張敏，張朔，張鵬，趙洪禮

(1.沈陽大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院城市有害生物治理與生態(tài)安全遼寧省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110044；2.沈陽百發(fā)科技有限公司，沈陽 110163；3.遼寧何氏醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，沈陽 110163)

玻璃膜疣是黃斑老齡化的共同特征，是其最早期的眼底表現(xiàn)，是年齡相關(guān)性黃斑變性(agerelated macular degeneration，AMD)的重要危險(xiǎn)因子，與AMD的進(jìn)展密切相關(guān)[1]。如果玻璃膜疣的形成能夠被調(diào)整的話，AMD的發(fā)展進(jìn)程可能延緩或者停止。已有研究[2-4]表明玻璃膜疣形成起始階段為在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelium，RPE)下層微小羥基磷灰石球粒(不溶性堿性磷酸鈣)以含膽固醇的脂滴為核心沉積，而其外層被Aβ、玻連蛋白、補(bǔ)體因子H等蛋白質(zhì)包被覆蓋。其中玻璃膜疣形成的起始成分為膽固醇，鈣元素在RPE下的積累特別是不溶性鈣的沉積加速了玻璃膜疣的形成進(jìn)程。同時(shí)在細(xì)胞內(nèi)鈣離子廣泛參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，如果大量的鈣離子內(nèi)流引發(fā)鈣超載可造成細(xì)胞的損傷及凋亡[5-6]。本研究以細(xì)胞膜鈣ATP 酶1(plasma membrane Ca2+ATPase 1，PMCA1)、L型電壓依賴性鈣離子通道(L-type voltage-dependent calcium channel，LVDCC)和細(xì)胞膜鈉鈣交換蛋白1(sodium calcium exchange protein 1，NCX1)三個(gè)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)通道為代表，利用膽固醇培養(yǎng)人RPE細(xì)胞，分析RPE細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)通道蛋白表達(dá)水平上的變化，初步了解玻璃膜疣形成起始階段與RPE細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運(yùn)狀態(tài)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

ARPE-19細(xì)胞株購買自北納生物(細(xì)胞系，中國)；膽固醇(≥99%)購自美國Sigma公司；RIPA lysis buffer和BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PMCA1抗體購自于英國Abcam公司，NCX1和LVDCC抗體購自于美國Proteintech公司；熒光染料購自瑞士Roche公司的light cycler 480 SYBR Green I Master。

1.2 體外培養(yǎng)ARPE-19

將ARPE-19細(xì)胞株解凍離心后接種于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。生長至大部分細(xì)胞接近融合狀態(tài)時(shí)使用0.25%胰蛋白酶消化傳代。繼代培養(yǎng)3～5代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 膽固醇處理ARPE-19 細(xì)胞

設(shè)置正常培養(yǎng)對(duì)照組和膽固醇處理組。具體方法見文獻(xiàn)[7]，對(duì)照組按上述體外培養(yǎng)ARPE-19 的方法正常培養(yǎng)。血液中的膽固醇濃度約為2 mg/mL。選擇以略高于血液中膽固醇的濃度培養(yǎng)，給予細(xì)胞一種類似于膽固醇在胞外略有積累的環(huán)境。正常培養(yǎng)條件下和膽固醇濃度2.5 mg/mL培養(yǎng)條件下分別取培養(yǎng)0、6、12、24、48、72 h不同時(shí)間的ARPE-19細(xì)胞樣品，液氮速凍后-80 ℃保存用于后續(xù)檢測(cè)。不同處理組光學(xué)顯微鏡下觀察取圖，記錄好培養(yǎng)過程中細(xì)胞變化。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白R(shí)NA 水平的變化

吸去細(xì)胞原培養(yǎng)液，PBS 清洗一次，用胰酶消化細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，PBS重懸細(xì)胞，1000 r/min 離心5 min，棄上清。采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit進(jìn)行R N A 提取，以g DNA Era ser 與R N A溶液混合在42 ℃共浴2 min去除基因組DNA，之后反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得mRNA。采用熒光定量PCR(quantitative real time-PCR，qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平變化，以Tubulin為內(nèi)參，利用Roche light cycler 480 SYBR Green I熒光染料反應(yīng)、循環(huán)數(shù)Ct 值法在ABI熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀上檢測(cè)分析。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 10 min，30 cycles(95 ℃ 10 s，65 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s)，65～95 ℃ 0.5℃/5 s。LVDCC退火溫度為60 ℃。內(nèi)參Tubulin和3個(gè)鈣轉(zhuǎn)運(yùn)通道基因引物見表1。統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件為Excel 17.0，利用方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，分別比較2個(gè)組不同處理時(shí)間與0 h時(shí)的表達(dá)變化。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)

