陶 靜， 周 銘*， 王玉婷， 熊 英

(1.武漢市肺科醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430030；2.武漢大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，湖北 武漢 430070；3.武漢市第五醫(yī)院藥學(xué)部，湖北 武漢 430050)

近年抑郁癥患者數(shù)量不斷攀升，持續(xù)的心境低落導(dǎo)致的自殘、自殺等行為對(duì)社會(huì)和個(gè)人造成了嚴(yán)重危害[1]。抑郁癥的發(fā)病機(jī)制有多種，很多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)中樞系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)失衡，神經(jīng)遞質(zhì)如五羥色胺(serotonin，5-HT)、多巴胺(dopamine，DA)、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)等的減少可能是導(dǎo)致抑郁的最主要原因[1-3]。目前，臨床治療抑郁癥的首選藥物是氟西汀，其主要是通過(guò)抑制突觸間隙對(duì)5-HT的攝取起效，且治療效果顯著[3-4]。為減少長(zhǎng)期服藥帶來(lái)的毒副作用，尋找天然、有效的活性藥物治療包括抑郁癥、精神分裂癥等神經(jīng)精神類疾病成為近年研究的熱點(diǎn)[5-8]。楊梅素(myricetin)主要存在于楊梅、山茶等植物中，其醇提物中富含大量楊梅素苷等物質(zhì)，具有抗氧化、抗衰老等生理活性，其還可以通過(guò)血腦屏障，對(duì)預(yù)防神經(jīng)退行性疾病等也有一定的功效[9-11]。然而，楊梅素是否具有抗抑郁作用尚不清楚，對(duì)慢性應(yīng)激刺激誘導(dǎo)的下丘腦-垂體-腎上腺軸功能失調(diào)，逆轉(zhuǎn)5-HT等遞質(zhì)的減少是否有調(diào)節(jié)作用也未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)復(fù)制小鼠慢性應(yīng)激抑郁模型，采用懸尾實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)估楊梅素對(duì)抑郁小鼠行為學(xué)的影響，與此同時(shí)，采用高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)中樞系統(tǒng)單胺遞質(zhì)5-HT、NE、DA水平，熒光分光光度法檢測(cè)MAO活性，初步探討楊梅素抗抑郁作用機(jī)制，為后續(xù)進(jìn)一步的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)昆明小鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量20～25 g，8周齡，購(gòu)自湖北省疾控中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(鄂)2008-0005，清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)。

1.2 試劑與藥物 楊梅素對(duì)照品(美國(guó)Sigma公司，純度>96%，批號(hào)72576)；鹽酸氟西汀片(禮來(lái)蘇州制藥有限公司，批號(hào)2079A)。5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、司立吉林(MAO-B)、氯吉林(MAO-A)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司(批號(hào)25002、1362500、H8502、M7441、M7316)。其他試劑均為分析純。臨用前，氟西汀、楊梅素分別用生理鹽水配制成1、5 mg/mL混懸液備用，并將后者稀釋1倍配制成低劑量(2.5 mg/mL)。

1.3 儀器 酶標(biāo)儀(上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司，型號(hào)KHB ST-360)；水浴鍋(鄭州科華儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)HH-600)；高效液相色譜儀(HPLC，日本島津公司，型號(hào)LC-20A)。

1.4 造模、分組及給藥

1.4.1 造模 采取文獻(xiàn)[6-7]報(bào)道的方法，每天下午15:00隨機(jī)給予小鼠晝夜顛倒(24 h)、禁食(24 h)、禁水(24 h)、4 ℃冰水游泳(5 min)、45 ℃熱烘(5 min)、潮濕飼養(yǎng)(潮濕墊料)慢性刺激中的1種，連續(xù)21 d，飼養(yǎng)環(huán)境為溫度(24±1)℃，相對(duì)濕度(60±10)%。

1.4.2 分組及給藥 50只小鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組，模型組，楊梅素高、低劑量組(50、25 mg/kg)，氟西汀組(10 mg/kg)，每組10只，除空白對(duì)照組外，其他各組小鼠造模同時(shí)每天上午灌胃給藥，劑量1.0 mL/100 g，連續(xù)21 d，空白對(duì)照組、模型組灌胃給予等量生理鹽水。

1.5 行為學(xué)評(píng)估

1.5.1 曠場(chǎng)試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[6-7]，于實(shí)驗(yàn)第7、14、21天灌胃給藥后1 h，將小鼠放入紙箱中(5×5格，500 mm×500 mm×300 mm)，記錄5 min內(nèi)直立次數(shù)和水平穿過(guò)格數(shù)。直立次數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為雙前爪同時(shí)抬起，水平穿過(guò)格數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為有3只及以上爪子同時(shí)穿越1個(gè)格子。

