丁雪兒, 侯 瀟, 鄧祖湖

(福建農(nóng)林大學(xué)國家甘蔗工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，福建 福州 350002)

甘蔗(Saccharumofficinarum)為禾本科甘蔗屬植物，主要分布在熱帶與亞熱帶地區(qū)，生產(chǎn)上主要以蔗莖進(jìn)行無性繁殖，并可多年宿根[1-2]。甘蔗屬與蔗茅屬、芒屬、硬穗屬和河八王屬組成“甘蔗復(fù)合體”[3]，這些近緣屬野生種是拓寬甘蔗遺傳基礎(chǔ)的重要種質(zhì)資源[4]。甘蔗屬內(nèi)分為6個種，包括4個栽培種(熱帶種、中國種、印度種和食穗種)和2個野生種(割手密種和大莖野生種)。

染色體是生物細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的載體，每個物種都有一定數(shù)目及一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的染色體[5]。現(xiàn)代甘蔗品種是異源雜合的非整倍體作物，染色體數(shù)較多且組成復(fù)雜，該遺傳背景使染色體遺傳研究較困難。Burner et al[6]研究發(fā)現(xiàn)，染色體傳遞方式可能會影響甘蔗育種的選擇效率和育種進(jìn)展。在甘蔗野生種質(zhì)利用過程中，把染色體遺傳行為與甘蔗材料表型相結(jié)合研究，對促進(jìn)遺傳育種有重要意義。本文綜述了染色體遺傳方式、基因組原位雜交(genomicinsituhybridization, GISH)技術(shù)以及寡核苷酸熒光原位雜交(oligonucleotide fluorescenceinsituhybridization, oligo-FISH)技術(shù)在甘蔗染色體上的研究進(jìn)展，以期為研究甘蔗及近緣屬物種基因組結(jié)構(gòu)提供參考。

1 甘蔗染色體的遺傳方式

1.1 甘蔗屬種間雜交后代的染色體遺傳方式

熱帶種(2n=80)又稱為“高貴種”,含糖量高且粗大，對水肥要求高[7]。熱帶種作為“高貴化”育種的原始親本和回交親本，與野生種質(zhì)資源雜交以創(chuàng)新種質(zhì)。野生種割手密莖徑細(xì)、含糖量低但再生能力較高。熱帶種與割手密雜交能將熱帶種的高糖性狀和高產(chǎn)量的潛力與割手密的抗逆性相結(jié)合，改善雜交后代的宿根能力和適應(yīng)性?，F(xiàn)代甘蔗栽培種品種主要是熱帶種和割手密雜交而來的非整倍體，染色體數(shù)目約100～130條，其中70%～80%來自熱帶種，10%～20%來自割手密，約10%來自二者之間的相互重組[8]。

1961年，Bremer[9]基于染色體計數(shù)的細(xì)胞遺傳學(xué)研究表明，熱帶種與割手密雜交F1代以及F1再與純正熱帶種回交得到的BC1染色體傳遞方式大多為2n+n，即熱帶種作為母本將全部的染色體傳遞給F1和BC1代。該遺傳方式加快了熱帶種大莖、高糖性狀的恢復(fù)速度并減少割手密野生血緣，使甘蔗在割手密“高貴化”育種中的優(yōu)良性狀得以迅速恢復(fù)。但Price[10]研究表明，熱帶種×割手密雜交后代也有n+n的遺傳方式。熱帶種與割手密雜交品種中，產(chǎn)量較高的品種都出自2n+n組合[11]。熱帶種與割手密雜交多以熱帶種作母本，以割手密做母本則較少。Kandasami[12]研究表明,以割手密為母本、熱帶種為父本的雜交后代大多以n+n的方式傳遞，少數(shù)為2n+n的方式。Price[10]研究表明，熱帶種與熱帶種雜交或者熱帶種與大莖野生種雜交，其染色體大多以n+n的方式傳遞，少數(shù)以2n+2n的方式。2n=60的大莖野生種與割手密(2n=64)雜交，染色體呈n+n傳遞；而2n=80的大莖野生種與割手密雜交，染色體大多呈2n+n傳遞，少數(shù)以n+n的方式傳遞[11]。

