吳瑾，陸元蘭，張爐英，胡杰，岑祥瑩，喻安永，謝智慧

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 1.急診科，2.重癥醫(yī)學(xué)科，3.高壓氧科，貴州 遵義 563003)

敵草快(Diquat，DQ)作為一種速效的非選擇性雙吡啶類除草劑，其結(jié)構(gòu)與百草枯(Paraquat，PQ)相似。隨著國內(nèi)PQ水劑停產(chǎn)，DQ作為農(nóng)業(yè)或家庭除草劑在市場上的銷售量劇增，同時(shí)關(guān)于DQ中毒的病例報(bào)道也越來越多[1]。據(jù)研究，DQ的潛在毒性主要與它可以通過氧化還原產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激致細(xì)胞死亡有關(guān)。急性DQ中毒時(shí)會造成機(jī)體多臟器損傷，如消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、腎臟和神經(jīng)系統(tǒng)損傷等[2]。目前急性DQ中毒的治療措施主要以減少毒物接觸與吸收、清除氧自由基、抗炎等為主[3]；而對于DQ導(dǎo)致神經(jīng)損傷的治療仍無明顯有效方案，DQ的神經(jīng)毒性損傷機(jī)制也不清楚。線粒體是動(dòng)態(tài)的雙膜細(xì)胞器，通過氧化磷酸化生成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)為機(jī)體提供活動(dòng)所需能量；線粒體自噬是特異性清除受損線粒體的自噬現(xiàn)象，維持著線粒體的質(zhì)量控制(quantity control，QC)[4]。PTEN誘導(dǎo)的假定激酶1(PINK1)及Parkin蛋白組成自噬通路，是線粒體自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白[5]；當(dāng)機(jī)體發(fā)生急性DQ中毒時(shí)，體內(nèi)驟變的氧化應(yīng)激環(huán)境使線粒體膜電位發(fā)生改變，此時(shí)Parkin蛋白則被激活并招募至受損線粒體外膜上參與介導(dǎo)受損線粒體的自噬[6]；而PINK1作為感知受損線粒體膜電位變化的重要分子探測器，作用于Parkin蛋白的上游并調(diào)控著Parkin蛋白的轉(zhuǎn)位活動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)，線粒體自噬可以保護(hù)仔豬腸道細(xì)胞免受DQ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激下的細(xì)胞死亡，促進(jìn)了腸道內(nèi)的穩(wěn)態(tài)[7]，可見PINK1/Parkin信號通路調(diào)控的線粒體自噬在維持細(xì)胞正常功能方面發(fā)揮重要作用。因此探討PINK1/Parkin信號通路調(diào)控的線粒體自噬在DQ神經(jīng)元損傷機(jī)制中的作用是很有意義的。作者就PINK1/Parkin信號通路調(diào)控線粒體自噬與DQ神經(jīng)元損傷的關(guān)系作一綜述，期望對DQ神經(jīng)毒性有一新的認(rèn)識，為DQ神經(jīng)損傷治療提供新思路。

