（茅臺學院，貴州仁懷 564500）

中國白酒是世界著名蒸餾酒之一，其分為濃香、清香、醬香、米香四大基礎香型。其中，醬香型白酒采用獨特的釀造工藝，如高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒、生產(chǎn)周期長、大量用曲、多輪次發(fā)酵和酒體長期貯存等工藝特征[1-2]，這樣的工藝造就了醬香型白酒的獨特風味：酒體醬香突出、香味幽雅細膩、酒體醇厚、回味悠長、空杯留香[3-5]。

醬香型白酒采用傳統(tǒng)的開放式釀造工藝，通過制曲、堆積、發(fā)酵過程網(wǎng)羅大量環(huán)境中的微生物，整個過程中細菌、酵母菌和霉菌是其釀造過程中三大功能微生物體系[6]，其中，細菌是白酒釀造過程中產(chǎn)醬香風味物質的重要動力來源，酵母菌是發(fā)酵產(chǎn)酒精和產(chǎn)高級酯類的動力來源，而霉菌是發(fā)酵前期淀粉等大分子物質糖化的主要動力來源[7-8]。

霉菌在醬香型白酒的主要功能是產(chǎn)生多種活性酶，能夠分泌糖化酶、液化酶、纖維素酶、蛋白酶、酯化酶、脂肪酶、果膠酶、漆酶等，對原料中淀粉、蛋白質等的降解具有重要作用，使得原料經(jīng)過一段時間的反應后糖類及氨基酸含量升高，在為其他微生物的生長代謝提供基礎物質的同時，也為醬香酒酒體風味物質的形成奠定了基礎[9-10]。

隨著微生物技術的發(fā)展，白酒霉菌的研究也越來越深入，對各種霉菌在白酒中的作用也得到了進一步的研究，本文綜述了醬香型白酒從制曲、堆積到窖內發(fā)酵過程中霉菌的研究情況，旨在為醬香型白酒功能性霉菌的研究提供參考。

1 醬香型高溫大曲中霉菌研究概況

大曲是直接影響白酒產(chǎn)量和質量的關鍵因素，主要分為高溫大曲、中高溫大曲、中溫大曲，不同類型大曲所含有的微生物和酶類的組成與其制作工藝和制作環(huán)境息息相關。醬香型白酒大曲屬于高溫大曲，采用傳統(tǒng)的制作工藝，曲料被制成規(guī)整的曲塊，經(jīng)過40 d 的發(fā)酵，大曲品溫逐漸升高到60 ℃，之后再經(jīng)過6 個月以上儲存成熟期，大曲才能使用。

1.1 醬香型高溫大曲中霉菌多樣性分析

醬香大曲的成曲過程是對環(huán)境微生物的網(wǎng)羅和篩選，經(jīng)過多年的研究分析得知，醬香型大曲中微生物是以細菌、酵母菌和霉菌三大菌群為主，在不同的制曲環(huán)境和曲塊放置位置，微生物呈現(xiàn)出不同的生長規(guī)律，但總體規(guī)律為細菌種類數(shù)量最為豐富，霉菌次之，酵母菌數(shù)量較少。

目前，通過研究發(fā)現(xiàn)，醬香大曲中的霉菌主要分為7 個屬：曲霉屬、毛霉屬、根霉屬、犁頭霉屬、紅曲霉屬、青霉屬、擬青霉屬[11-12]。其中，曲霉屬具有良好的耐熱、耐酸熱特性，為醬香大曲中種類最豐富的霉菌，也是釀酒環(huán)境中的主要產(chǎn)酶菌，能夠促進大曲中淀粉等原料的降解。醬香大曲中檢測出的曲霉主要包括黑曲霉、米曲霉、黃曲霉等。毛霉屬也是大曲中重要的霉菌，大量富集于大曲的低溫培菌期，能夠分泌蛋白酶促進大曲的分解。根霉屬一般與毛霉屬共存，由于其菌絲可以深入到大曲基質中形成網(wǎng)狀菌絲體，因此，對大曲成型有重要貢獻。醬香大曲中的根霉屬則主要為米根霉，其能夠分泌大量糖化型淀粉酶。青霉屬能夠分泌聚糖酶系，對木質纖維具有良好的降解能力[13]。