1.2 甘蔗屬與近緣屬雜交后代的染色體遺傳方式

1.2.1 與蔗茅屬雜交 通常把斑茅歸類到蔗茅屬，但Lloyd et al[13]通過分子研究認(rèn)為斑茅屬于Tripidium屬。斑茅具有生物量大、抗旱耐瘠、適應(yīng)性廣和宿根性強等優(yōu)良性狀，是甘蔗品種改良的重要種質(zhì)[14]。對斑茅的利用已有一百多年，但由于甘蔗與斑茅之間的真正雜交種無花粉或花粉不育，難以進(jìn)行屬間雜交，因此未能選育到斑茅真實雜種。2001年，海南甘蔗育種場以甘蔗與斑茅雜交的F1代做母本大量雜交獲得了少量的BC1雜種，隨后育成一批BC2等更多高世代材料[15]。

鄧祖湖等[16]對熱帶種Badila與海南斑茅92-105雜交得到的崖城96-66染色體數(shù)以及Badila再與崖城96-66雜交得到的崖城96-40染色體數(shù)研究表明，甘蔗與斑茅F1代染色體遺傳方式為n+n。黃永吉等[17]研究表明，甘蔗與斑茅BC1代染色體以2n+n的方式傳遞。Wu et al[1]研究表明，甘蔗與斑茅雜交BC1后代存在超2n+n的染色體傳遞現(xiàn)象。Huang et al[18]研究表明,甘蔗與斑茅雜交的BC2、BC3代染色體傳遞方式基本符合n+n，其中斑茅染色體存在不斷丟失現(xiàn)象。Yang et al[19]對新臺糖10號與YCE03-01(BC2)雜交后代BC3和BC4研究表明，從BC3到BC4斑茅染色體數(shù)量大約減少了一半，但有少數(shù)后代減少數(shù)量超過或少于一半。可能在染色體分離過程中，斑茅染色體基數(shù)(x=10)少于10條，因此染色體按隨機(jī)的方式分配。

在甘蔗染色體傳遞研究中，親本染色體遺傳給后代大多不是親本原來一倍體的染色體數(shù)目，染色體數(shù)目發(fā)生了增減。D′Hont et al[20]研究表明，熱帶種BNS3066與斑茅IK76-48的雜交種并非70條染色體，而是39條來自熱帶種，25～26條來自斑茅。此外，也有雜種中熱帶種的染色體數(shù)為48～52條[21]。Piperidis et al[22]研究認(rèn)為，利用GISH技術(shù)可以觀察到熱帶種和割手密之間的染色體重組，Huang et al[18]研究表明，甘蔗與斑茅雜交后代存在染色體易位現(xiàn)象，染色體易位發(fā)生在斑茅染色體的末端，且易位現(xiàn)象可以穩(wěn)定遺傳。甘蔗與斑茅之間有很大的遺傳距離[23-25]，屬間的染色體易位可以發(fā)生在BC1、BC2和BC3代，這種遺傳變異對甘蔗的育種改良有積極的意義[18]。

滇蔗茅與甘蔗的親緣關(guān)系較近[26]。林秀琴等[27]研究表明，甘蔗與滇蔗茅屬間遠(yuǎn)緣雜交的F1代染色體以n+n方式遺傳，BC1代以2n+n方式遺傳。王先宏等[28]對甘蔗栽培品種與昆明蔗茅雜交產(chǎn)生的F1代進(jìn)行GISH研究表明，甘蔗與蔗茅雜種F1代染色體組成為n+n及2n+n；F1代再與新臺糖10號雜交，親本染色體在子代中的染色體傳遞方式為2n+n；F2代與新臺糖10號回交獲得的BC1代中，染色體以n+n的方式傳遞。在甘蔗種間及屬間雜交時，雜種后代染色體數(shù)目比雙親各自單倍的配子體染色體數(shù)目之和多，這種現(xiàn)象源于母本一方染色體的“二倍化”。王先宏等[29]認(rèn)為，母本染色體在子代中以2n方式傳遞。

1.2.2 與河八王雜交 河八王是甘蔗的近緣屬野生種，具有耐旱、耐瘦、分蘗力強等優(yōu)點。劉昔輝等[30]研究表明，甘蔗與河八王雜交F1代染色體傳遞方式為：n+n和n+2n，BC1染色體傳遞方式為n+n。段維興等[31]認(rèn)為，甘蔗與河八王雜交的BC1和BC2代染色體均以n+n方式傳遞。以上說明，河八王或河八王后代和甘蔗雜交(回交)中，甘蔗染色體以配子n的方式傳遞給下一代。

