彭雨萌，宗來斌，董曉燕，金大智，呂火烊

1.蚌埠醫(yī)學(xué)院研究生院，安徽蚌埠 233030 ；2.浙江大學(xué)附屬第四醫(yī)院檢驗科，浙江義烏 322000 ；3.浙江省中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江杭州 310053 ；4.杭州醫(yī)學(xué)院檢驗醫(yī)學(xué)院，浙江杭州 310053 ；5.浙江省人民醫(yī)院/杭州醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)檢驗中心，浙江杭州 310014

近年來，隨著器官移植、腫瘤、艾滋病和重癥監(jiān)護室患者的增多，臨床免疫抑制劑和激素使用增多以及抗菌藥物的濫用，絲狀真菌感染的發(fā)病率呈上升趨勢[1-3]。由于絲狀真菌對一些常用的抗真菌藥物存在天然耐藥，且不同種類的絲狀真菌具有不同的耐藥譜，因此絲狀真菌鑒定到種水平在疾病的診治中至關(guān)重要[4-6]。目前絲狀真菌的檢測方法以形態(tài)學(xué)為主，但是絲狀真菌培養(yǎng)所需時間較長，且形態(tài)學(xué)方法易受檢驗人員主觀因素的影響，具有一定的不準(zhǔn)確性。血清學(xué)檢測雖然對真菌病的輔助診斷具有一定的參考意義，但是其靈敏度和特異度較差，在臨床診斷中無確診意義[7-8]。分子生物學(xué)檢測目前雖然作為絲狀真菌檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但是因其操作煩瑣、需特殊實驗室、價格昂貴等原因，目前并未在臨床檢測中普及[9-10]。基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)技術(shù)因其簡便、快速和準(zhǔn)確地鑒定到種水平而得到廣泛應(yīng)用[11-12]。MALDI-TOF MS技術(shù)檢測絲狀真菌步驟包括點靶、前處理和上機，但由于絲狀真菌細(xì)胞壁較厚，不易被破壞提取蛋白，因此前處理是此方法中的關(guān)鍵步驟。目前用于絲狀真菌前處理的試劑有自配試劑和商品化試劑盒，本研究比較自配試劑和VITEK MS 絲狀真菌試劑盒在絲狀真菌質(zhì)譜鑒定中的準(zhǔn)確率，旨在為臨床摸索出最優(yōu)選擇。

1 材料與方法

1.1菌株來源 從2019年1月至2020年3月浙江省人民醫(yī)院住院患者的痰液、肺泡灌洗液、纖支鏡刷取物、胸腔積液、眼分泌物、血液等培養(yǎng)分離出47株絲狀真菌。

1.2儀器與試劑 VITEK MS質(zhì)譜儀(采用VITEK MS V3.0數(shù)據(jù)庫)、VITEK MS-CHCA基質(zhì)液購自法國生物梅里埃公司，甲酸和乙腈溶液購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，VITEK MS 絲狀真菌試劑盒-Ref.415680購自梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司，沙氏葡萄糖瓊脂(SDA)購自杭州濱和微生物試劑有限公司，DNA提取試劑盒購自北京天根生化公司。

1.3分子生物學(xué)鑒定 按照DNA提取試劑盒說明書進行核酸提取，將所提取的核酸進行PCR擴增后將PCR產(chǎn)物送至廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗中心有限公司進行測序，引物的堿基序列為ITS1 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4的堿基序列為 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，測序結(jié)果采用BLAST序列分析工具進行分析，獲得絲狀真菌菌種鑒定結(jié)果。當(dāng)測試結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的同源性達到98%時，認(rèn)為結(jié)果可靠，選擇同源性最高的結(jié)果作為菌種的最終結(jié)果。

1.4質(zhì)譜技術(shù)鑒定

1.4.1自配絲狀真菌前處理試劑 配制70%甲酸：用蒸餾水和購買的甲酸試劑配制成70%甲酸溶液，甲酸易揮發(fā)，每次使用需現(xiàn)配現(xiàn)用。除去VITEK-MS V3.0數(shù)據(jù)庫中沒有的菌株，將剩余絲狀真菌接種在SDA培養(yǎng)基上，置于28 ℃溫箱中培養(yǎng)5 d，取直徑0.5 cm菌落置于900 μL 75%乙醇中靜置10 min，13 000 r/min離心2 min，棄上清液后靜置10 min，加入40 μL 70%甲酸渦漩振蕩10 min，再加入乙腈渦漩振蕩3 min，13 000 r/min離心2 min。每個標(biāo)本做3次平行實驗。取上清液1 μL置于靶板上，干燥后加入1 μL基質(zhì)液，干燥后上機鑒定，質(zhì)控菌株為ATCC8739,數(shù)據(jù)庫采用VITEK MS V3.0版。3次平行實驗取可信度最高的結(jié)果為最終鑒定結(jié)果，與分子生物鑒定結(jié)果一致，則認(rèn)為質(zhì)譜鑒定結(jié)果正確，否則認(rèn)為不正確。

1.4.2VITEK MS 絲狀真菌試劑盒-Ref.415680 除去VITEK-MS V3.0數(shù)據(jù)庫中沒有的菌株，將剩余絲狀真菌接種在SDA培養(yǎng)基上，置于28 ℃溫箱中培養(yǎng)5 d，按照VITEK MS 絲狀真菌試劑盒-Ref.415680的操作說明書進行。每個標(biāo)本做3次平行實驗。提取上清液后點靶、上機，結(jié)果判讀同上。