由于人工設定的培養(yǎng)條件遠遠不及自然環(huán)境復雜，因此純培養(yǎng)技術只能對環(huán)境中微生物總量的1%進行培養(yǎng)，極大地限制了人們對微生物完整群落結構的認識。近年，通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法與現(xiàn)代技術的聯(lián)合使用，從醬香大曲中檢測出了傳統(tǒng)研究方法所不能檢出的霉菌，也使我們對醬香白酒霉菌的多樣性有了更加深刻的認識。

2006 年，范光先等[14]采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)分離技術，對茅臺酒制曲發(fā)酵過程微生物的消長情況進行了系統(tǒng)研究，共分離得到霉菌35 種，主要包括擬內孢霉、白地霉、青霉、擬青霉、傘枝梨頭霉、微小毛霉、總狀毛霉、球形毛霉、米根霉、聚多曲霉、黑曲霉、黃曲霉、綠垂曲霉、日本曲霉、溫特曲霉、構巢曲霉、紫紅曲霉、紅色紅曲霉、煙色紅曲霉等菌種。

2012 年，Liu 等[15]通過PCR-DEEG 法對茅臺大曲微生物進行分析，發(fā)現(xiàn)真菌分布于散囊菌目、毛霉菌目和酵母目內4 個不同屬級分類的4 個不同種屬，即曲霉屬（Aspergillus）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、Thermomucor屬及Trichomonascus屬，同時檢出M.racemosus、T.crustaceus等不易培養(yǎng)菌。

2014 年，班世棟等[16]采用傳統(tǒng)可培養(yǎng)技術，從醬香型白酒大曲中分離得到Aspergillus、紅曲霉屬（Monascus）、毛霉屬（Mucor）、青霉屬（Penicillium）、Rhizomucor等19 株霉菌。同年，王彩虹[17]使用基因文庫法，對郎酒大曲霉菌進行鑒定，發(fā)現(xiàn)曲霉屬、嗜熱真菌屬、Thermomucor屬為主要優(yōu)勢菌株，并檢出掃帚狀曲霉、Thermomucor indicaeseudaticae等不易培養(yǎng)菌。陳筆[18]采用PCR-DGGE 法在醬香型白酒大曲中分別檢測到7 中霉菌，其中，A.oryzae和P.variotii是優(yōu)勢菌株，相對豐度分別達到38.2%和27.1%。其他霉菌如M.ruber、A.terreus、P.decumbens和G.argillacea等也能被檢測到，但是他們的豐度都小于2.9%。

2016 年，王曉丹等[19]從遵義地區(qū)6 種醬香大曲中分離篩選得到的1 株散囊菌，經(jīng)形態(tài)學及分子生物學鑒定確定該菌株為阿姆斯特丹散囊菌。

2018 年，夏玙等[20]高通量測序分析大曲中真菌群落結構，發(fā)現(xiàn)嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、根毛霉屬（Rhizomucor）、曲霉菌屬（Aspergillus）等霉菌是大曲中的優(yōu)勢真菌類群。同年，李靜心等[21]通過高通量測序技術對白酒高溫大曲進行分析，表明霉菌是構成高溫大曲的主要真菌，其中Thermomyces lanuginosus和Wallemiasp.為高溫大曲所特有，優(yōu)勢菌株Thermomyces lanuginosus、Aspergillus intermedius、Wallemiasp.等分別占總水平的80.49 %、10.95%和4.25%。

2020 年，朱治宇等[22]采用高通量測序技術，對茅臺鎮(zhèn)醬香白酒7 個主釀區(qū)釀造大曲和環(huán)境樣品霉菌進行解析，明確了Aspergillus、Byssochlamys、Monascus、Thermoascus、Thermomyces、Rhizomucor等霉菌屬是醬香白酒釀造大曲中的優(yōu)勢霉菌；Alternaria、Aspergillus、Byssochlamys、Cladosporium、Fusicolla、Lecythophora、Monascus、Penicillium、Phoma、Pyrenochaeta、Thermoascus、Thermomyces、Toxicocladosporium等霉菌屬是醬香白酒釀造環(huán)境中的優(yōu)勢霉菌。

