謝德，楊彬，鄭錫鋒

廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科,廣東湛江 524001

大氣細(xì)顆粒物（PM2.5）則是大氣顆粒物中空氣動力學(xué)直徑＜2.5μm的部分，又稱為細(xì)顆粒物，現(xiàn)代流行病學(xué)調(diào)查及基礎(chǔ)研究均表明短期或長期暴露于大氣可吸入顆粒物PM2.5可導(dǎo)致人體多系統(tǒng)損害，特別是心血管系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)[1]。大氣顆粒物暴露能增加人群心血管疾病患病和病死的風(fēng)險[2]，特別是心肌梗死、高血壓、心律失常和心力衰竭[3-4]。Marchini等[5]的研究結(jié)果表明,暴露在PM2.5的時間與心率變異率(HRV)之間有正相關(guān)的關(guān)系。PM2.5組成復(fù)雜,PM2.5的主要作用是其到達(dá)肺泡后在肺泡中沉積,然后通過血液循環(huán)到達(dá)全身各個器官系統(tǒng),激活氧化應(yīng)激反應(yīng)誘發(fā)全身器官損害從而嚴(yán)重危害人體健康[6]。PM2.5到達(dá)肺泡組織后，被肺巨噬細(xì)胞吞噬,刺激巨噬細(xì)胞釋放炎性因子等誘發(fā)炎性反應(yīng)。這些炎癥因子會直接或間接導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷等[7]。顆粒物刺激產(chǎn)生的炎性因子及血管活性成分進(jìn)入血液循環(huán)后引發(fā)全身性氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)[8]。流行病學(xué)研究顯示，PM2.5與心血管系統(tǒng)疾病，特別是心肌梗死，有直接的關(guān)系。大量研究表明丹參多酚酸鹽可以通過血管炎性反應(yīng)達(dá)到保護(hù)心肌，減少心血管事件的發(fā)生。但對PM2.5所致心肌損傷丹參多酚酸鹽是否具有保護(hù)作用尚未得到證實，該研究通過PM2.5作用于大鼠，觀察是否引起氧化應(yīng)激以及心肌細(xì)胞凋亡，在藥物組大鼠使用丹參多酚酸鹽了解是否產(chǎn)生保護(hù)作用，從而闡明丹參多酚酸鹽在PM2.5導(dǎo)致心肌損傷的保護(hù)機(jī)制。報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥品與試劑

36只SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，戊巴比妥鈉鹽、烏拉坦、化學(xué)純，用生理鹽水配制成25%的溶液。肝素鈉注射液（2 mL∶12 500 U）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒購自南京建成生物工程研究所，TUNEL試劑盒，瑞士羅氏公司；丹參多酚酸鹽。

1.2 處理方法

PM2.5的收集和處理使用MODEL一120A型大容量采樣器(配合2.5μm的旋風(fēng)分級器，紀(jì)本電子)采集夏季市區(qū)主干道旁大氣中2.5μm以下的細(xì)顆粒物，吸氣流量為1.12 m3／min，連續(xù)2 d采樣，采集顆粒物樣品集中在玻璃纖維濾膜上。然后把濾膜剪成多個小塊，與超純水混合后超聲處理600 s，清除纖維濾膜。把顆粒物懸液在真空中冷凍干燥，稱取重量后采用低溫保存。在使用時加入0.9%氯化鈉溶液制成25 mg/mL的顆粒物懸液，在超聲下振蕩15 min，懸混勻液并滅菌。

1.3 大鼠分組與染毒

36只SPF級雄性SD大鼠隨機(jī)分為對照組，研究組，藥物組3組，每組12只；研究組大鼠經(jīng)氣管內(nèi)緩慢注入顆粒物懸液染毒（25 mg/kg劑量），每周染毒2次，連續(xù)染毒4周；對照組以0.9%氯化鈉溶液代替顆粒物懸液，藥物組除按25 mg/kg劑量經(jīng)氣管內(nèi)緩慢注入顆粒物懸液染毒，每周染毒2次，連續(xù)對大鼠染毒4周以外還同時給予丹參多酚酸鹽15 mg／kg體質(zhì)量灌胃，1次/d，連續(xù)4周。

1.4 檢測方法與指標(biāo)

應(yīng)用生物信號處理系統(tǒng)測定大鼠的心率和血壓；于腹主動脈取血，3 000 r／min離心10 min(離心半徑：26 cm)后取血清大鼠血清中SOD、MDA指標(biāo)測定嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。3組SD大鼠于第4周染毒后次日處死后立即取出心室心底部的心肌標(biāo)本，以4%多聚甲醛固定在12 h后用于TUNEL檢測心肌細(xì)胞凋亡。TUNEL心肌細(xì)胞凋亡檢測依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行，以及計算出心肌細(xì)胞凋亡比例（凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)×100.00%）[9]。采用DXC800全自動生化分析儀測定肌酸激酶和肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平。

1． 5統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 3組SD大鼠心率及血壓的對比

研究組大鼠的心率明顯高于對照組[(452±12)次/min vs(337±16)次/min]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。研究組大鼠平均動脈壓高于對照組大鼠[(112±5)mmHg vs(90±3)mmHg]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。藥物組心率及血壓為(403±19)次/min，(98±2)mmHg，與研究組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 不同組別大鼠的血壓及心率比較(±s)

表1 不同組別大鼠的血壓及心率比較(±s)

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2.2 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的比較