1.3 甘蔗屬與斑割復(fù)合體雜交后代的染色體遺傳方式

國內(nèi)外對斑茅和割手密的利用都是用甘蔗與斑茅或割手密雜交，再以雜種為父本與甘蔗進(jìn)行“高貴化”回交。甘蔗與割手密雜交的F1代可育；但甘蔗與斑茅是屬間雜交，其F1代不育或育性極低，難以進(jìn)一步雜交。利用斑茅與割手密雜交獲得斑割復(fù)合體，再與甘蔗進(jìn)行雜交和回交，既有可能結(jié)合野生種質(zhì)的優(yōu)異性狀，又可以解決甘蔗與斑茅雜交后代不育的難題。劉許輝[32]和黃玉新等[33]研究表明，粵糖93-159和桂糖02-761與斑割復(fù)合體GXAS07-6-1雜交的F1代染色體遺傳方式為n+n。此外，甘蔗與斑割復(fù)合體雜交時，斑茅在親子間傳遞過程中存在染色體丟失，但未發(fā)現(xiàn)有染色體的交換和易位現(xiàn)象。

綜上所述，由于遺傳背景復(fù)雜，在有性雜交過程中甘蔗后代的染色體傳遞往往不符合經(jīng)典的細(xì)胞遺傳規(guī)律。在甘蔗遠(yuǎn)緣雜交中，由于配子染色體的不平衡分配，染色體傳遞呈現(xiàn)多種形式，包括n+n、n+2n、2n+n和超2n+n等方式。鄭成木[34]研究認(rèn)為，甘蔗細(xì)胞染色體數(shù)目變化可能是由于祖親(不同物種)的細(xì)胞周期不同，使得在雜種中來自不同物種的染色體行為不同步，導(dǎo)致細(xì)胞分裂過程中染色體分配不均衡所造成。在傳遞配子過程中，親本出現(xiàn)少于體細(xì)胞、配子原本的數(shù)目，與染色體的丟失有關(guān)[35]。在甘蔗育種中，減數(shù)分裂異常導(dǎo)致了2n配子的產(chǎn)生，熱帶種形成的2n配子使得“高貴種”的高糖基因得以保留。吳嘉云等[36]鑒定了甘蔗和斑茅雜交后代的抗性表明，2n及超2n配子的出現(xiàn)提高了雜交后代的抗性。因此，深入了解2n配子的形成規(guī)律將有利于提高甘蔗育種效率。

2 GISH技術(shù)在甘蔗染色體研究中的應(yīng)用

甘蔗是復(fù)雜的異源多倍體植物，染色體數(shù)目眾多且形態(tài)小、相似性高，給染色體識別帶來了較大的困難。以往的研究大多根據(jù)細(xì)胞學(xué)水平的計數(shù)和核型分析，無法準(zhǔn)確闡明甘蔗遠(yuǎn)緣雜交后代染色體的遺傳行為。原位雜交是根據(jù)核酸分子堿基配對的原則，將經(jīng)放射性或非放射性的外源核酸序列如基因組DNA與染色體經(jīng)過變性的DNA互補配對，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，再經(jīng)一定的檢測手段將待測核酸在染色體上的位置顯示出來[37]。通過熒光素檢測雜交位點的原位雜交稱為熒光原位雜交。其中，將不同物種的基因組DNA標(biāo)記為探針的技術(shù)稱為基因組原位雜交技術(shù)，主要應(yīng)用于鑒定種間親緣關(guān)系及異源染色質(zhì)。近年來GISH技術(shù)發(fā)展迅速，使甘蔗細(xì)胞學(xué)研究進(jìn)展明顯。GISH技術(shù)還可用來研究甘蔗染色體重組。早期，Price[38]認(rèn)為甘蔗雜交后代熱帶種與割手密不發(fā)生重組。1996年，D′Hont et al[39]利用GISH技術(shù)研究栽培種R570(2n≈115)，發(fā)現(xiàn)該品種有約10%的熱帶種和割手密的重組染色體。羅宗蘋[40]對新臺糖25號和新臺糖16號進(jìn)行GISH，區(qū)分出了熱帶種血緣和割手密血緣，以及發(fā)生交換、重組的染色體。GISH也是對遠(yuǎn)緣雜交后代中的染色體進(jìn)行鑒定的有效工具，用不同標(biāo)記的雙親DNA探針可將來自不同親本的染色體區(qū)分開。若親緣關(guān)系不密切，如屬間關(guān)系，進(jìn)行基因組原位雜交會出現(xiàn)明顯的紅綠熒光信號，從而清晰地判斷染色體來源。林秀琴等[41]應(yīng)用GISH技術(shù)，鑒定出甘蔗屬熱帶種與滇蔗茅遠(yuǎn)緣雜交F1代含雙親本的染色體。應(yīng)用GISH技術(shù)能夠了解和探明現(xiàn)代甘蔗品種的復(fù)雜性，同時為甘蔗屬的分類和染色體遺傳提供證據(jù)[42]。

