于 駿，武云浩，何 輝，李志然，付楊博，陳 霞，2

（1南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 226001；2南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科）

在真核生物中RNA剪接體可以去除絕大多數(shù)前體mRNA內(nèi)含子,并調(diào)控mRNA加工過程[1-2]。RNA剪接體參與多種疾病的發(fā)生,對細(xì)胞存活發(fā)揮至關(guān)重要的作用[3-5]。精子發(fā)生過程在果蠅和人類中高度保守[6-8],可以利用果蠅模型研究男性不育癥。本實(shí)驗擬采用UAS-Gal4系統(tǒng)構(gòu)建人—果蠅模型,在果蠅S2細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)人SNRPN(small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N)基因過表達(dá),觀察人SNRPN基因?qū)塖2細(xì)胞RNA剪接體的影響,為構(gòu)建人-果蠅相結(jié)合的研究模型奠定重要基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 pUAS-HA-hSNRPN質(zhì)粒構(gòu)建利用Vector NTI軟件設(shè)計引物,引物序列:F:5’-ATAAGAAT GCGGCCGCTATGACTGTTGGCAAGAGTAGCA-3’,R:5’-CTAGTCTAGACTAAGGTCTTGGTGGACGCAT-3’。PCR擴(kuò)增hSNRPN片段,產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳,割膠回收電泳產(chǎn)物,采用膠回收試劑盒(AP-GX-50,美國Axygen公司)純化PCR產(chǎn)物。用NotI和XbaI對純化產(chǎn)物和pUAS-attB-HA空載質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,并以T4連接酶連接,利用感受態(tài)細(xì)胞(DH5)對連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化,涂布于含有氨芐(Ampicillin)抗性的LB固體培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)過夜。挑選陽性菌落,采用質(zhì)粒小量DNA提取試劑盒(AP-MN-P-250,美國Axygen公司)提取質(zhì)粒,并對提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗證,并送測序比對。

1.2 S2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞在含10%胎牛血清(04-001-1ACS,以色列Bioind公司)的果蠅Schneider培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將S2細(xì)胞接種在6孔板上,待細(xì)胞生長至密度達(dá)到約80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。使用Effectene Transfection Reagent進(jìn)行轉(zhuǎn)染,每孔轉(zhuǎn)染0.8μg質(zhì)粒,將待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒與6.4μL Enhancer混合,buffer EC補(bǔ)足至100μL,振蕩混勻,靜置5 min。然后加入20μL Effectene Transfection Reagent混勻。最后加入600μL Opti-MEM,吹打混勻后加入細(xì)胞中,培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

1.3 Western blot檢測果蠅S2細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后收樣,加細(xì)胞裂解液PIPA,冰上靜置15 min,12 000 g,4℃離心15 min,取上清測定蛋白濃度。10%SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白,然后300 mA恒流2 h進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。分別用HA抗體(1∶1 000)和Tubulin抗體(1∶3 000)4℃孵育過夜,TBST洗膜3次,二抗室溫孵育1 h,再洗膜3次后進(jìn)行顯影。

1.4 免疫熒光染色果蠅S2細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后,接種于置有圓形玻璃爬片的24孔板內(nèi),繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行免疫熒光染色。4%多聚甲醛固定20 min,PBS洗滌3次。5%牛血清白蛋白(BSA)封閉30 min,加入U2A抗體(1∶1 000)室溫孵育1 h,PBS洗滌3次。然后熒光二抗室溫避光孵育1 h,Hoechst33342染核10 min。將圓形玻片置于普通載玻片上,加入抗熒光淬滅封片劑封片。通過熒光顯微鏡采集S2細(xì)胞免疫熒光圖片,圖片處理采用Adobe Photoshop CS5。

1.5 熒光定量PCR果蠅S2細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,采用TRIzol法提取RNA。采用Prime Script RT Reagent Kit(RR037A,日本Takara公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2 min,95℃變性15 s,60℃延伸20 s,共40個循環(huán)。每個基因的相對表達(dá)量按照內(nèi)參的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。GAPDH上游引物序列為5’-GTGGTGAACGGCCAGAAGAT-3’;下游引物序列為5’-GCCTTGTCAATGGTGGTGAA-3’。U2A上游引物序列為5’-GAGCTGAGCGACTTAGAGCC-3’;下游引物序列為5’-TACCGGGTTGATAAGCAGGC-3’。SmD3上游引物序列為5’-CGAGGCGGAGGACAACATGAAC-3’;下游引物序列為5’-GGCAGTATAAGGAATCGGATCTTGGAG-3’。SmB上游引物序列為5’-CATGAACTTGATCCTCGGCGACTG-3’;下游引物序列為5’-CCTCTGGCGGCGGTGGTC-3’。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。計量資料以±s表示,組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 構(gòu)建pUAS-HA-hSNRPN質(zhì)粒通過PCR擴(kuò)增hSNRPN CDS片段,利用NotI和XbaI酶切位點(diǎn)連入pUAS-attB-HA載體。通過雙酶切驗證和測序驗證確認(rèn)已經(jīng)成功構(gòu)建了pUAS-HA-hSNRPN質(zhì)粒。