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1分子測序結(jié)果 47株絲狀真菌包括煙曲霉24株、黃曲霉5株、土曲霉4株、黑曲霉3株、構(gòu)巢曲霉2株、亮白曲霉2株、聚多曲霉1株、茄病鐮刀菌復(fù)合群1株、尖端賽多孢1株，裂褶菌1株，海豚鐮刀菌1株，小孢頭束霉1株，微紫青霉1株。

2.2自配試劑與商品試劑盒質(zhì)譜鑒定準(zhǔn)確率的比較 除去VITEK-MS V3.0數(shù)據(jù)庫中沒有的4種菌株(裂褶菌、海豚鐮刀菌、小孢頭束霉、微紫青霉)，剩余43株。43株絲狀真菌進行質(zhì)譜鑒定，自配試劑質(zhì)譜鑒定準(zhǔn)確率為88.37%，商品化試劑盒質(zhì)譜鑒定準(zhǔn)確率為95.35%，兩者準(zhǔn)確率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 不同前處理試劑的質(zhì)譜鑒定結(jié)果比較

2.3分子測序及質(zhì)譜鑒定菌株結(jié)果 43株絲狀真菌分子生物學(xué)測序以及使用兩種不同試劑提取絲狀真菌蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果見表2。

表2 菌株鑒定結(jié)果(n)

3 討 論

MALDI-TOF MS是基于細(xì)菌和真菌的蛋白質(zhì)量而獲得不同指紋圖來達到鑒別細(xì)菌和真菌的目的。該技術(shù)近年來被普遍認(rèn)為是一種簡便、快捷、高效、經(jīng)濟、準(zhǔn)確的微生物病原學(xué)檢測方法，對絲狀真菌引起的相關(guān)感染具有準(zhǔn)確鑒定的臨床意義[13-16]。絲狀真菌細(xì)胞壁較厚，不易被破壞，蛋白質(zhì)提取難度較大，因此前處理在質(zhì)譜鑒定中至關(guān)重要。本研究探討了自配前處理試劑和商品試劑盒質(zhì)譜鑒定結(jié)果的差異。

目前，MOLDI-TOF MS應(yīng)用于絲狀真菌鑒定在臨床微生物檢測中并未普及，主要因其缺乏簡單、可重復(fù)、統(tǒng)一的蛋白質(zhì)提取程序。不同蛋白質(zhì)提取方法的質(zhì)譜鑒定準(zhǔn)確率差異較大，本研究采用甲酸乙腈法提取絲狀真菌蛋白，應(yīng)用自配試劑和商品化試劑盒兩種不同的試劑提取絲狀真菌蛋白，比較兩種試劑所提取的絲狀真菌蛋白質(zhì)譜結(jié)果是否有差異。實驗結(jié)果表明，自配試劑提取蛋白質(zhì)譜鑒定準(zhǔn)確率為88.37%，商品化試劑盒提取蛋白質(zhì)譜鑒定準(zhǔn)確率為95.35%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。LAU等[17]采用磁珠法提取絲狀真菌蛋白，421株絲狀真菌通過此法提取蛋白的質(zhì)譜鑒定準(zhǔn)確率為88.9%，筆者認(rèn)為磁珠法可以提高質(zhì)譜鑒定準(zhǔn)確率，黃艷飛等[18]的研究也發(fā)現(xiàn)磁珠法較好，但是磁珠法較甲酸乙腈法更為復(fù)雜，且需氧化鋯-二氧化硅微珠，較單純使用甲酸乙腈法昂貴。雙甲酸夾心法提取絲狀真菌蛋白較甲酸乙腈法簡單、省時，蒼金榮等[19]使用雙甲酸夾心法提取絲狀真菌蛋白進行質(zhì)譜鑒定時，鑒定到種的準(zhǔn)確率為71.52%(113/158)，但是也有得到高鑒定準(zhǔn)確率的報道[20-21]，質(zhì)譜鑒定準(zhǔn)確率不同，可能跟實驗所用絲狀真菌的菌屬不同有關(guān)。雙甲酸法適用于曲霉屬和青霉屬等較容易破壁的絲狀真菌。CASSAGNE等[22]比較了5種不同絲狀真菌質(zhì)譜鑒定前處理流程，認(rèn)為甲酸乙腈法最理想。

本研究自配試劑甲酸乙腈未鑒定出的菌株為煙曲霉1株，黃曲霉1株，亮白曲霉2株，茄病鐮刀菌復(fù)合群1株；商品化試劑盒未鑒定出的菌株為亮白曲霉1株，茄病鐮刀菌復(fù)合群1株。雖然商品化試劑盒未鑒定出的菌株只有2株，而自配試劑甲酸乙腈未鑒定出5株，但兩種試劑相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。自配試劑甲酸乙腈提取絲狀真菌蛋白，對于臨床常見的絲狀真菌準(zhǔn)確率可達88.37%(38/43)，對于曲霉中最常見的煙曲霉的準(zhǔn)確率可達95.83%(23/24)，可滿足臨床微生物日常工作的需要。而且兩種試劑相比，自配試劑的價格較低，可以在不影響鑒定準(zhǔn)確率的情況下，為患者減輕經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。

本研究所涉及的菌株以及菌種較少，主要是曲霉屬，可能會對實驗產(chǎn)生一定的影響，但本研究對臨床日常工作的開展仍有一定意義，因為臨床最常見絲狀真菌感染是曲霉感染[23]。

綜上所述，自配試劑和商品化試劑盒兩種不同試劑提取絲狀真菌蛋白的質(zhì)譜鑒定準(zhǔn)確率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。自配試劑操作較簡單，且可以在不影響質(zhì)譜鑒定準(zhǔn)確率的前提下，提供一種價格更為低廉的檢測方法，為患者減輕經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。