1.5.2 懸尾實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[6-7]，于實(shí)驗(yàn)第7、14、21天灌胃給藥后1 h，將小鼠尾巴末端固定在1根橫木棒上，頭向下，身體倒立懸空，小鼠四周無(wú)攀抓物，觀察6 min內(nèi)小鼠活動(dòng)情況，并記錄后5 mim內(nèi)小鼠懸尾不動(dòng)的時(shí)間。

1.5.3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[6-7]，于實(shí)驗(yàn)第7、14、21天灌胃給藥后1 h，將小鼠置于1個(gè)高20 cm、直徑15 cm的透明容器內(nèi)，提前注入(25±2)℃溫水，水位達(dá)12 cm時(shí)停止，觀察6 min內(nèi)小鼠在容器中的游泳狀況，記錄后5 min內(nèi)游泳不動(dòng)時(shí)間，即小鼠漂浮在水面，偶爾移動(dòng)或四肢沒(méi)有運(yùn)動(dòng)，僅頭露在水面以上的時(shí)間。

1.6 HPLC法測(cè)定小鼠大腦單胺遞質(zhì)水平 于實(shí)驗(yàn)第21天完成行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，斷頭處死各組小鼠，冰上迅速剝離腦組織，稱定質(zhì)量后置于冷凍管中保存，加入0.1 mol/L過(guò)氯酸(4 ℃預(yù)冷，含0.3 mmol/L的EDTA-2Na、0.5 mmol/L亞硫酸鈉)，冰上組織勻漿，置于4 ℃冰箱中避光靜置5 min后10 000 r/mim離心10 min，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，自動(dòng)進(jìn)樣20 μL，色譜條件參考文獻(xiàn)[12]，即Diammonsilim C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相100 mmol/L的枸櫞酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.0)-0.1 mmol/L EDTA-16%甲醇；體積流量0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm。

1.7 熒光分光光度法檢測(cè)小鼠大腦單胺氧化酶活性 根據(jù)文獻(xiàn)[13]方法，冰上分離小鼠腦組織，稱定質(zhì)量，按1∶9比例加入預(yù)冷磷酸緩沖液(pH 7.8，0.05 mol/L)組織勻漿，取2.5 mL磷酸緩沖液，依次加入0.4 mL 20%Triton、0.2 mL勻漿液，振蕩混勻后置于37 ℃水浴鍋中孵育10 min，加入1 μmol/L MAO-B或MAO-A抑制相應(yīng)的MAO，再加入30 μL終濃度為22 μmol/L的底物，在37 ℃下孵育30 min，最后加入0.2 mL 5 mol/L高氯酸終止反應(yīng)并離心，取0.5 mL上清液，加到2.5 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液中，采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定最終產(chǎn)物4-氫喹啉的熒光強(qiáng)度(激發(fā)光318 nm，發(fā)射光380 nm)。

2 結(jié)果

2.1 楊梅素對(duì)抑郁小鼠行為學(xué)的影響 如圖1所示，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠7 d后水平穿越格數(shù)由(92.32±19.73)下降至(54.32±28.14)格，直立次數(shù)也由(21.45±16.81)次減少至(8.73±6.05)次，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，第14天及第21天，模型組小鼠水平穿越格數(shù)和直立次數(shù)均減少(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，給予25、50 mg/kg楊梅素后小鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中水平穿格數(shù)和直立次數(shù)均增加(P<0.01)，自主活動(dòng)量恢復(fù)超過(guò)70%，接近氟西汀組。

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01。

如圖2～3所示，第7天模型組小鼠懸尾不動(dòng)時(shí)間較空白對(duì)照組從(91.06±22.14)s延長(zhǎng)至(138.35±40.43)s，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，游泳不動(dòng)時(shí)間為(190.36±27.65)s，較空白組延長(zhǎng)了約70 s(P<0.05)，第14、21天，模型組小鼠懸尾和游泳不動(dòng)時(shí)間幾乎是空白對(duì)照組的2倍；楊梅素干預(yù)后，第7天懸尾及游泳不動(dòng)時(shí)間減少至90 s或更短，第14、21天，小鼠抑郁不動(dòng)狀態(tài)得到改善，懸尾、游泳不動(dòng)時(shí)間下降了50～100 s(P<0.05，P<0.01)，其中50 mg/kg楊梅素效果與10 mg/kg氟西汀類似。

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.2 楊梅素對(duì)小鼠大腦單胺遞質(zhì)水平的影響 如表1所示，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠5-HT、NE、DA水平均降低(P<0.01)；與模型組比較，25、50 mg/kg楊梅素干預(yù)后小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、NE、DA水平升高(P<0.01)，以高劑量更顯著。

表1 各組小鼠大腦單胺類遞質(zhì)水平

2.3 小鼠下丘腦單胺氧化酶活性 如表2所示，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠MAO-A、MAO-B活性升高(P<0.01)；楊梅素干預(yù)后，小鼠下丘腦MAO-A、MAO-B活性被抑制(P<0.05，P<0.01)，以高劑量組更顯著。