2.2 Western blot檢測HA-hSNRPN融合蛋白在果蠅S2細(xì)胞中利用Ub-Gal4驅(qū)動pUAS-HAhSNRPN質(zhì)粒的表達(dá)。本實(shí)驗設(shè)置3組,分別為Control組、Ub-GAL4組、Ub+UAS-HA-hSNRPN組。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)Control組、Ub-GAL4組不表達(dá)HA-hSNRPN融合蛋白,而在Ub+UAS-HAhSNRPN組中可以檢測到HA-hSNRPN融合蛋白(圖1)。

圖1 Western blot檢測HA-hSNRPN融合蛋白

2.3 免疫熒光染色檢測HA-hSNRPN融合蛋白為了驗證Ub-Gal4是否成功驅(qū)動pUAS-HA-hSNRPN質(zhì)粒的表達(dá),本實(shí)驗通過免疫熒光染色方法檢測HA-hSNRPN融合蛋白在果蠅S2細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,Control組中未觀察到HA陽性細(xì)胞,而在Ub+UAS-HA-hSNRPN組中可見較多HA陽性細(xì)胞,提示HA-hSNRPN融合蛋白在果蠅S2細(xì)胞中成功表達(dá)(圖2,見封二)。

圖2 免疫熒光染色檢測HA-hSNRPN融合蛋白的表達(dá)情況

2.4 異位表達(dá)hSNRPN對RNA剪接體關(guān)鍵蛋白U2A的影響為了驗證hSNRPN基因?qū)NA剪接體關(guān)鍵蛋白U2A的影響,在果蠅S2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Ub-Gal4和pUAS-HA-hSNRPN質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)人SNRPN基因的異位表達(dá)。免疫熒光染色檢測顯示,與Control組相比,異位表達(dá)hSNRPN組U2A蛋白表達(dá)水平顯著降低,提示人SNRPN基因可以影響果蠅RNA剪接體關(guān)鍵因子U2A的表達(dá)水平(圖3,見封二)。

圖3 免疫熒光染色檢測U2A蛋白的表達(dá)水平

2.5 hSNRPN基因?qū)塕NA剪接體關(guān)鍵亞基表達(dá)水平的影響為了進(jìn)一步驗證hSNRPN對果蠅RNA剪接體的影響,異位表達(dá)hSNRPN后檢測了果蠅RNA剪接體關(guān)鍵亞基mRNA的相對表達(dá)水平。qRT-PCR結(jié)果顯示,與Control組相比,異位表達(dá)hSNRPN組U2A、SmD3、SmB mRNA相對表達(dá)水平明顯降低,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)(圖4),提示異位表達(dá)hSNRPN降低RNA剪接體關(guān)鍵亞基的表達(dá)水平。

圖4 RNA剪接體關(guān)鍵亞基表達(dá)水平

3 討 論

RNA剪接體是高度保守的剪接復(fù)合體,主要由5個小核糖核蛋白顆粒(SnRNP)復(fù)合物(U1、U2、U4、U5和U6)和150種以上的相關(guān)蛋白組成[9]。許多RNA剪接體的核心組分被證實(shí)參與調(diào)控果蠅生殖干細(xì)胞的自我更新和分化[10-12]。有研究表明,Sm復(fù)合體核心亞基SmD3以及剪接體-核糖體關(guān)聯(lián)蛋白Srlp可以通過RNA剪接體影響生殖干細(xì)胞的自我更新和分化過程[11-12]。有趣的是,RNA剪接體核心組分U2A在果蠅睪丸中影響精原細(xì)胞的分化過程,并可調(diào)控Mei-p26 mRNA的剪接[13]。SNRPA1既是U2A的人同源基因,也是人非梗阻性無精子癥研究中鑒定到的候選相關(guān)基因[13]。在果蠅睪丸中異位表達(dá)SNRPA1突變體導(dǎo)致果蠅睪丸精原細(xì)胞分化障礙,提示RNA剪接體在人和果蠅睪丸精原細(xì)胞分化過程中高度保守。

SNRPN基因是果蠅SmD3的同源基因,主要在前體mRNA加工過程中發(fā)揮重要作用,并可能參與調(diào)控組織特異的選擇性剪接[14]。有研究表明,SNRPN基因中CpG位點(diǎn)的甲基化模式可能與男性不育癥相關(guān)[15]。MTHFR和SNRPN啟動子區(qū)域的甲基化水平參與調(diào)控精子活力和精子形態(tài),并可能介導(dǎo)男性不育的發(fā)生[16]。體外實(shí)驗表明,下調(diào)SNRPN基因可顯著抑制髓母細(xì)胞瘤的細(xì)胞生長能力,并誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M期阻滯[17]。

本研究在果蠅S2細(xì)胞中構(gòu)建了RNA剪接體相關(guān)人同源基因的異位表達(dá)模型,并發(fā)現(xiàn)人SNRPN基因在果蠅和人類中高度保守,可以直接調(diào)控果蠅S2細(xì)胞RNA剪接體的功能,為深入理解功能保守性基因提供了新的研究模型。同時,我們也發(fā)現(xiàn)人SNRPN基因在果蠅S2細(xì)胞中與果蠅RNA剪接體核心組分存在相互競爭作用,為RNA剪接體在精子發(fā)生障礙中的作用機(jī)制研究提供新的線索和思路。