時(shí) 楊，賽文莉，陳金亮，姚 敏，姚登福

（1南通大學(xué)第四附屬醫(yī)院胸外科，江蘇鹽城 224001；2南通大學(xué)附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心；3南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科）

肺癌形成是多基因異常、多階段發(fā)展的復(fù)雜過(guò)程,臨床及基礎(chǔ)研究顯示癌基因、抑癌基因、微小RNA、缺氧微環(huán)境及血管生成相關(guān)因子等與肺癌預(yù)后明顯相關(guān)[1-2]。促血管生成素(angiopoietin,Ang)家族包括Ang-1,Ang-2,Ang-3和Ang-4,分別定位于8q22,8q23,20q13和20q13,分別由498,496,523和503個(gè)氨基酸組成肽鏈[3-4]。其中Ang-2含9個(gè)外顯子、8個(gè)內(nèi)含子,核苷酸開(kāi)放閱讀框架為1 491 bp,分子量為74 KD,受刺激后與內(nèi)皮細(xì)胞表面酪氨酸激酶-2(Tie-2)結(jié)合,降低內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)定性,刺激新血管生成,促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[5-6]。肺腺癌約占肺癌35%,是最常見(jiàn)的組織學(xué)亞型。僅1/3早期患者可行手術(shù)或放射治療,晚期及55%早期患者可能死于癌癥進(jìn)展或復(fù)發(fā),雖可選擇化療和靶向治療,但5年生存率僅25%左右[7-8]。正常肺組織中Ang-2低表達(dá)或無(wú)表達(dá),肺癌進(jìn)展時(shí)Ang-2過(guò)表達(dá)以滿(mǎn)足血管重建或滲透,與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[9-10]。本文以組織芯片及免疫組織化學(xué)方法,研究肺腺癌及其癌旁組織中Ang-2的表達(dá)情況及其與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系和預(yù)后價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 人肺腺癌組織經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意,收集2012年1月—2015年12月我院手術(shù)切除的60例肺腺癌組織標(biāo)本,其中高分化41例,中/低分化19例;國(guó)際肺癌研究協(xié)會(huì)TNM分期Ⅰ～Ⅱ期45例,Ⅲ～Ⅳ期15例。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)病理學(xué)診斷均為原發(fā)性肺腺癌;(2)術(shù)前未接受過(guò)任何治療;(3)臨床記錄及術(shù)后隨訪(fǎng)資料完整。隨訪(fǎng)截至2020年12月。

1.2 組織芯片（tissue microarray，TMA）制備取患者術(shù)后癌組織及癌旁組織,進(jìn)行病理學(xué)檢查,石蠟切片標(biāo)記,以TMA制作圓柱形,聚賴(lài)氨酸玻片孔徑1.5 mm,芯間距0.2 mm,于55℃固定10 min,冷卻后4℃保存。

1.3 免疫組織化學(xué)分析10%中性福爾馬林液固定組織,石蠟包埋、切片(4μm)。常規(guī)脫蠟,水化,高壓加熱法修復(fù)抗原,3%H2O2阻斷過(guò)氧化物酶,25℃,30 min,封閉液室溫孵育30 min以封閉非特異性抗原。滴加兔抗人Ang-2抗體(ab155106;Abcam,UK),4℃過(guò)夜。PBS洗3次,加羊抗兔IgG二抗(A21030;Abbkine,USA),室溫30 min,PBS洗3次。加50μL新配DAB顯色5 min,水洗5 min。蘇木素復(fù)染,脫水、透明、封片。在顯微鏡(Olympus公司,BX50)下觀察組織芯片上Ang-2的表達(dá)并攝片。

1.4 免疫組織化學(xué)分級(jí)Ang-2表達(dá)強(qiáng)度分4級(jí):深棕色呈粗顆粒狀為(+++),計(jì)3分;棕黃色有細(xì)顆粒狀為(++),計(jì)2分;淺黃色未見(jiàn)顆粒為(+),計(jì)1分;不著色為(-),計(jì)0分。記錄陽(yáng)性細(xì)胞百分率,采用X-tile軟件分析找出最佳分界值計(jì)算結(jié)果。根據(jù)Ang-2表達(dá)強(qiáng)度分為低表達(dá)組和高表達(dá)組,Ang-2不著色(-)或較淡(+)為低表達(dá)組,Ang-2呈中等程度(++)或強(qiáng)陽(yáng)性(+++)為高表達(dá)組。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理,Graphpad Prism 5.0軟件繪圖。計(jì)量資料以±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn);以SPSS在線(xiàn)軟件進(jìn)行單／多因素分析;計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和率表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)分析生存時(shí)間。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肺腺癌及癌旁組織中Ang-2表達(dá)肺腺癌組織中Ang-2染色呈棕褐色或黃色,主要定位于胞漿和胞核,分布均勻(圖1A1,A2);癌旁組織中Ang-2染色較淡(圖1B1,B2),其強(qiáng)度明顯低于腺癌組織。肺腺癌組織Ang-2陰性11例,弱陽(yáng)性(+)2例,中等陽(yáng)性(++)17例,強(qiáng)陽(yáng)性(+++)30例,陽(yáng)性率81.7%,高表達(dá)率78.3%;癌旁組織中Ang-2陰性(-)51例,弱陽(yáng)性(+)6例,中等陽(yáng)性(++)3例,強(qiáng)陽(yáng)性(+++)0例,陽(yáng)性率為15.0%,高表達(dá)率5.0%;肺腺癌組織Ang-2陽(yáng)性率和高表達(dá)率高于癌旁組織,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),提示Ang-2過(guò)表達(dá)可能在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