1 PINK1/Parkin信號通路調(diào)控線粒體自噬在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究進(jìn)展

PINK1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,是目前已知的唯一具有線粒體靶向結(jié)構(gòu)域的蛋白激酶[8]。健康細(xì)胞中PINK1水平較低，其由含有外膜轉(zhuǎn)位酶40(outer membrane transposase 40，TOM40)和外膜轉(zhuǎn)位酶20(outer membrane transposase20，TOM20)核心的復(fù)合物導(dǎo)入線粒體，并被線粒體加工肽(mitochondrial processing peptidase，MPP)和線粒體菱形蛋白酶PARL(PINK1/PGAM5-associated rhomboid like protease)等線粒體蛋白酶依次切割，而裂解后的PINK1通過N端規(guī)則途徑在細(xì)胞質(zhì)中被迅速降解[9]。人類Parkin蛋白是由PARK2基因編碼的具有E3泛素-蛋白連接酶活性的蛋白，主要介導(dǎo)底物泛素化，調(diào)節(jié)蛋白降解和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等。Parkin蛋白在生理狀態(tài)下處于抑制狀態(tài)，當(dāng)其N-端泛素樣(ubiquitin-like，Ubl)結(jié)構(gòu)域上絲氨酸 65(Serine65，S65)位點(diǎn)發(fā)生磷酸化后活性被激活[10]。當(dāng)線粒體失去內(nèi)膜電化學(xué)梯度即發(fā)生線粒體去極化時(shí)，PINK1向線粒體的導(dǎo)入被抑制，PINK1蛋白穩(wěn)定在線粒體外膜上，此時(shí)線粒體上PINK1激酶活性的積累觸發(fā)了Parkin蛋白的招募和激活[9]。發(fā)生活化的Parkin蛋白會促進(jìn)許多外線粒體膜(outer mitochondrial membrane，OMM)蛋白的泛素化和降解，進(jìn)而介導(dǎo)受損線粒體的自噬清除[11]。有研究顯示，體內(nèi)線粒體電子傳遞鏈破壞后產(chǎn)生過多有害活性氧(ROS)，顯著誘導(dǎo)線粒體損傷[12]，并且這種有害效應(yīng)隨后可能在整個(gè)線粒體網(wǎng)絡(luò)中傳播，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[13]。自噬是一種高度調(diào)控和保守的溶酶體介導(dǎo)的蛋白降解和細(xì)胞器循環(huán)過程。線粒體自噬通過清除可能成為細(xì)胞凋亡信號的受損線粒體促進(jìn)細(xì)胞存活[14]。最初支持Parkin蛋白參與調(diào)節(jié)線粒體功能的研究是在果蠅中進(jìn)行的，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)缺乏Parkin蛋白時(shí)果蠅線粒體出現(xiàn)各種異常表現(xiàn)，如線粒體腫脹、嵴紊亂、對毒物敏感性升高、壽命縮短和運(yùn)動(dòng)缺陷[15-16]。小鼠細(xì)胞缺乏Parkin蛋白時(shí)，線粒體的移動(dòng)和運(yùn)輸可通過微管的過度乙?；灰种芠17]；敲除Parkin蛋白的小鼠線粒體形態(tài)和線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)水平發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致了多巴胺(Dopamine，DA)神經(jīng)元的退化和運(yùn)動(dòng)障礙[18-19]。Nemes等[20]發(fā)現(xiàn)，在阿爾茲海默病(Alzheimer’s disease，AD)神經(jīng)元內(nèi)的高磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau聚集物，即神經(jīng)纖維纏結(jié)(nerve fiber tangles，NFTs)中，Parkin是γ-谷氨酰鍵交聯(lián)的主要成分，首次提示Parkin與AD之間存在關(guān)系；而Corsetti等[21]的研究表明AD個(gè)體中N末端微管結(jié)合蛋白tau的截?cái)嗤ㄟ^異常招募Parkin蛋白引起線粒體自噬失調(diào)，最終導(dǎo)致線粒體過度翻轉(zhuǎn)、突觸退化和神經(jīng)元死亡的結(jié)果，進(jìn)一步提供了在AD發(fā)病機(jī)制中的Parkin蛋白的相關(guān)機(jī)制；Fiesel等[22]研究表明，帕金森病(Parkinson’s disease，PD)患者的大腦中存在線粒體自噬的依據(jù)。不僅如此，Lan等[23]在雄性大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷中的研究中也觀察到大腦皮層缺血半暗帶神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化及線粒體自噬現(xiàn)象。由此可以看出PINK1/Parkin信號通路及其調(diào)控的線體自噬在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的重要性。