表2 各組小鼠下丘腦單胺氧化酶活性

3 討論

有研究采用慢性不可預(yù)知刺激大鼠后，其自主行為相關(guān)指標(biāo)減少近30%，表明慢性不可預(yù)知刺激可造成動(dòng)物抑郁行為[14]。本文得到了類似的結(jié)果，小鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中自主活動(dòng)量減少了30%～50%，抑郁造模成功；這和張業(yè)奇等[7]研究結(jié)果一致，小鼠在不可預(yù)知刺激后反應(yīng)遲鈍、動(dòng)作緩慢，水平和直立活動(dòng)均大幅度下降。懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的不動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)短可以反映小鼠的抑郁、絕望狀態(tài)。模型組懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，表現(xiàn)出精神運(yùn)動(dòng)性抑制、興趣喪失等癥狀，與Jin[5]、張華林等[14]研究結(jié)果類似，說(shuō)明小鼠在不可預(yù)知刺激后抑郁，自主行為減少。給予楊梅素干預(yù)后，抑郁小鼠自主活動(dòng)明顯改善，懸尾和游泳不動(dòng)時(shí)間縮短，楊梅素有效地預(yù)防并改善了小鼠抑郁狀態(tài)，且療效與劑量相關(guān)，這和許騰[8]、張華林[14]、Yu等[15]的研究結(jié)果相符，中藥類物質(zhì)如皂苷、黃酮等改善抑郁行為具有一定的劑量依賴性，高劑量組抗抑郁效果優(yōu)于低劑量組。本文首次發(fā)現(xiàn)楊梅素可以改善慢性應(yīng)激刺激誘導(dǎo)的小鼠抑郁行為改變，證實(shí)其具有抗抑郁樣作用。

單胺遞質(zhì)假說(shuō)提出，中樞系統(tǒng)單胺遞質(zhì)5-HT、NE、DA的缺乏是抑郁癥發(fā)生發(fā)展的重要基礎(chǔ)之一。下丘腦5-HT、NE和DA系統(tǒng)在生理活動(dòng)的調(diào)控方面發(fā)揮了重要作用，具體包括睡眠、情緒及食欲等[16-17]；而其缺乏、不足會(huì)直接或間接影響中樞對(duì)應(yīng)的5-HT受體、α/β受體、DA受體功能從而導(dǎo)致精神異常、抑郁情緒或遲滯行為[15-17]。大多數(shù)抗抑郁藥物都是通過(guò)提高大腦單胺遞質(zhì)水平起效，在不同劑量藥物治療干預(yù)下，小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、NE和DA水平與模型組比較有了大幅回升，尤其是高劑量組小鼠單胺遞質(zhì)水平回升更顯著。這可能得益于天然組分藥物作用于中樞系統(tǒng)如多巴胺受體、單胺氧化酶等發(fā)揮神經(jīng)調(diào)節(jié)作用[18]，楊梅素也可使中樞5-HT、NE和DA等神經(jīng)遞質(zhì)上調(diào)發(fā)揮抗抑郁作用。

當(dāng)大腦中樞MAO活性被抑制后，動(dòng)物的抑郁狀態(tài)會(huì)得到改善[18]，MAO-A主要氧化降解去甲腎上腺素和5-HT；而MAO-B主要氧化降解多巴胺和兒茶酚胺等[19]。因此本文還檢測(cè)了各組小鼠大腦單胺氧化酶的活性變化，與Wang等[18]報(bào)道類似，楊梅素高劑量組小鼠下丘腦MAO-A和MAO-B活性明顯被抑制，說(shuō)明中藥提取物可有效抑制中樞MAO活性，緩解單胺遞質(zhì)耗竭。楊梅素通過(guò)抑制下丘腦MAO活性，使得中樞系統(tǒng)參與行為、情緒活動(dòng)調(diào)節(jié)的神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、NE和DA水平上升，進(jìn)一步表明楊梅素對(duì)中樞系統(tǒng)的單胺神經(jīng)遞質(zhì)具有調(diào)節(jié)作用，可以逆轉(zhuǎn)應(yīng)激刺激導(dǎo)致的中樞系統(tǒng)單胺遞質(zhì)5-HT、NE和DA水平的下降。因此，楊梅素抗抑郁的作用可能是通過(guò)抑制MAO活性，上調(diào)中樞系統(tǒng)單胺遞質(zhì)的水平起效的。

楊梅素能通過(guò)抑制大腦單胺氧化酶MAO活性，提高中樞系統(tǒng)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、NE及DA水平，從而增加抑郁小鼠自主活動(dòng)量，縮短懸尾及游泳不動(dòng)時(shí)間，改善小鼠的抑郁行為和遲緩呆滯狀態(tài)，起到抗抑郁樣作用。高劑量(50 mg/kg)楊梅素治療效果和10 mg/kg氟西汀相當(dāng)，能夠預(yù)防并改善慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁樣行為，其可能的機(jī)制是抑制MAO活性，增加大腦中樞神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、NE及DA的水平。