研究組大鼠的SOD、MDA與對照組比較分別為(11.38±3.02)U/mL vs(32.26±3.12)U/mL，(90.21±3.46)nmol/mL vs(40.25±3.02)nmol/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。研究組大鼠的SOD、MDA與藥物組比較分別為(11.38±3.02)U/mL vs(27.32±3.16)U/mL，(90.21±3.46)nmol/mL vs(72.12±3.12)nmol/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠SOD及MDA水平比較(±s)

表2 各組大鼠SOD及MDA水平比較(±s)

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2.3 各組大鼠酶學(xué)指標(biāo)比較

研究組與對照組肌酸激酶及CK-MB分別為(1 258±59)U/L vs(537±24)U/L，(296±31)U/L vs(132±27)U/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。藥物組大鼠血清中肌酸激酶及CK-MB含量分別為(863±24)U/L、(164±31)U/L，與研究組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。

表3 各組大鼠酶學(xué)水平比較[(±s),U/L]

表3 各組大鼠酶學(xué)水平比較[(±s),U/L]

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2.4 各組大鼠心肌凋亡比例的對比

研究組、對照組、藥物組大鼠心肌細(xì)胞凋亡比例分別為(3.85±1.03)%、(1.12±0.38)%、(2.05±0.12)%；對照組大鼠心肌細(xì)胞凋亡比例明顯低于研究組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，藥物組大鼠心肌細(xì)胞凋亡比例明顯低于研究組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表4。

表4 各組大鼠心肌凋亡比例比較[(±s),%]

表4 各組大鼠心肌凋亡比例比較[(±s),%]

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3 討論

隨著大氣污染日益嚴(yán)重，PM2.5作為污染源主要成分之一，日益受到人們關(guān)注。長時間吸入PM2.5可對心血管系統(tǒng)造成嚴(yán)重的損害。這種損害可以通過直接或間接的機(jī)制造成。目前對間接機(jī)制研究較多，主要是通過氧化應(yīng)激的機(jī)制形成氧自由基達(dá)到損害細(xì)胞組織的作用[10]。正常生理條件下，體內(nèi)的活性氧自由基（ROS）處在動態(tài)平衡的關(guān)系，ROS過多，超出體內(nèi)清除及調(diào)節(jié)能力時就會對細(xì)胞組織造成損害。PM2.5中的過渡金屬及有機(jī)物成分是促使細(xì)胞產(chǎn)生ROS的主要成分。ROS會引起細(xì)胞膜磷脂中的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),產(chǎn)生多量的氧化低密度脂蛋白(ox-LDL),而大量的ox-LDL則會引起動脈粥樣硬化。MDA是活性氧自由基與細(xì)胞膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)后的重要的產(chǎn)物。ROS能直接損害核酸,進(jìn)而引起DNA損傷,影響細(xì)胞的功能和周期。當(dāng)機(jī)體受到PM2.5刺激,產(chǎn)生過多的ROS活性氧自由基后，打破機(jī)體內(nèi)的氧化還原平衡，超氧化物歧化酶減少，ROS就會對各種生物大分子和各種細(xì)胞造成破壞，最終會導(dǎo)致心肌細(xì)胞等發(fā)生變化,從而引起高血壓、動脈粥樣硬化、心肌梗塞等心血管疾病[11-14]。這可能是研究組大鼠ROS激活后導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷后引發(fā)肌酸激酶及肌酸激酶同工酶升高同時血壓升高的原因。而研究組的MDA較其他兩種升高也表明ROS在PM2.5損害心肌細(xì)胞機(jī)制發(fā)揮的作用。流行病學(xué)研究也證實PM2.5與心肌梗死發(fā)病率呈現(xiàn)明顯正相關(guān)[15]。

ROS不僅引起心肌細(xì)胞損傷，還會促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[16-17]。主要是有活性氧直接損傷細(xì)胞DNA，上調(diào)凋亡基因的表達(dá)，下調(diào)抑凋亡基因表達(dá)，抑制SOD生成等機(jī)制共同作用[18-20]。羅斌等[20]研究表明不同的溫度暴露在PM2.5中的大鼠均有不同程度的MDA上升及SOD下降。既往研究表明暴露于PM2.5的患者收縮壓平均升高6 mmHg，動脈粥樣硬化斑塊面積增加，NADPH氧化酶活性上升。該研究中，研究組大鼠的血壓心率較對照組升高，可能與PM2.5導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激代謝物水平升高，心肌耗氧量上升，引起動脈粥樣硬化，從而刺激血壓及心率升高。研究組的MDA、心肌酶上升及心肌細(xì)胞凋亡增加，具有細(xì)胞保護(hù)作用的SOD減少，結(jié)合ROS對心肌損傷的機(jī)制表明，PM2.5引起ROS活性上升后，導(dǎo)致研究組大鼠的心肌細(xì)胞DNA損傷進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損害，引起心肌酶上升及細(xì)胞凋亡比例增加。已有多項研究表明丹參多酚酸鹽對血管具有抗氧化抗炎作用，可以減少心血管事件發(fā)生[21-22]。在吸入PM2.5的同時使用丹參多酚酸鹽的藥物組大鼠無論是MDA、還是血壓心率都較研究組大鼠明顯減低，SOD上升。表明丹參多酚酸鹽可以降低由PM2.5引起的ROS升高導(dǎo)致對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生的不良影響。同時藥物組大鼠的細(xì)胞凋亡比例及心肌酶也明顯下降，SDO升高，可能與丹參多酚酸鹽可以通過抑制ROS的活性減輕心肌耗氧量及動脈粥樣硬化等的機(jī)制起到心肌保護(hù)作用有關(guān)。

綜上所述，丹參多酚酸鹽可能對PM2.5誘發(fā)ROS活性升高而導(dǎo)致心血管損害這一作用通路方面有保護(hù)作用。