2 PINK1/Parkin信號通路調(diào)控線粒體自噬與DQ中毒后神經(jīng)元損傷的相關(guān)性

2.1 核因子-kB(NF-kB)/P53信號通路在DQ中毒神經(jīng)元損傷中的作用

DQ為吡啶類除草劑，具有強(qiáng)氧化性。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)PC12神經(jīng)細(xì)胞暴露于DQ溶液時(shí)，DQ可抑制線粒體復(fù)合物Ⅰ活性，產(chǎn)生過多的ROS促使細(xì)胞色素C釋放至胞質(zhì)，活化半胱天冬酶-3(caspase 3)表達(dá)介導(dǎo)PC12神經(jīng)細(xì)胞死亡，在該過程中上調(diào)的ROS導(dǎo)致鈣離子失調(diào)，破壞線粒體膜電位，導(dǎo)致線粒體功能障礙[24]；NF-kB是一種普遍存在于胞質(zhì)中的異二聚體，非刺激狀態(tài)下以無活性狀態(tài)存在[25]。氧化應(yīng)激下ROS可促進(jìn)蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的激活，活化的PKC磷酸化抑制蛋白IkB[26]，導(dǎo)致IkB與NF-kB解離而使NF-kB活化；NF-kB可進(jìn)一步調(diào)控炎癥過程，在促凋亡因子P53的啟動(dòng)序列中，NF-kB可以通過NF-kB位點(diǎn)直接調(diào)控促凋亡因子P53的表達(dá)，最終使PC12神經(jīng)細(xì)胞中的NF-kB和P53表達(dá)增強(qiáng)，沉積于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中[24]。促凋亡因子P53在正常生理狀態(tài)下可通過細(xì)胞色素C氧化酶2(cytochrome C oxidase 2，SCO2)的反式激活維持線粒體正常呼吸，但在應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，ROS的生成增多促進(jìn)P53誘導(dǎo)mieap誘導(dǎo)線粒體內(nèi)溶酶體樣細(xì)胞器(mieap-induced accumulation of lysosome-like organelles within mitochondria，MALM)的積累以修復(fù)功能不全線粒體，mieap誘導(dǎo)空泡(mieap-induced vacuole，MIV)完成受損的線粒體降解；當(dāng)應(yīng)激或損傷不可逆時(shí)，P53則會易位進(jìn)入線粒體外膜，導(dǎo)致線粒體促凋亡基因Bax和Bak的釋放。Bax和Bak分別可以形成線粒體通透性過渡孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)一步加重線粒體功能障礙，最終可導(dǎo)致PC12神經(jīng)細(xì)胞凋亡[27]；當(dāng)PC12神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine，NAC)預(yù)處理后，再次暴露于DQ溶液時(shí)，NAC抑制NF-kB信號及P53的表達(dá)，減輕了PC12神經(jīng)細(xì)胞的凋亡[28]。以上研究說明在DQ中毒后，NF-kB與P53因子協(xié)同激活保守的線粒體死亡途徑(包括Bax激活、細(xì)胞色素C釋放和半胱天冬酶的激活)[24]，促進(jìn)神經(jīng)元死亡。

2.2 Parkin蛋白與NF-kB/P53信號通路在DQ中毒神經(jīng)元損傷中的作用

DQ中毒后通過氧化還原抑制線粒體呼吸復(fù)合物Ⅰ的活性，引起線粒體膜電位改變[29]，進(jìn)一步造成線粒體外膜上具有線粒體靶向結(jié)構(gòu)域的蛋白激酶PINK1積累，觸發(fā)了Parkin蛋白的招募和激活[9]，活化的Parkin蛋白則促進(jìn)線粒體外膜蛋白的泛素化和降解[30-31]，最終導(dǎo)致受損線粒體的自噬清除。研究發(fā)現(xiàn)，在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中，Parkin蛋白對應(yīng)激狀態(tài)下的細(xì)胞有保護(hù)作用。細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激時(shí)，Parkin增加了NF-kB基本調(diào)節(jié)器(NF-kB essential modulator，NEMO)的線性泛素化，上調(diào)NF-kB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)；而NF-kB進(jìn)一步上調(diào)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞中位于線粒體膜間隙的視神經(jīng)萎縮1(optic atrophy 1，OPA1)的表達(dá)，進(jìn)而維護(hù)線粒體完整性和保護(hù)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，其中OPA1是線粒體嵴完整性的關(guān)鍵調(diào)控因子，可以調(diào)控細(xì)胞色素C的釋放。另外，研究也發(fā)現(xiàn)Parkin蛋白可以通過NEMO誘導(dǎo)OPA1的表達(dá)和加工過程，阻止細(xì)胞色素C的釋放[32],NEMO是IkB激酶的核心調(diào)控因子[33]。Henn等[34]發(fā)現(xiàn),在NF-kB信號通路中，IkB的超阻遏物過表達(dá)時(shí)Parkin蛋白便不能再刺激NF-kB的轉(zhuǎn)錄；在IkB激酶信號小體水平，非活性的IKKβ突變體阻斷了NF-kB信號通路的激活，說明Parkin蛋白可能作用在IKK復(fù)合物和(或)其上游成分，其神經(jīng)保護(hù)作用也依賴于IKB激酶/NF-kB信號通路的激活。Sha等[35]研究發(fā)現(xiàn)，PINK1作用在Parkin蛋白的上游，也參與了IkB激酶/NF-kB信號通路增強(qiáng)Parkin蛋白介導(dǎo)的泛素信號參與的神經(jīng)保護(hù)作用。此外，也有研究表明促凋亡因子P53的表達(dá)可被Parkin蛋白抑制[36]，說明在發(fā)生DQ中毒時(shí)，Parkin蛋白不僅可以通過調(diào)控線粒體自噬也可通過上調(diào)NF-kB表達(dá)及抑制P53因子表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)功能。