以R I PA蛋白裂解液裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，以BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。12%凝膠濃度進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)PVDF模后一抗和二抗孵育，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)不同處理下的蛋白表達(dá)量變化。凝膠系統(tǒng)觀察取圖，以Tubulin蛋白為標(biāo)準(zhǔn)參照，用Image J軟件對(duì)圖片結(jié)果進(jìn)行灰度掃描分析。

2 結(jié)果

2.1 膽固醇對(duì)RPE 細(xì)胞PMCA1、LVDCC 和CX1 轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響

通過實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)正常培養(yǎng)對(duì)照組和2.5 mg/mL膽固醇暴露處理0、6、12、24、48、72 h各時(shí)間段ARPE-19細(xì)胞中PMCA1、LVDCC和NCX1 mRNA表達(dá)的情況。結(jié)果表明：在正常培養(yǎng)條件下，隨著時(shí)間延長，PMCA1 mRNA表達(dá)略有升高，在72 h時(shí)有顯著升高。而膽固醇暴露的ARPE-19細(xì)胞中PMCA1 mRNA表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，從6 h開始到72 h PMCA1 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，在12 h表達(dá)水平最低，下調(diào)了約2倍，但未呈現(xiàn)時(shí)間依賴性(圖1A)。在正常培養(yǎng)條件下LVDCC mRNA表達(dá)也在72 h顯著升高；與對(duì)照組相比，膽固醇處理組長時(shí)間培養(yǎng)(24 h和48 h)LVDCC mRNA 表達(dá)明顯上調(diào)，24 h時(shí)表達(dá)上調(diào)了近4倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1 B)。在正常培養(yǎng)條件下NCX1m RNA 表達(dá)水平隨時(shí)間延長無明顯變化，而膽固醇處理后NCX1 mRNA表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，特別是在24 h，表達(dá)上調(diào)了近6倍(圖1C)。在膽固醇處理組72 h時(shí)LVDCC 和NCX1 mRNA表達(dá)水平與處理24 h、48 h相比顯著下調(diào)，都是在處理時(shí)間超過24 h后表達(dá)出現(xiàn)回落，表現(xiàn)出一定的時(shí)間效應(yīng)。這些結(jié)果表明：膽固醇處理下PMCA1轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)顯著降低，LVDCC 和NCX1 轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)上調(diào)。

圖1 膽固醇處理對(duì)PMCA1(A)、LVDCC(B)、NCX1(C)三個(gè)基因mRNA表達(dá)水平的影響Figure 1 The effect of cholesterol treatment on the mRNA expression levels of the three genes PMCA1 (A),LVDCC (B) and NCX1 (C)

2.2 膽固醇對(duì)RPE 細(xì)胞PMCA1、LVDCC 和NCX1蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響

通過蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)正常培養(yǎng)和2.5 mg/mL膽固醇處理0、6、12、24、48、72 h各時(shí)間段ARPE-19細(xì)胞中PMCA1、LVDCC和NCX1的蛋白質(zhì)表達(dá)的情況(圖2)。結(jié)果表明：膽固醇處理24 h后PMCA1蛋白質(zhì)含量明顯降低，特別是 72 h。膽固醇處理組的LVDCC和NCX1的蛋白質(zhì)表達(dá)明顯增多，在48 h增加最明顯。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)膽固醇處理對(duì)PMCA1、LVDCC、NCX1蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響Figure 2 Western blot detection of the effect of cholesterol treatment on the protein expression levels of PMCA1,LVDCC and NCX1

為定量比較兩組蛋白表達(dá)的變化，對(duì)蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果進(jìn)行了灰度分析(圖3)。加入膽固醇培養(yǎng)的ARPE-19細(xì)胞中PMCA1蛋白質(zhì)含量隨時(shí)間延長不斷降低，最低在72 h，降低了約2倍(圖3A)。膽固醇處理組在48 h LVDCC蛋白質(zhì)表達(dá)水平最高，增高了約4倍(圖3B)，NCX1蛋白質(zhì)含量在膽固醇暴露48 h增加約1.7倍(圖3C)；兩個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)均是在72 h 略低于48 h。這些結(jié)果表明：膽固醇處理下PMCA1蛋白質(zhì)表達(dá)明顯減少，LV D CC 和NC X 1 的蛋白質(zhì)表達(dá)水平上調(diào)。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)的灰度分析結(jié)果Figure 3 Gray analysis results of western blotting detection