1.2 醬香型高溫大曲中霉菌消長規(guī)律

高溫制曲工藝是醬香型白酒生產(chǎn)的一大特色，由多種菌種參與混合發(fā)酵而成，曲塊發(fā)酵時間長，發(fā)酵中后期品溫高。由于霉菌特殊的細胞結構及生長特性，如耐熱孢子、營養(yǎng)體適合在潮濕、多氧環(huán)境下生長繁殖，極高的制曲溫度為許多耐高溫霉菌的生長繁殖代謝創(chuàng)造了條件，因而在整個制曲過程中，霉菌的種類和數(shù)量在發(fā)酵中前期達到高峰[23]。

楊代永[24]通過對茅臺高溫大曲制作過程進行跟蹤發(fā)現(xiàn)，醬香高溫大曲發(fā)酵過程中微生物總數(shù)以細菌為主，高達2.118×107cfu/g·曲，霉菌次之，為6.446×106cfu/g·曲；酵母最少，僅有6.6×104cfu/g·曲。種類卻以霉菌為最多，高達51 種；細菌次之，為41種；酵母最少，僅發(fā)現(xiàn)6種。前中期（20 d）霉菌的數(shù)量幾乎無變化，維持在入房時霉菌數(shù)量，達頂溫后才開始大幅度增長，后期隨著水分含量的下降，數(shù)量也隨著有小幅度的下降。

同樣，印璇等[25]在對北大倉酒廠高溫大曲培曲過程中微生物變化的分析中，發(fā)現(xiàn)霉菌在制曲前中期數(shù)量不高，曲坯從入房到第一次翻曲階段霉菌數(shù)量一直保持在3.0×103cfu/g 左右，無明顯變化。在第二次翻曲時數(shù)量有所增加，為8.1×103cfu/g。從第二次翻曲到出房，霉菌大量生長繁殖，數(shù)量在出房時達到高峰，為4.5×105cfu/g。

綜上所述，大曲制作過程中霉菌生長情況及變化規(guī)律大致相似，在高溫大曲的培曲中前期，隨著高溫大曲品溫的升高，霉菌大量富集，之后隨著大曲發(fā)酵的進行，由于水分的下降等霉菌數(shù)量有所下降。但是，研究也發(fā)現(xiàn)，在整個大曲制作過程中，北方高溫大曲中霉菌的數(shù)量始終不及南方（低100 倍左右），可能是北方霉菌區(qū)系不及南方，同時，也有可能是南北氣候、溫差、地貌等環(huán)境因素的不同所引起的，說明大曲制作過程中微生物的變化受環(huán)境影響極大。

2 糟醅堆積過程中霉菌研究概況

堆積是醬香型白酒獨有的工藝之一，是富集有益微生物、酶類的重要工序，也是在多種酶類作用下生成酒體香味物質和其前體物質的重要過程。高溫堆積首先將原料或酒醅在加入大曲拌勻后，收攏成堆，溫度約30 ℃，堆積4～5 d。當堆頂溫度達到45～50 ℃，堆積的酒醅散發(fā)香甜味和酒香味時，即可入窖發(fā)酵。

從長期實踐及試驗結果來看，高溫堆積有三大作用：（1）網(wǎng)羅、富集環(huán)境中微生物，以利于窖內酒精發(fā)酵；（2）糖化發(fā)酵：將淀粉等酶解為可發(fā)酵糖，同時也將蛋白質水解為氨基酸；（3）生香作用：生產(chǎn)醬香物質或醬香前體物質，因此堆積發(fā)酵的好壞會直接關系到最終白酒的質量和產(chǎn)量。

2.1 糟醅堆積過程中霉菌多樣性分析

近年來，關于白酒堆積過程中微生物的演變規(guī)律研究有很多，報道發(fā)現(xiàn)，堆積過程中優(yōu)勢菌株主要為細菌和酵母菌，數(shù)量占微生物總數(shù)的99 %。同時，雖然不同酒廠的發(fā)酵工藝相似，但不同的大曲、不同的酒廠發(fā)酵車間環(huán)境微生物多樣性的差異化也影響著堆積酒醅的微生物多樣性。

