鐘永怡 周泉 王家驥

【摘要】早孕因子（Early Pregnancy Factor，EPF）是一種存在于哺乳動物妊娠過程中的免疫抑制因子，目前認為是分子伴侶10（Cnp10）的同源物質(zhì)，是最早作為明確妊娠的一批生化指標之一。本文對EPF的發(fā)展歷程、來源、本質(zhì)和特性及其分離、純化、檢測和應用進行闡述，說明國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀及進展，并加以總結(jié)，了解到EPF不僅在超早期妊娠檢測中具有重要作用，在治療腫瘤和免疫相關(guān)疾病、胚胎移植、人工授精甚至在畜牧業(yè)中也起到重要作用。EPF的提純和檢測方面在近幾年取得明顯的成果，使EPF能運用于更廣泛的領(lǐng)域。

【關(guān)鍵詞】早孕因子、檢測方法、應用

早孕因子 （early pregnancy factor，EPF）是在妊娠早期哺乳動物血清中存在的一種分泌蛋白，由澳大利亞學者Morton等在1974年尋找一種用于移植的天然生物模型的實驗中意外發(fā)現(xiàn)。由于它在受精后6～14小時即能從母體血清中檢測到，因此被認為是確定妊娠的最早的生化指標之一。

1 ?早孕因子本質(zhì)

早孕因子（EPF）是一種具有免疫抑制、耐熱、耐透析和較強耐酸堿性質(zhì)的糖蛋白，且無物種特異性，大部分動物EPF相對分子質(zhì)量約在10 000～450 000[1]。1991年Clarke[2]等研究認為EPF活性的表達是由硫氧還原蛋白（thioredoxin，TRX）與孕婦血清共同作用除去RITS抗體，引起EPF活性的表達，從而證明EPF在試驗中只起到調(diào)節(jié)作用。Aranha[3]通過實驗測得孕婦淋巴細胞中存在EPF活性，認為在孕婦懷孕期間EPF可能是FC受體樣分子。2004年Cheng等[4]首次在孕婦宮頸粘液中發(fā)現(xiàn)EPF活性，血清中觀察到的平行變化，可能是用于評估胚胎活力的另一個有用的指標。往后的眾多實驗表明，EPF的活性并非由單一因素引起，而是通過各種早孕因子影響要素共同作用產(chǎn)生的生物活性。

1994年Cavanagh[5]通過研究確定EPF是熱休克分子家族的成員，并執(zhí)行細胞外分子伴侶的作用。Morton等[6]認為EPF與細胞外伴侶蛋白10（Cpn10）屬于同源物質(zhì)。Cpn10是在小鼠線粒體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種起著分子伴侶作用修飾其他蛋白質(zhì)的物質(zhì)，但是并不能通過花環(huán)抑制試驗，2000年Kawamura等[7]通過檢測不同階段的Cpn10和Cpn60mRNA在卵母細胞和胚胎中的表達，用花環(huán)抑制試驗對大鼠Cpn10的EPF活性進行評價，結(jié)果提示每個階段卵母細胞和胚胎中均檢測到Cpn10和Cpn60的相同mRNA表達水平，而在正常細胞的CPN 10中沒有檢測到EPF活性。由于使用多克隆抗體免疫沉淀CPN 10不影響孕鼠血清EPF活性，所以證明Cpn10與EPF并非相同的物質(zhì)。

2 ?早孕因子來源

EPF最初是從孕鼠受精后4～6小時的血清中發(fā)現(xiàn)，1974年Morton等[8]科學家首次發(fā)現(xiàn)在孕鼠交配后6h產(chǎn)生的一種具有生長因子性質(zhì)的蛋白質(zhì)，且能使T淋巴細胞產(chǎn)生玫瑰花環(huán)的過程受阻，由此產(chǎn)生了檢測EPF的經(jīng)典實驗方法——玫瑰花環(huán)抑制試驗（RIT）。隨后也在豬受精后4小時，綿羊6小時，牛24～26小時的血清中發(fā)現(xiàn)EPF，1983年Rolfe等[9]在所有11例非感染性腫瘤患者和10例精原細胞瘤患者中，檢測到tEPF或其自由組分tEPF-A和tEPF-B。在健康男性對照組和非生殖細胞腫瘤或良性睪丸疾病患者的血清中未檢測到，推測EPF可能是生殖細胞瘤的一個腫瘤標志物。1997年Lash等[10-11]通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，胚胎條件培養(yǎng)基、血小板活化因子和皮質(zhì)顆粒釋放培養(yǎng)基都可以通過雌性小鼠卵巢和輸卵管刺激早期妊娠因子的產(chǎn)生，這種刺激被血小板激活因子受體拮抗劑的存在完全阻斷，實驗表明血小板活化因子是受精卵釋放的卵因子，啟動早孕因子合成。

