何勇勇，方長(zhǎng)英，張青松

(1.宣城職業(yè)技術(shù)學(xué)院內(nèi)科教研室，安徽宣城 242000；2.宣城市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科)

肝細(xì)胞癌(肝癌)是發(fā)病率全球第六和中國(guó)第四的惡性腫瘤[1-2]，全球55.4 %的新發(fā)病例和53.9 %的死亡病例出現(xiàn)在中國(guó)，嚴(yán)重威脅我國(guó)居民健康[3]。目前肝切除術(shù)是肝癌患者首選的治療方法[4]，但由于肝癌惡性程度高，我國(guó)肝癌患者5年生存率僅為12.1 %[5]。因此，需要尋找檢測(cè)方便的分子標(biāo)志物用于肝癌早期的篩查，以便早發(fā)現(xiàn)早治療提高患者預(yù)后效果。

MicroRNA(miRNA)是小的非編碼RNA(長(zhǎng)度為19～25 nt)，源于70～80 nt的miRNA前體轉(zhuǎn)錄物，可通過(guò)與靶標(biāo)mRNA的3’非翻譯區(qū)(UTR)堿基配對(duì)相互作用使其降解或抑制其翻譯[6-8]。眾多研究顯示miRNA在各種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如新陳代謝、增殖分化、細(xì)胞凋亡、血管生成和人類致癌作用等[9]，這些研究結(jié)果提示miRNA可作為惡性腫瘤患者診療和預(yù)后判斷的候選分子標(biāo)志物。miR-378a-5p是miR-378a的兩條成熟鏈之一，以前稱為miR-378。前期的研究結(jié)果顯示miR-378a-5p可以提高細(xì)胞存活率，可促進(jìn)黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌的生長(zhǎng)和血管生成[10-11]；miR-378a-5p過(guò)表達(dá)會(huì)干擾有絲分裂的保真度，與乳腺癌的腫瘤發(fā)生有關(guān)[12]。本研究旨在檢測(cè)miR-378a-5p在早期肝癌患者和健康人群血清中的表達(dá)差異，分析其對(duì)肝癌早期篩查的診斷價(jià)值，并應(yīng)用CCK-8和Transwell實(shí)驗(yàn)觀察miR-378a-5p對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 選擇2017年12月至2020年7月在本院肝膽外科就診的64例肝癌患者作為研究對(duì)象(觀察組)，其中男性54例，女性10例；年齡30～70歲，平均(48.95±9.629)歲。觀察組患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)本人同意參加實(shí)驗(yàn)；(2)病理確診為肝細(xì)胞癌，TNM分期為Ⅰa和Ⅰb期[1]；(3)確診前未做治療；(4)無(wú)其他肝病(肝炎和肝硬化等)、惡性腫瘤、慢性病等。選取同期體檢的健康志愿者64人為對(duì)照組，其中男性54人，女性10人；年齡24～67歲，平均(48.69±8.884)歲。觀察組肝癌患者和對(duì)照組志愿者臨床資料完整，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，研究結(jié)果具有可比性。采集空腹靜脈血15 mL，觀察組患者術(shù)前2 d采集，對(duì)照組志愿者體檢時(shí)采集。樣本采集后3 000 r/min離心5 min取上清液至無(wú)酶EP管中，隨即將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA以備后用。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，觀察組和對(duì)照組參與者均簽署知情同意書(shū)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1血清MicroRNA提取和cDNA合成 取500 μL血清和600 μL Serum/Plasma miRNAReagent(北京百奧萊博)加入至無(wú)酶EP離心管中，充分混勻后15 000 r/min離心5 min，將上清移至新的無(wú)酶EP離心管，加入1 mL異丙醇震蕩混均，隨后將液體分批倒入吸附柱中，12 000 r/min離心30 s后棄去柱液，再用異丙醇和無(wú)水乙醇對(duì)吸附柱中的miRNA進(jìn)行洗滌，最后將吸附柱放入新的無(wú)酶EP管中，室溫靜置5 min待乙醇揮發(fā)完畢后，加入30 μL無(wú)酶ddH2O溶解miRNA，靜置后15 000 r/min離心3 min，洗脫后所得miRNA液體采用分光光度計(jì)測(cè)量RNA純度和濃度；按照TaqMan microRNA cDNA Synthesis Kit(北京百奧萊博)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取10 μL合格的miRNA液體加入2.5 μL 5×TaqMan miRNA RT Solution A，反應(yīng)條件為37 ℃ 30 min、85 ℃ 5 min，隨后再加入2.5 μL 10×PS TaqMan miRNA RT Primer、2.5 μL 10×TaqMan miRNA RT Solution B、7.5 μL無(wú)酶ddH2O，反應(yīng)條件為30 ℃ 5 min、55 ℃ 60 min、95 ℃ 5 min。合成的cDNA冰箱保存待用。