2007 年，唐玉明[26]采用微生物分離培養(yǎng)法研究四川古藺郎酒酒糟堆積過程微生物變化時發(fā)現(xiàn)，堆積過程霉菌類型以黃曲霉類和根霉類為主。

2012 年，陳筆[18]采用PCR-DGGE 法，對貴州某白酒廠第三輪堆積樣品進行跟蹤研究，發(fā)現(xiàn)在堆積發(fā)酵期間只檢出P.variotii、A.oryzae、A.terreus和R.microsporus，其中P.variotii是優(yōu)勢霉菌，比例超過霉菌總數(shù)的90%。

2017 年，尚柯[27]采用高通量測序技術，對山東某白酒廠醬香型白酒釀造生產(chǎn)周期8 個輪次酒醅進行分析，發(fā)現(xiàn)堆積過程中原核類微生物種類占總檢出微生物總體的88 %，數(shù)量占總檢出微生物的91%。其中，各輪次堆積酒醅中檢出的霉菌有紅曲霉屬、曲霉屬、帚枝霉屬、被孢霉屬等，堆積前期各輪次堆積酒醅中優(yōu)勢霉菌有紅曲霉屬、被孢霉屬，堆積后優(yōu)勢霉菌為曲霉屬、帚枝霉屬。

2017 年，黃蘊利等[28]對XJ 醬香型白酒二輪次堆積、窖池發(fā)酵酒醅樣品進行分析，發(fā)現(xiàn)二輪次堆積過程中絕對優(yōu)勢細菌屬有Bacillus、Enterococcus、Lactococcus、Lactobacillus；絕對優(yōu)勢真菌屬有Thermoascus、Thermomyces、Candida、Aspergillus。

2019 年，呂錫斌[29]分析貴州茅臺酒股份有限公司制酒車間，下沙、造沙輪次微生物，發(fā)現(xiàn)下沙輪次經(jīng)高溫堆積發(fā)酵至發(fā)酵結束，優(yōu)勢菌主要為Weissella paramesenteroides、Pediococcus acidilactici、Lacto-bacillus plantarum等乳酸菌，且相對豐度為80 %以上。造沙堆積經(jīng)高溫堆積至發(fā)酵結束，優(yōu)勢菌主要為Lactobacillus panis、Pediococcus acidilactici、Acetobacter ghanensis，均為產(chǎn)酸微生物，且相對豐度為90%以上。

2.2 糟醅堆積過程中霉菌消長規(guī)律

關于堆積過程中霉菌消長規(guī)律的研究較少，唐玉明采用微生物分離培養(yǎng)法研究四川古藺郎酒酒糟堆積過程微生物變化時發(fā)現(xiàn)，霉菌類數(shù)量在堆積初期比酵母菌類高1～2 個數(shù)量級，但隨著堆積時間延長，除堆下可能因溫度較低氧含量相對較高而使霉菌略有增長外，其余各堆點都呈現(xiàn)下降趨勢，尤其是堆心，中后期幾乎檢測不到霉菌類。同時，作者也對各輪次堆積的微生物進行跟蹤分析，發(fā)現(xiàn)酵母菌數(shù)量和細菌中非芽孢細菌數(shù)量有較大幅度增長，霉菌數(shù)量略有降低[26]。

同樣的，袁再順[30]采用分析生物學高通量測序技術研究貴州某醬香型白酒高溫堆積過程時發(fā)現(xiàn)同樣現(xiàn)象，其報道堆積過程中優(yōu)勢霉菌有曲霉、絲衣霉、紅曲霉等，隨著堆積發(fā)酵的進行，數(shù)量均呈現(xiàn)下降趨勢。

3 酒醅窖內高溫發(fā)酵過程中霉菌研究概況

窖內高溫發(fā)酵是指在無氧環(huán)境下，微生物分解葡萄糖等有機物，產(chǎn)生酒精、二氧化碳等不徹底氧化產(chǎn)業(yè)，同時釋放少量能量的過程。有研究表明，在醬香型白酒窖內發(fā)酵過程中，窖池中部的溫度最高可達37 ℃，平均溫度為30 ℃。