3 oligo-FISH技術(shù)在甘蔗染色體研究中的應(yīng)用

甘蔗染色體大小相似，利用傳統(tǒng)FISH技術(shù)識別具有挑戰(zhàn)性。近年來隨著甘蔗基因組參考序列研究取得突破，使開發(fā)甘蔗染色體或染色體區(qū)域的特異寡核苷酸(oligo)探針成為可能。oligo探針可為每條異源或同源染色體產(chǎn)生唯一條形碼。oligo-FISH技術(shù)是根據(jù)已測序的基因組序列設(shè)計覆蓋染色體部分片段的oligo作為探針的FISH技術(shù)，寡核苷酸探針是人工合成的，適用于染色體識別與核型構(gòu)建[43]。oligo探針可分為染色體條形碼和染色體涂染。染色體涂染是將整條染色體上oligo用來設(shè)計探針，從而達(dá)到對物種某一單條染色體進(jìn)行涂染的目的[25]。已有學(xué)者利用oligo-FISH技術(shù)觀察和追蹤水稻[44]、柑橘[45]、玉米[46]和楊樹[47]等植物的染色體有絲分裂和減數(shù)分裂時期的形態(tài)變化。

Piperidis et al[48]結(jié)合olig-FISH與GISH技術(shù)，研究了現(xiàn)代甘蔗品種及其親本代表種的基因組結(jié)構(gòu)，證實了熱帶種的染色體基數(shù)為10，并推測割手密經(jīng)過染色體融合后，基數(shù)從10到9再到8的逐步演化。Meng et al[49]基于高粱基因組設(shè)計和合成了染色體特異oligo探針，對割手密SES208(2n=8x=64)進(jìn)行FISH，證實了割手密的染色體重排導(dǎo)致染色體基數(shù)由10減少到8。目前利用oligo-FISH技術(shù)已識別了熱帶種和割手密染色體，但對甘蔗近緣屬細(xì)胞學(xué)研究較少。染色體基數(shù)為8的割手密oligo探針對甘蔗近緣屬染色體識別效果不理想，因此開發(fā)基數(shù)為10的oligo染色體全涂染探針對甘蔗屬及甘蔗屬復(fù)合體中的芒屬、河八王屬和蔗茅屬材料進(jìn)行染色體鑒定具有重要意義。

oligo-FISH技術(shù)能夠識別單個染色體，為甘蔗復(fù)雜基因組的組裝奠定了基礎(chǔ)，是研究甘蔗染色體的有利工具。隨著研究深入，利用oligo-FISH技術(shù)可對甘蔗與野生種質(zhì)雜交進(jìn)行精確的染色體遺傳研究。FISH技術(shù)不僅可以用來鑒定斑茅染色體，也可以用來鑒定其他近緣屬物種。目前，河八王、蔗茅、滇蔗茅等野生近緣屬已經(jīng)成功與甘蔗屬雜交獲得后代。斑茅作為重要的野生種質(zhì)資源，斑茅血緣的滲入提高了甘蔗雜交后代的抗性。將甘蔗與斑茅雜交高世代中的染色體和表型相聯(lián)系，進(jìn)一步把抗性材料的優(yōu)良性狀鎖定在某一或某些染色體上，深入挖掘抗性基因，將能更好地利用野生種質(zhì)資源，創(chuàng)制優(yōu)良親本、材料或品種。

4 展望

本文從甘蔗染色體遺傳方式、GISH技術(shù)和oligo-FISH技術(shù)應(yīng)用等方面綜述了甘蔗染色體遺傳研究進(jìn)展，為分析甘蔗以及近緣屬物種基因組結(jié)構(gòu)提供細(xì)胞學(xué)依據(jù)。oligo-FISH技術(shù)的發(fā)展使之前研究的數(shù)量關(guān)系發(fā)展到精確的染色體識別上，有利于了解甘蔗近緣屬野生種質(zhì)材料的細(xì)胞遺傳信息，可將oligo-FISH與GISH結(jié)合用于探明甘蔗品種的染色體核型，輔助甘蔗基因組的組裝。