1.2.2Real-time PCR檢測(cè)血清中miR-378a-5p表達(dá)量 按照TaqMan microRNA qPCR Kit(北京百奧萊博)說(shuō)明書(shū)對(duì)血清中miR-378a-5p進(jìn)行擴(kuò)增。配制20 μL擴(kuò)增反應(yīng)體系：2 μL cDNA模板、4 μL 5×TaqMan qPCR Mix、0.4 μL 50×ROX Reference Dye、1 μL 20×miRNA TaqMan Assay、12.6 μL ddH2O，采用兩步法擴(kuò)增：95 ℃ 15 min；隨后95 ℃ 10 s、60 ℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。采用2-△△Ct方法計(jì)算血液中miR-378a-5p表達(dá)量。引物由上海吉瑪科技公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列如下：(1)miR-378a-5p：5′-CTCCTGACTCCAGGTCCTGT-3′；(2)內(nèi)參GAPDH：forward 5′-ATGTGCCGGACCTTGGAAG-3′, reverse 5′-CCTCGGGTTAGCTGAGAGATCA-3′。

1.2.3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) Huh-7細(xì)胞購(gòu)自海軍醫(yī)科大學(xué)臨床實(shí)驗(yàn)中心，采用10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。分別用過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pcDNA- miR-378a-5p(觀察組)和空白質(zhì)粒pcDNA-NC(對(duì)照組)轉(zhuǎn)染生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Huh-7細(xì)胞，48 h后real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效果，隨后制備單細(xì)胞懸液，應(yīng)用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)，以1×104細(xì)胞/孔種植在96孔板，分別于1 d、2 d、3 d、4 d、5 d后取出96孔板加入CCK-8使用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4侵襲實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前在Transwell小室上室中加入matrigel膠，凝固后待用。收集轉(zhuǎn)染pcDNA- miR-378a-5p和pcDNA-NC的Huh-7細(xì)胞，PBS洗滌后流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)，濃度調(diào)整至1×105/mL，取200 μL細(xì)胞液加入至Transwell小室上室中，下室加入600 μL含10 %胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，恒溫下培養(yǎng)，分別于12 h、24 h、36 h、48 h后取出Transwell小室，PBS洗滌后擦去未穿過(guò)膜的Huh-7細(xì)胞，甲醛固定后染色，顯微鏡觀察穿膜細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1血清miR-378a-5p表達(dá)及其與AFP對(duì)早期肝癌診斷價(jià)值分析 miR-378a-5p在早期肝癌患者血清中的相對(duì)表達(dá)量為(2.263±0.964)，顯著高于其在健康志愿者血清中的表達(dá)量(0.936±0.645)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.155,P<0.001)；ROC分析結(jié)果顯示采用血清miR-378a-5p表達(dá)量預(yù)測(cè)早期肝癌時(shí)，其曲線下面積為0.868(95 % CI: 0.806-0.931,P<0.001)，當(dāng)cut-off值為1.685，其敏感性和特異性為71.9 %和91.6 %，見(jiàn)圖1。血清AFP預(yù)測(cè)早期肝癌的ROC曲線下面積為0.851(95 % CI: 0.776-0.925,P<0.001)，當(dāng)cut-off值為17.35，其敏感性和特異性為75 %和100 %，見(jiàn)圖2。