窖內發(fā)酵是堆積發(fā)酵的延續(xù)，但由于窖池發(fā)酵屬于無氧發(fā)酵，且入窖后氧氣含量呈現(xiàn)至上到下的梯度減少，而霉菌又屬于好氧微生物，因此，入窖后霉菌數(shù)量也呈現(xiàn)梯度分步：上層＞中層＞下層[8]。同時，窖內發(fā)酵后蒸餾出的上、中、下層原酒的風格也不相同，上層原酒醬香味突出，中層原酒醇厚香甜，下層原酒則窖香突出。可見，窖內發(fā)酵對醬香型白酒風味物質的形成起到重要作用。

3.1 酒醅窖內高溫發(fā)酵過程中霉菌多樣性分析

窖內高溫發(fā)酵是各類微生物協(xié)同的作用，影響白酒的風格和質量，因此關于窖內衛(wèi)生的研究也一直備受關注。發(fā)酵酒醅中常見的霉菌包括曲霉、根霉、紅曲霉，這些霉菌產(chǎn)生的糖化酶、蛋白酶、液化酶、纖維素酶、酯化酶、果膠酶等直接關系到淀粉等原料的利用及醬香物質的形成，在酒醅發(fā)酵中具有重要的作用和功能。

2012 年劉雯雯[32]以黑龍江省齊齊哈爾市北大倉集團有限公司釀酒車間的醬香酒窖池為分析對象，對酒醅內霉菌的群落組成進行研究，發(fā)現(xiàn)Alternaria、Aspergillus、Cladosprium、Eurotium、Geotrichum、Monascus、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Stachybotrys、Mucor等類群的霉菌，在酒醅發(fā)酵某個階段的相對頻率可以達到10 %以上，而Geniculosporium和Scopulariopsis兩個類群屬于出現(xiàn)頻率較低的稀有種類。

2013 年，孫劍秋等[31]從北大倉酒醅內分離到的霉菌被鑒定為13屬23種，其中鏈格孢、曲霉、枝孢、散囊菌、地霉、紅曲、脈孢菌、擬青霉、青霉、葡萄穗霉和毛霉等在酒醅發(fā)酵某個階段的相對頻率在10%以上，而曲梗霉和帚霉兩個類群在酒醅中屬于出現(xiàn)頻率較低的稀有種類。

2017 年黃蘊利等[28]對XJ 醬香型白酒二輪次堆積、窖池發(fā)酵酒醅樣品進行分析，發(fā)現(xiàn)窖池發(fā)酵上層酒醅中存在的主要細菌屬類有Lactobacillus、Acetobacter、Bacillus，窖池發(fā)酵中層酒醅中的主要細菌屬類有Lactobacillus、Bacillus，窖池發(fā)酵下層酒醅中的主要細菌屬類有Lactobacillus。

同年，李欣等[33]研究福建建甌黃華山釀酒有限公司發(fā)酵酒醅微生物多樣性，發(fā)現(xiàn)窖內發(fā)酵酒醅的優(yōu)勢微生物為乳桿菌屬、醋酸桿菌屬、青霉菌屬、畢赤酵母屬、曲霉屬、嗜熱子囊菌屬、假絲酵母屬。

2019 年，袁再順[30]采用分析生物學高通量測序技術研究貴州某醬香型白酒發(fā)酵過程時發(fā)現(xiàn)，窖內發(fā)酵酒醅中共檢測到相對豐度高于0.01 %真菌屬17 個，主要包括假絲酵母屬（Candida）、未分類的散囊菌目(unclassified_o_Eurotiales)、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、熱子囊菌屬（Thermoascus）、青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、絲衣霉屬（Byssochlamys）、拉桑索尼亞真菌屬（Rasamsonia）、未分類的小囊菌科（unclassified_f_Microascaceae）、紅曲霉屬（Monascus）、畢赤酵母屬（Pichia）、毛孢子蟲屬（Trichosporon）、威克漢姆酵母（Wickerhamomyces）、unclassified_o_Olpidiales、未分類的真菌科（unclassified_k_Fungi）、unclassified_o_Sordariales 和木拉克酵母屬（Cystofilobasidium）。

