王承玉 李鑫淼 鄭朝朝 朱秀同 郁宏偉

doi：10.3969/j.issn.1008-4754.2021.11.072

摘要：為了提高牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）的培養(yǎng)滴度，延長牛傳染性鼻氣管炎病毒液的保存時間，本研究對牛傳染性鼻氣管炎病毒增殖工藝進行了優(yōu)化研究。研究結(jié)果表明：吸附或不吸附的接毒方式對病毒液的滴度沒有明顯的差異，而病毒液滴度與接毒前細胞數(shù)、病毒液收獲時間呈正比;最佳的接毒劑量0.01%，收獲病毒液的時間為細胞100%病變時，病毒液的滴度最高;使用保護劑2能夠有效延長半成品病毒液的保存期（至12個月）。

關(guān)鍵詞：牛傳染性鼻氣管炎病毒;接毒;病毒增殖;工藝研究

牛傳染性鼻氣管炎（infectious bovine rhinotracheitis，IBR）是由牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）或Ⅰ型牛皰疹病毒（BHV-Ⅰ）引起的一種牛呼吸道接觸性傳染病，該病為二類傳染病，又被稱為“壞死性鼻炎”、“紅鼻病”^[1，2]，牛傳染性鼻氣管炎的臨床特征為：呼吸困難、鼻腔流膿、鼻黏膜充血、結(jié)膜炎、乳腺炎、流產(chǎn)等癥狀^[3-5]。Madin等^[6]在1956年首次分離出病毒并被命名為牛傳染性鼻氣管炎，1964年又有學(xué)者確認牛鼻氣管炎病毒屬于皰疹病毒。該病最典型的特點為持續(xù)性，因此牛感染該病毒后會長期帶毒甚至有可能會終生帶毒，這嚴(yán)重制約了全世界養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展，對全球養(yǎng)牛業(yè)造成了一定的經(jīng)濟損失。接種疫苗是防控該病的最重要措施，而抗原是影響疫苗免疫效果的重要因素^[7]，為了提高牛傳染性鼻氣管炎病毒的培養(yǎng)滴度，延長牛傳染性鼻氣管炎病毒液的保存時間，對牛傳染性鼻氣管炎病毒增殖工藝進行了研究，確定了最佳接毒法、接毒劑量、收獲時間等工藝參數(shù)，并對病毒液保存條件、保存時間進行了相關(guān)的研究。

1 材料與方法

1.1 細胞和病毒株

MDBK細胞，牛傳染性鼻氣管炎病毒（C1株）均由瑞普（保定）生物藥業(yè)有限公司種毒室提供。

1.2 試劑

DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司，新生牛血清購自內(nèi)蒙古金源康生物工程公司，病毒保護劑由合作單位惠贈。

1.3 牛傳染性鼻氣管炎病毒增殖條件的優(yōu)化

1.3.1 最佳接毒時間的摸索 取牛傳染性鼻氣管炎（C1株）生產(chǎn)用種毒，按照萬分之一接毒量接種至培養(yǎng)時間分別為24h、48h、72h的MDBK細胞。每組分別設(shè)置吸附組、不吸附組。吸附組接毒方法為接毒后置于37℃吸附1h，補加維持液至1L，于37℃繼續(xù)培養(yǎng);不吸附組接毒方法為接毒后補加維持液至1L，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)細胞病變達到80%以上時收獲病毒液。

1.3.2 最佳接毒劑量、收獲時間的摸索 取牛傳染性鼻氣管炎（C1株）生產(chǎn)用種毒，分不同接毒量接種至已長滿良好單層的制苗用細胞，接毒量分別為50μL、100μL和200μL三個梯度，補加維持液至1L后于37℃繼續(xù)培養(yǎng)。取牛傳染性鼻氣管炎（C1株）生產(chǎn)用種毒，接種至已長滿良好單層的制苗用細胞，并補加維持液，于37℃繼續(xù)培養(yǎng)。按照不同收獲時間收獲牛傳染性鼻氣管炎病毒液，檢測各樣品病毒液效價。

1.3.3 病毒液保存期試驗 將收獲的牛傳染性鼻氣管炎病毒液凍融三次后，按病毒液與病毒儲存液10000：1的體積比（V：V），在病毒液中加入病毒儲存液，充分混勻后，置于-20℃保存。同時設(shè)立不加儲存液的對照。