3 討論

玻璃膜疣位于RPE層及Br uch膜之間，是由RPE細(xì)胞殘片、炎性因子、補(bǔ)體因子及補(bǔ)體激活物、脂褐素等堆積而成的細(xì)胞外沉積[1,7-8]。玻璃膜疣的出現(xiàn)與危害視力的黃斑病變，如視網(wǎng)膜色素上皮脫離、萎縮和脈絡(luò)膜新生血管的發(fā)生密切相關(guān)[9]。已有研究在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)過程中重建了僅依賴于RPE細(xì)胞的玻璃膜疣生物發(fā)生過程，表明RPE細(xì)胞可能是細(xì)胞外玻璃膜疣形成的起始和調(diào)控的關(guān)鍵位置[3-4]。RPE細(xì)胞具有轉(zhuǎn)運(yùn)視色素、轉(zhuǎn)運(yùn)營養(yǎng)成分和清除自由基等功能，RPE細(xì)胞功能正常對(duì)維持視網(wǎng)膜的功能和結(jié)構(gòu)有重要意義。所以RPE功能異?？赡芗仁遣Ａゐ嘈纬傻闹饕蛩?，也可能是玻璃膜疣形成后對(duì)RPE的影響結(jié)果，包括RPE細(xì)胞鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)等功能。作為重要的第二信使，細(xì)胞內(nèi)鈣離子參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、自噬和凋亡等過程，對(duì)于細(xì)胞活力的維持至關(guān)重要[6]。鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡可能會(huì)引起RPE細(xì)胞功能障礙和細(xì)胞凋亡，而RPE細(xì)胞漸進(jìn)性功能障礙或凋亡在AMD的發(fā)病進(jìn)程中起至關(guān)重要的作用，RPE細(xì)胞凋亡也是干性AMD早期病理改變之一[5,9-10]。起始階段以膽固醇為核心的脂滴在細(xì)胞外不溶性鈣的存在下加速滯留蛋白質(zhì)，形成聚合體沉淀可能是玻璃膜疣形成的一種機(jī)制[2]。綜上所述，RPE細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)可能與玻璃膜疣形成關(guān)系密切，存在互相影響。

本研究以玻璃膜疣形成起始階段主要成分膽固醇作用于RPE細(xì)胞。通過檢測(cè)三個(gè)鈣離子相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)通道轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化，發(fā)現(xiàn)膽固醇使PMCA1表達(dá)減少，LVDCC和NCX1表達(dá)上調(diào)，且LVDCC表達(dá)上調(diào)倍數(shù)最大。其中PMCA1為細(xì)胞膜上將細(xì)胞內(nèi)高濃度的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外的鈣泵，而通過LVDCC進(jìn)入細(xì)胞是細(xì)胞外鈣離子進(jìn)入RPE細(xì)胞的主要方式，NCX1作為調(diào)控細(xì)胞內(nèi)外鈣離子穩(wěn)態(tài)重要的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，也是細(xì)胞內(nèi)鈣變化的關(guān)鍵鈣通道[11-13]。LVDCC在膽固醇處理下明顯上調(diào)，可能促進(jìn)細(xì)胞外鈣離子進(jìn)入細(xì)胞。而PMCA1和NCX1的下調(diào)，則有可能引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子外排受阻。所以膽固醇暴露可能使RPE細(xì)胞的鈣離子外排受到抑制，引進(jìn)鈣離子內(nèi)流。膽固醇處理下NCX1和LVDCC的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)在24 h最高，之后48 h和7 h出現(xiàn)回落；其蛋白質(zhì)水平表達(dá)在膽固醇處理48 h最多，在72 h略有降低，比轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)增多的時(shí)間上略有延遲。這可能受處理時(shí)間延長導(dǎo)致死亡細(xì)胞增多的影響。玻璃膜疣形成起始階段脂質(zhì)積累的刺激，可能引起RPE細(xì)胞鈣超載，從而導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。而死亡RPE細(xì)胞的碎片及鈣離子的釋放可能會(huì)繼續(xù)促進(jìn)玻璃膜疣聚合體的形成。本研究探討了膽固醇對(duì)RPE細(xì)胞鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道的影響，但膽固醇對(duì)RPE細(xì)胞凋亡的影響及此影響是否參與玻璃膜疣的形成過程尚需進(jìn)一步探討。

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