圖1 肺腺癌組織與癌旁組織中Ang-2表達(dá)

2.2 肺腺癌Ang-2表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系肺腺癌組織Ang-2陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期及患者5年生存率相關(guān),均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Ang-2陽(yáng)性表達(dá)與性別、年齡、分化程度及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

表1 肺腺癌組織Ang-2陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 例（%）

2.3 影響肺腺癌患者預(yù)后的單因素及多因素回歸分析單因素分析顯示,肺腺癌組織中Ang-2表達(dá)、分化程度、TNM分期與患者5年生存率顯著相關(guān);多因素分析顯示Ang-2水平是肺腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,Ang-2高表達(dá)肺腺癌患者5年生存率降低。見(jiàn)表2。

表2 影響肺腺癌患者5年生存率的單因素和多因素分析

2.4 肺腺癌患者Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)分析Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)分析顯示,Ang-2高表達(dá)組的5年總生存率明顯低于低表達(dá)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.357,P＜0.001)。見(jiàn)圖2。

圖2 肺腺癌患者Kaplan–Meier生存曲線(xiàn)

3 討 論

肺癌是全球癌癥死亡的首要原因,盡管近年低劑量CT技術(shù)在早期診斷中廣泛應(yīng)用,然而仍有大部分患者診斷時(shí)已是晚期或伴轉(zhuǎn)移。雖有多種靶向藥物能延長(zhǎng)患者生存時(shí)間,但不能降低死亡率[1-2]。肺癌因癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和耐藥等原因療效欠佳,尋找新的分子靶點(diǎn)和改進(jìn)療效倍受重視。肺癌發(fā)展涉及原癌基因激活、抑癌基因失活及凋亡相關(guān)基因異常,瘤體增大引起缺氧從而促進(jìn)Ang-2表達(dá),促進(jìn)新血管生成[11-12]。Ang-2定位于8q23,由496個(gè)氨基酸組成,肽鏈N端信號(hào)肽由含20個(gè)疏水氨基酸組成,約200個(gè)氨基酸卷曲成螺旋結(jié)構(gòu)域,折疊彎曲形成四級(jí)結(jié)構(gòu)[3]。Ang-2通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞表面Tie-2,拮抗血管緊張素-1,降低內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)定性,并刺激血管及淋巴管增殖,形成新血管促進(jìn)肺癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移。在肺癌組織缺氧微環(huán)境中Ang-2異常表達(dá),促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和新生血管生成[13]。Ang-2參與血管新生的啟動(dòng)、調(diào)節(jié)和延續(xù)過(guò)程?？筕EGF單抗或抗VEGF受體藥物聯(lián)合化療可有效靶向新生血管,延長(zhǎng)患者生存期,但因相關(guān)分子信號(hào)通路較多以及不同腫瘤的異質(zhì)性可造成抗血管療效差[14]。因腫瘤血管結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定和間質(zhì)流體壓力增加,使得腫瘤血管灌注差,導(dǎo)致組織極度缺氧和藥物輸送不足,反而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展,侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和化療耐藥[13,15]。

本研究結(jié)果顯示,肺腺癌組織Ang-2陽(yáng)性率和高表達(dá)率高于癌旁組織,Ang-2表達(dá)、腫瘤分化程度、TNM分期與患者5年生存率相關(guān),Ang-2水平是肺腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,Ang-2高表達(dá)患者5年生存率降低,提示Ang-2表達(dá)可能在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,并與患者臨床特征有關(guān),有助于判定預(yù)后。

文獻(xiàn)報(bào)道,血清Ang-2為非侵入性標(biāo)志物,檢測(cè)方便,可用于診斷或聯(lián)合診斷外,也可能用于術(shù)后療效監(jiān)測(cè)[16]。靶向活化Tie-2,抑制Ang-2表達(dá),或雙重抑制VEGF受體/Ang-2可減少腫瘤血管生成,彌補(bǔ)抗VEGF受體療法的局限,將給肺癌診治帶來(lái)新希望。