3 ?EPF的分離、純化和檢測

3.1 EPF分離、純化

在EPF發(fā)現(xiàn)后的這么多年里，至今未發(fā)現(xiàn)成功高效分離純化EPF的例子。但是在近幾年EPF的純化率比起以前有了提高。目前EPF活性物質(zhì)大多數(shù)是從妊娠母體的血清中獲取。但由于EPF的來源、實驗室條件等限制，EPF的特性也各不相同，分離和純化的方法也有所區(qū)別，目前天然EPF主要純化方法仍以層析和過濾為主。2012年溫志峰等[12]對正常早孕婦女血清中早孕因子（EPF）的分離純化過程進行優(yōu)化，采用兩步法，依次使用DEAE Fast Flow 離子交換色譜和 Heparin Fast Flow 親和色譜，從妊娠 12 周內(nèi)的正常早孕婦女混合血清中提純EPF，明顯提高了純化效率。隨著基因工程的發(fā)展，EPF的氨基酸序列已經(jīng)被破解，已經(jīng)有人通過基因工程制備出重組EPF，其性質(zhì)與天然提取的EPF并無區(qū)別。2002年Morton等[6]分別用重組原核和真核表達系統(tǒng)制備重組EPF，以兩種產(chǎn)品和天然EPF比較生物活性，他們發(fā)現(xiàn)兩者免疫抑制性質(zhì)無顯著差異。吳曉亮、鄭瑋璐[13-14]利用基因工程技術(shù)制備EPF重組蛋白。練玉銀、杜曉明、劉云等[15-17]利用基因工程技術(shù)克隆出了EPF 基因，從而獲得了大量具有良好生物學特性的 EPF 重組蛋白，有利于更好的幫助了解母體對胚胎是否產(chǎn)生免疫耐受。吳曉亮[13]、劉云[17]和劉靜靜[18]分別以小鼠、奶牛和綿羊為實驗對象利用基因工程制備出EPF單克隆抗體，為早孕診斷試劑的開發(fā)和某些惡性腫瘤的早期診斷奠定基礎。

3.2 EPF檢測

對于EPF活性的檢測大部分人一直沿用最初的RIT法，但是此法缺點十分明顯：實驗操作復雜、需要條件不易控制且耗時長，最重要的是所得結(jié)果人為主觀性較強，因此人們一直探尋更好的檢測方法。1997年Fan等[19]通過實驗明確超早期妊娠可以通過檢測孕婦血清中排卵后2天的EPF活性，精度為88.6%，這為妊娠期婦女意外終止妊娠或意外懷孕的婦女提供了診斷依據(jù)，有助于計劃生育。2000年Ohnuma等[20]將玫瑰花環(huán)試驗應用于馬，并提出此方法是有用的馬懷孕診斷標準。2000年張冬云等[21]采用DEAE 纖維素離子交換層分析，S-Sepharosefastflow離子交換層析，ConA-SepharoseCl4B親和層析，Heparin-SepharoseCl6B親和層析等方法進行純化，利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和等電聚焦電泳法分別檢測肽圖和等電點，結(jié)果與國內(nèi)外報道的從孕婦血清中提取的EPF活性一致。2003年孫文東等[22]采用硫酸銨分級沉淀、DEAE-Sepharose、CM-Sepharose柱層析、玫瑰花環(huán)抑制滴度試驗、SDS- PAGE和等電聚焦等技術(shù)對 EPF進行生化特性的研究，結(jié)果與國內(nèi)外相關(guān)研究一致。盡管檢測方法在眾多學者研究下的不斷成熟完善，但仍需不斷尋找更優(yōu)越、簡便和實用的方法。

4 ?EPF的應用研究

4.1 臨床應用

4.1.1 超早期妊娠診斷

由于能夠在動物受精后較短時間內(nèi)檢測出EPF活性，這比檢測到人絨毛膜促性腺激素升高的時間要早很多，F(xiàn)an等[23]通過研究得出利用RIT試驗檢測EPF，陽性率為 88.6%，假陽性率為 17.1%，假陰性率為 3.4%，而檢測此時的HCG水平則很低，并且EPF在血液循環(huán)中活性相對更明顯。因此EPF適合于超早期妊娠的診斷，能提前確認妊娠情況和對胚胎進行觀察，有針對性的對孕婦進行保健服務。且在近幾年制備出的EPF單克隆抗體使得EPF的準確檢測提供可能。

4.1.2 腫瘤的早期診斷

1997年Fan[23]研究表明，診斷惡性滋養(yǎng)層的腫瘤可通過檢測EPF樣活動以及精度91.3%EPF樣活動可以作為區(qū)分良性和惡性腫瘤滋養(yǎng)層的指標。目前可以通過RIT試驗測定 EPF的值，可以診斷膀胱癌、黑色素瘤、絨癌、惡性葡萄胎等 4 種腫瘤血清和惡性葡萄胎清宮人流血及黑色素瘤[14]，因此用檢測EPF活性來對早期腫瘤及判斷是否為惡性腫瘤是可行的，且具有較高準確率。

4.1.3 腫瘤的治療

1990年Quinn等[24]通過在接種 MCA-2 腫瘤細胞的小鼠的體內(nèi)每天注射四次抗EPF IGM，每次500ug，發(fā)現(xiàn)13天后EPF及tEPF的特異性抗體能清除所有tEPF活性腫瘤細胞，提出EPF是培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化腫瘤細胞生長的產(chǎn)品。除此，也有人提出利用熒光標記后的EPF單克隆抗體攜帶治療藥物，直接作用于癌癥病灶。因此，利用EPF的特性治療相關(guān)腫瘤具有廣闊的前景。

4.2 其他應用

2015年卜建華[25]認為可以將EPF應用于畜牧業(yè)，用于發(fā)現(xiàn)奶牛屢配不孕的難題，能提前知曉是卵巢疾病還是公牛精子的原因?qū)е虏辉?。若是配種后發(fā)現(xiàn)無EPF活性，這說明是由于受精導致不孕，若是配種后EPF升高，隨后降低至陰性水平，提示死胎。除此以外，EPF可應用于潰瘍、類風濕、胚胎移植和人工受精方面的治療。

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作者簡介

鐘永怡（1993-），女，漢族，廣東清遠，碩士研究生，廣州華立科技職業(yè)學院， 511325 ，公共衛(wèi)生與預防醫(yī)學。

本文系：醫(yī)養(yǎng)結(jié)合技術(shù)研究所（HLZ142010）;