3.2 酒醅窖內高溫發(fā)酵過程中霉菌消長規(guī)律

由于窖內發(fā)酵屬于無氧發(fā)酵過程，且隨著發(fā)酵的進行有機酸和乙醇大量增加，因此霉菌在窖池發(fā)酵過程中不斷失去生物活性或死亡。

唐明玉[34]在郎酒生產(chǎn)窖池中，霉菌發(fā)酵前期含量呈下降趨勢,數(shù)量維持在102～103cfu/g 糟,到發(fā)酵中后期又出現(xiàn)回升,并逐漸趨于穩(wěn)定,數(shù)量穩(wěn)定在102cfu/g糟數(shù)量級。

以上結論與陳筆的結論一致，其在對貴州某白酒廠第三輪窖內酒醅進行跟蹤研究時，發(fā)現(xiàn)在進入窖池發(fā)酵后，霉菌種類以及每種的相對含量持續(xù)減少至發(fā)酵結束[18]。

孫劍秋[31]在研究北大倉醬香型白酒釀造過程中霉菌消長規(guī)律也得到同樣的結論：窖池上中下層酒醅霉菌數(shù)量變化規(guī)律基本一致，發(fā)酵開始后霉菌數(shù)量急劇下降，發(fā)酵至第7 天霉菌數(shù)量短暫回升，發(fā)酵后期菌體數(shù)量再次呈現(xiàn)出減少態(tài)勢，直至發(fā)酵結束?？梢姡诶删?、貴州某白酒、北大倉白酒等醬香型白酒生產(chǎn)過程中，窖內酒醅中霉菌的消長規(guī)律遵循類似規(guī)律。

同時，孫劍秋[31]也發(fā)現(xiàn)：由于各種霉菌的生長代謝特性不同，它們在酒醅中消長規(guī)律也不盡相同。其中，曲霉與青霉兩類霉菌的數(shù)量最多，在酒醅發(fā)酵過程中可分離到。曲霉類霉菌始終是優(yōu)勢菌株，特別是發(fā)酵后期占分離菌株的50 %。青霉類霉菌在封窖初期霉菌中占有優(yōu)勢，但隨后逐漸減少，發(fā)酵中后期又有所回升，直至發(fā)酵結束所占比例再下降。紅曲霉則隨著發(fā)酵進行數(shù)量逐漸增加。枝孢屬霉菌則是發(fā)酵前期的優(yōu)勢菌株，但逐漸減少，中后期未能檢出。由此可見，隨著發(fā)酵的進行，各類霉菌的數(shù)量和種類會不斷變化，酒醅內霉菌種群、數(shù)量、生態(tài)分布的不同，對不同層次酒醅酒體的差異會產(chǎn)生一定影響。

4 展望

醬香型白酒中各香味物質含量通常為十萬分之一到百萬分之一，甚至是千萬分之幾[35]，從大曲的制備到酒醅發(fā)酵的過程中，釀酒微生物發(fā)生著復雜的協(xié)同作用，生成了多種特殊香味物質。因此，對白酒的研究要從香味物質開始，而香味物質的研究則要從醬香白酒釀造過程中微生物入手，重點了解各微生物的發(fā)酵機理及相互之間的作用，之后再采用基因工程手段融合或選育優(yōu)良性狀菌株，將其運用到工業(yè)生產(chǎn)中。

目前，釀酒微生物的研究主要是針對某一菌株，且很多菌株的發(fā)酵機理也不清楚，也存在著很多很難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)微生物，再加上白酒的酒體風味、質量與釀造環(huán)境、微生物有著相互作用，給釀酒微生物的研究帶來了很大的困難。同時，白酒釀造是各微生物之間相互作用的結果，因此，要闡明霉菌在白酒釀造過程中的作用與機理就需要著眼于微生物的群體效應，可以從微生物多樣性、分子生物學、蛋白質組學、生物信息學、代謝組學等方面展開研究，以探索各微生物構成的復雜、精細、微妙的白酒釀造微生物代謝網(wǎng)絡。