2 結(jié)果

2.1 最佳接毒時間試驗結(jié)果

如表1顯示吸附和不吸附對所收獲病毒液的滴度沒有太大的影響，吸附組病毒液滴度最高為10^7.5TCID₅₀/0.1mL，不吸附組病毒液滴度最高為10^7.7TCID₅₀/0.1mL。病毒液滴度與接毒前細胞數(shù)、病毒液收獲時間呈正比，即接毒前細胞數(shù)越多，病毒液收獲需要的時間越長，病毒液滴度越高。故優(yōu)選細胞培養(yǎng)72h長成致密單層后接毒，不吸附，待病變細胞超過80%后收獲病毒液。

2.2 最佳接毒劑量、收獲時間試驗結(jié)果

下表的結(jié)果顯示：①接毒量不同對牛傳染性鼻氣管炎病毒液的收獲時間有較大的影響，接毒量大則收獲時間提前;②接毒量不同對牛傳染性鼻氣管炎病毒液滴度的影響較小;③收獲時病變程度越高，收獲的病毒液滴度也就越高：萬分之零點五的接毒量使細胞達到100%的病變程度所需要的時間為50h，而0.02%的接毒量使細胞達到100%的病變程度需要的時間為42h，則兩者相差8h;④接毒量為0.005%、0.01%、0.02%時，細胞達到100%病變時所收獲病毒液的滴度分別為10^7.5、10^8.0和10^7.8TCID₅₀/0.1mL;⑤由下表也可看出當(dāng)各個接毒量均顯示病變程度越高時，病毒液的滴度則越高，因此優(yōu)選最佳的接毒量為0.01%，收獲病毒液的時間為細胞100%病變時。

2.3 病毒液保存期試驗結(jié)果

結(jié)果顯示添加病毒儲存液的病毒液在-20℃的條件下保存12個月后病毒含量下降均不超過1.0 lg（TCID₅₀/0.1mL）;而對照組病毒含量迅速下降，其保存4個月后病毒含量已低于“規(guī)程”要求（制苗用的半成品病毒液病毒含量應(yīng)≥6.5 lg（TCID₅₀/0.1mL），為不合格產(chǎn)品。因此，添加保護劑2能夠有效延長半成品病毒液的保存期（至12個月）。

3 討論

牛傳染性鼻氣管炎屬于二類疫病，是一種急性、熱性傳染病，感染該病后對奶牛的奶質(zhì)、肉牛的肉質(zhì)、母牛的繁殖力和幼牛的生長發(fā)育產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響，對養(yǎng)殖場及養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。而對于該疫病的防控措施是重中之重，目前采取免疫疫苗的方式來防治疫病是一項重要的措施，而影響疫苗免疫效果的最重要因素為病毒液的滴度，本研究針對牛傳染性鼻氣管炎病毒制備工藝中的各個參數(shù)進行了優(yōu)化，確定了最佳接毒時間、接種比例和收獲時間，以獲得較高的病毒滴度，并優(yōu)選了一種病毒保護劑，有效延長了半成品病毒液的保存期。

牛傳染性鼻氣管炎屬于皰疹病毒科，而皰疹病毒侵入細胞的方式不止是細胞的吞噬作用，可能病毒囊膜與細胞膜的融合是病毒進入細胞的主要方式^[8]。而細胞數(shù)越多膜面積也越大，從而進入細胞的病毒量也越多，而細胞病變越多所釋放出來的病毒也就越多，因此正如結(jié)果所示，病毒液的病毒滴度與接毒前細胞數(shù)和病毒液的收獲時間呈正比。

4 結(jié)論

對牛傳染性鼻氣管炎病毒的制備工藝進行了優(yōu)化研究，確定了最佳接毒時間為：細胞培養(yǎng)72h長成致密單層細胞后接毒且不吸附，接種比例為0.01%，收獲時間為細胞100%病變，以此收獲的病毒液滴度可穩(wěn)定在7.5 lg（TCID₅₀/0.1mL）以上;優(yōu)選了一種病毒保護劑，有效延長了半成品病毒液的保存期。

參考文獻：

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*通訊作者：郁宏偉（1979— ），高級獸醫(yī)師，博士，研究方向為畜禽疫病防控。