80 ℃保存，通過ELISA測定5-HT和CORT水平，嚴(yán)格遵循試劑盒說明書。

3 結(jié)果

3.1 人參皂苷的單胺氧化酶A抑制活性測定結(jié)果 單胺氧化酶是負(fù)責(zé)單胺神經(jīng)遞質(zhì)的代謝，影響大腦發(fā)育和功能的酶。由圖1可知，不同濃度的人參皂苷作用在相同濃度的酶和底物復(fù)合物中，人參皂苷Rg3具有較好的釋放底物，升高光密度的作用。從圖2可以看出，人參皂苷Rg3的IC50值為3.094 μmol/mL，對單胺氧化酶A具有較好的抑制效果。

圖1 不同濃度人參皂苷對單胺氧化酶A抑制作用

圖2 人參皂苷Rg3對單胺氧化酶A抑制活性結(jié)果

3.2 人參皂苷Rg3的單胺氧化酶A抑制活性動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果

3.2.1 人參皂苷Rg3的單胺氧化酶A結(jié)合可逆性分析 采用透析法測定酶-抑制劑復(fù)合物的游離度，研究人參皂苷Rg3的結(jié)合特性。將高濃度的人參皂苷Rg3與單胺氧化酶A孵育40 min，將酶-抑制劑復(fù)合物混合物在4 ℃的緩沖溶液中進(jìn)行透析，分析透析前后酶的活性(圖3)。在沒有抑制劑的情況下對單胺氧化酶A進(jìn)行對照反應(yīng)，結(jié)果顯示單胺氧化酶A在透析過程中喪失了約10.0%～15.0%的活性。5.0 μmol/mL的人參皂苷Rg3可以抑制95.0%以上的酶活性，透析后，超過70.0%的酶活性從酶-抑制劑復(fù)合物中恢復(fù)出來，這表明了人參皂苷Rg3對單胺氧化酶A的抑制是可逆的，形成了可分離的酶抑制劑復(fù)合物。而陽性藥(氯吉蘭)的結(jié)果顯示了與單胺氧化酶A的可逆性結(jié)合。

注：與透析前比較，**P<0.01。

3.2.2 人參皂苷Rg3的單胺氧化酶A可逆抑制活性類型 通過改變底物和樣品濃度來研究人參皂苷Rg3對單胺氧化酶的抑制類型，結(jié)果(圖4)表明，人參皂苷Rg3的系列曲線交于Y軸，隨著抑制劑濃度的增加，Km增大，Vmax不變，表明人參皂苷Rg3對單胺氧化酶A的的抑制類型屬于競爭性抑制[12-13]。

圖4 人參皂苷Rg3的單胺氧化酶A可逆抑制活性類型

3.3 糖水偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果 如表1所示，輻射第14、21天，與空白組比較，模型組大鼠糖水偏好降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，人參皂苷Rg3低、高劑量組大鼠糖水偏好均提高(P<0.05，P<0.01)。

表1 各組大鼠糖水偏好比較

3.4 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果 如表2所示，輻射第14、21天，與空白組比較，模型組大鼠不動(dòng)時(shí)間延長(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，人參皂苷Rg3低、高劑量組大鼠不動(dòng)時(shí)間均縮短(P<0.05，P<0.01)。

表2 各組大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間比較

3.5 血清5-HT、皮質(zhì)酮水平測定結(jié)果 由表3可知，與空白組比較，模型組大鼠血清5-HT水平降低(P<0.01)，血清皮質(zhì)酮水平升高(P<0.05)；與模型組比較，人參皂苷Rg3低、高劑量組大鼠血清5-HT水平均升高(P<0.01)，血清皮質(zhì)酮水平均降低(P<0.05)。