圖1 血清miR-378a-5p表達(dá)對(duì)早期肝癌診斷的ROC分析

圖2 血清AFP表達(dá)對(duì)早期肝癌診斷的ROC分析

2.2血清miR-378a-5p和AFP聯(lián)合檢測(cè)對(duì)早期肝癌診斷價(jià)值分析 采用SPSS二元logitic回歸分析血清miR-378a-5p和AFP聯(lián)合檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表1，可得logitic回歸方程(logitic=-4.521+0.087×AFP+1.687×miR)，從而在SPSS中生成聯(lián)合因子具體數(shù)值(聯(lián)合因子=AFP+19.39×miR)。ROC分析結(jié)果表明血清miR-378a-5p聯(lián)合AFP檢測(cè)對(duì)早期肝癌預(yù)測(cè)的曲線下面積為0.950(95 % CI: 0.914-0.986,P<0.001)，當(dāng)cut-off值為61.52，其敏感性和特異性為81.3 %和100 %，見(jiàn)圖3。兩者聯(lián)合檢測(cè)篩選早期肝癌的效能優(yōu)于血清miR-378a-5p(Z=2.233,P=0.026)和AFP(Z=2.354,P=0.019)獨(dú)立檢測(cè)。

表1 血清miR-378a-5p和AFP聯(lián)合檢測(cè)二元logitic回歸分析

圖3 miR-378a-5p和AFP聯(lián)合檢測(cè)篩選早期肝癌的ROC分析

2.3血清miR-378a-5p表達(dá)與肝癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系 T檢驗(yàn)分析早期肝癌血清miR-378a-5p表達(dá)與病理參數(shù)間的關(guān)系，結(jié)果顯示其表達(dá)量與患者性別、年齡、AFP值高低、是否飲酒、有無(wú)乙肝病毒感染、有無(wú)肝硬化及腫瘤數(shù)目無(wú)相關(guān)性，與腫瘤大小(t=2.417,P=0.019)、肝癌細(xì)胞分級(jí)(t=4.860,P<0.001)和TNM分期(t=2.696,P=0.009)相關(guān)，見(jiàn)表2。

表2 血清miR-378a-5p表達(dá)與早期肝癌病理參數(shù)的相關(guān)性(n=64)

2.4miR-378a-5p過(guò)表達(dá)后Huh-7細(xì)胞增殖和侵襲增強(qiáng) 質(zhì)粒pcDNA- miR-378a-5p可有效促進(jìn)Huh-7細(xì)胞miR-378a-5p過(guò)表達(dá)[1 vs (2.191±0.070),t=17.04,P<0.001]；CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-378a-5p過(guò)表達(dá)后Huh-7細(xì)胞3 d后細(xì)胞增殖數(shù)目與對(duì)照組相比開(kāi)始增多(t=5.331,P=0.002)，4 d后生長(zhǎng)速度顯著增快(t=7.988,P<0.001)，見(jiàn)表3；Transwell實(shí)驗(yàn)表明質(zhì)粒促進(jìn)miR-378a-5p表達(dá)后，Huh-7細(xì)胞24 h后穿膜細(xì)胞數(shù)增多(t=2.553,P=0.043)，48 h后細(xì)胞侵襲能力顯著增強(qiáng)(t=7.643,P<0.001)，見(jiàn)表4。

表3 轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞增殖情況比較

表4 轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)比較

3 討論

肝細(xì)胞癌是一種病因和機(jī)制復(fù)雜的疾病，很難通過(guò)單一分子標(biāo)志物進(jìn)行診斷，即使血清AFP作為原發(fā)性肝癌唯一可接受的腫瘤標(biāo)志物也不能單獨(dú)用于診斷，因?yàn)樵缙诟伟┗颊逜FP假陰性結(jié)果高達(dá)40 %[13]，血清AFP需要和影像學(xué)陽(yáng)性結(jié)果結(jié)合使用。microRNA的發(fā)現(xiàn)為研究新型分子生物標(biāo)記物用于癌癥診斷開(kāi)辟了新視野。本研究的目的是檢測(cè)早期肝癌患者血清中循環(huán)miR-378a-5p的相對(duì)表達(dá)量，并評(píng)估其在早期肝癌診斷中的價(jià)值。