表3 各組大鼠血清5-羥色胺和皮質(zhì)酮表達(dá)的比較

4 討論

抑郁癥是一種以明顯而持久的情緒低落為主要特點(diǎn)的綜合性常見情感精神性疾病，早在我國古代文獻(xiàn)中多有記載，屬于中醫(yī)“郁證”范疇。雖然抑郁癥的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)學(xué)說是目前較為公認(rèn)的致病機(jī)制，但仍無法完全解釋抑郁癥的病理生理學(xué)機(jī)制。近年來，大量研究表明抑郁癥的發(fā)病率和HPA軸失調(diào)之間存在著一定的關(guān)系，而過度的應(yīng)激刺激可能是引發(fā)抑郁癥的主要因素[14]。UVB輻射可刺激機(jī)體產(chǎn)生炎癥，并生成大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)。而氧化應(yīng)激可導(dǎo)致HPA軸活化，通過下丘腦分泌促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素，并刺激促進(jìn)垂體前葉釋放促腎上腺皮質(zhì)激素，使腎上腺內(nèi)合成和釋放糖皮質(zhì)激素，使血漿中糖皮質(zhì)激素含量升高。糖皮質(zhì)激素可以與海馬組織中的特異性受體結(jié)合，促進(jìn)海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)立早基因的表達(dá)，作用于cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白，抑制腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的生成，破壞海馬的神經(jīng)可塑性，進(jìn)而導(dǎo)致抑郁癥[15]。本實(shí)驗(yàn)采用UVB輻射方法造模，與其他造模方法相比[16]，應(yīng)激法可較好地模仿臨床抑郁患者的癥狀，且本實(shí)驗(yàn)造模方法簡單易行、造模時(shí)間較短、成本低、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性及可控性較好。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用的UVB輻射動(dòng)物模型基本模擬了抑郁癥患者的情緒低落、快感缺乏、思維動(dòng)作遲鈍等抑郁表現(xiàn)和體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、HPA軸相關(guān)因子代謝異常等變化。

在行為學(xué)測試中，快感缺失和易產(chǎn)生絕望情緒反映了動(dòng)物的抑郁樣行為，蔗糖偏好和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)是行為學(xué)測試中的常用方法。糖水偏好率是快感缺失的主要指標(biāo)，有研究指出，糖水飲用量的減少能夠反映動(dòng)物的快感缺乏情況。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)反映了動(dòng)物在無法逃脫現(xiàn)有環(huán)境時(shí)的絕望狀態(tài)，通常以在水中不動(dòng)時(shí)間表示，時(shí)間越長，動(dòng)物越絕望。本研究中，人參皂苷Rg3灌胃可以提高模型大鼠糖水偏好率、縮短強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間，說明人參皂苷Rg3有明顯的抗抑郁效果。在抑郁患者中，HPA軸過度活躍，而皮質(zhì)酮是HPA軸的重要激素之一，它可以調(diào)節(jié)人體的代謝、認(rèn)知和情緒，尤其對焦慮和抑郁作用明顯。5-HT是抑郁相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)，當(dāng)其水平不足時(shí)，會(huì)使中腦邊緣系統(tǒng)、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和低位腦干的中線區(qū)的神經(jīng)元功能失調(diào)，從而出現(xiàn)抑郁癥狀。本研究中，人參皂苷Rg3治療可使模型大鼠血清中5-HT水平升高、CORT水平降低，表明人參皂苷Rg3對體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)和HPA軸具有一定的調(diào)節(jié)作用，這可能是改善UVB模型大鼠抑郁行為的作用機(jī)制之一。

綜上，本研究通過體外單胺氧化酶篩選出人參中抗抑郁作用單體皂苷Rg3，采用UVB連續(xù)照射建立抑郁動(dòng)物模型，經(jīng)行為學(xué)觀察及神經(jīng)內(nèi)分泌物質(zhì)的檢測，證明該模型模擬了抑郁癥患者常見行為學(xué)表現(xiàn)及血清中5-HT水平降低和皮質(zhì)酮水平增加等變化。給予人參皂苷Rg3組大鼠糖水偏好率增加、強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間縮短、5-HT水平增加、皮質(zhì)酮水平降低，表明人參皂苷Rg3有一定的抗抑郁效果，為繼續(xù)深入研究其作用機(jī)制提供了部分實(shí)驗(yàn)依據(jù)。