本研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，早期肝癌患者血清miR-378a-5p相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.001)，且腫瘤較大(>5cm)、肝癌細(xì)胞分級(jí)較差(Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí))、TNM分期Ⅰb期的早期肝癌患者血清miR-378a-5p表達(dá)水平顯著升高(P均<0.05)，說(shuō)明miR-378a-5p可能與肝癌進(jìn)展有關(guān)。為證實(shí)這一觀點(diǎn)，本研究利用pcDNA- miR-378a-5p質(zhì)粒促進(jìn)Huh-7細(xì)胞miR-378a-5p過(guò)表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-378a-5p過(guò)表達(dá)后Huh-7細(xì)胞增值和侵襲能力與對(duì)照組相比均出現(xiàn)增強(qiáng)，這些研究結(jié)果與Lee等人[14]的觀點(diǎn)一致。Lee等研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺腫瘤組織中miR-378a-5p相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常組織。為深入了解miR-378a-5p特性，該研究通過(guò)miR-378a-5p轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-378a-5p可通過(guò)與靶標(biāo)RNA結(jié)合抑制融合抑制因子(Sufu)表達(dá)，Sufu具有抑癌作用，其功能喪失會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞過(guò)度增殖。為進(jìn)一步了解miR-378a-5p在腫瘤生長(zhǎng)中的作用，將轉(zhuǎn)染了miR-378a-5p質(zhì)?；蚩瞻踪|(zhì)粒的U87細(xì)胞保持在無(wú)血清條件下的培養(yǎng)皿中，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了miR-378a-5p質(zhì)粒的U87細(xì)胞存活率增加而凋亡減少，隨后兩組細(xì)胞均被注射在裸鼠皮下，4周后注射轉(zhuǎn)染了miR-378a-5p質(zhì)粒細(xì)胞的小鼠皮下腫瘤直徑顯著大于注射轉(zhuǎn)染了空白質(zhì)粒細(xì)胞的小鼠，隨后將裸鼠皮下腫瘤切除并使用抗CD34抗體進(jìn)行免疫組化染色，由miR-378a-5p質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞形成腫瘤的血管密度高于由空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞形成腫瘤血管密度，其機(jī)制為miR-378a-5p可與miR-125a競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合VEGF的3'UTR區(qū)域并促進(jìn)VEGF表達(dá)。另一項(xiàng)研究[10]也發(fā)現(xiàn)miR-378a-5p過(guò)表達(dá)增強(qiáng)了黑色素瘤細(xì)胞體外侵襲和遷移能力，并促進(jìn)黑色素瘤形成新生血管結(jié)構(gòu)的能力，轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者腫瘤標(biāo)本中miR-378a-5p表達(dá)顯著上升，高表達(dá)miR-378a-5p的黑色素瘤患者藥物治療反應(yīng)降低。上述研究均證實(shí)了miR-378a-5p在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，可以促使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)而抑制其凋亡，同時(shí)還可以促進(jìn)腫瘤血管生成，這些結(jié)果說(shuō)明miR-378a-5p具有癌基因特征。

本研究最后利用ROC分析血清miR-378a-5p表達(dá)對(duì)早期肝癌的診斷價(jià)值，其結(jié)果顯示miR-378a-5p預(yù)測(cè)早期肝癌時(shí)，其曲線下面積為0.868，當(dāng)cut-off值為1.685，其敏感性和特異性為71.9 %和91.6 %；AFP預(yù)測(cè)早期肝癌的ROC曲線下面積為0.851，當(dāng)cut-off值為17.35，其敏感性和特異性為75 %和100 %；而miR-378a-5p聯(lián)合AFP檢測(cè)對(duì)早期肝癌預(yù)測(cè)的曲線下面積為0.950，當(dāng)cut-off值為61.52，其敏感性和特異性為81.3 %和100 %，Z檢驗(yàn)結(jié)果顯示兩者聯(lián)合檢測(cè)診斷早期肝癌的效能優(yōu)于血清miR-378a-5p和AFP獨(dú)立檢測(cè)(P均<0.05)。由此可見(jiàn)miR-378a-5p和AFP聯(lián)合篩查早期肝癌可取得較好的效果，加之血液樣本較肝癌組織容易獲得及血清miR-378a-5p和AFP檢測(cè)簡(jiǎn)單，miR-378a-5p和AFP聯(lián)合篩查早期肝癌有可能應(yīng)用于臨床。