2.3 PINK1蛋白與NF-kB/P53信號通路在DQ中毒神經(jīng)元損傷中的作用

Lim等[37]研究發(fā)現(xiàn),在PINK1蛋白導(dǎo)入線粒體時(shí)，全長PINK1被一系列線粒體蛋白酶逐步修飾為53 kDa的裂解形態(tài)(PINK1-53)，PINK1-53不抑制Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬，相反，它似乎觸發(fā)Parkin轉(zhuǎn)位到正常線粒體，促進(jìn)線粒體自噬，引起自身的清除；在沒有異位全長PINK1參與的情況下，通過進(jìn)一步檢測不被降解的PINK1截?cái)嗤蛔凅wPINK1△104的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，PINK1△104被腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白6(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)泛素化，TARF6是PINK1穩(wěn)定的調(diào)節(jié)因子，也是NF-kB通路的傳感器，說明NF-kB通路激活穩(wěn)定了PINK1-53的表達(dá)，間接地穩(wěn)定了線粒體自噬。而當(dāng)DQ中毒時(shí)，NF-kB功能激活，P53基因表達(dá)上調(diào)。Goiran等[38]研究發(fā)現(xiàn)，P53基因通過抑制PINK1啟動(dòng)子活性及其蛋白和mRNA表達(dá)水平來控制其表達(dá)，揭示PINK1是第一個(gè)被P53轉(zhuǎn)錄抑制的促自噬基因，Parkin蛋白抑制P53基因的表達(dá)，他們通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了P53對PINK1的調(diào)控與Parkin無關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Parkin也可以在PINK1上游作用，以調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄和促自噬功能。

3 PINK1/Parkin信號通路調(diào)控線粒體自噬在DQ中毒神經(jīng)元損傷中的治療展望

PINK1/Parkin信號通路介導(dǎo)受損線粒體的自噬清除對于維持神經(jīng)元正常功能是至關(guān)重要的，增強(qiáng)PINK1/Parkin信號通路介導(dǎo)的線粒體自噬可減輕神經(jīng)元損傷。Lin等[39]研究表明,鼠草尾酸(carnosic acid，CA)通過激活PINK1/Parkin/線粒體自噬途徑，可以保護(hù)SH-SY5Y細(xì)胞免受6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)誘導(dǎo)的線粒體損傷。具有抗氧化、抗衰老、抗疲勞的紅景天苷(Sal)通過增強(qiáng)PINK1和Parkin蛋白在線粒體上的表達(dá)，顯著增加了線粒體自噬和自噬通量，在MPP+/MPTP誘導(dǎo)的PD模型中，Sal可能通過增強(qiáng)PINK1/Parkin蛋白介導(dǎo)的線粒體自噬而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[40]。順鉑是一種鉑基化療藥物，暴露于順鉑下可誘導(dǎo)PC12神經(jīng)細(xì)胞ROS生成增多，細(xì)胞線粒體膜電位下降，細(xì)胞ATP減少，顯著降低神經(jīng)元的長度和核直徑，引起周圍神經(jīng)病變(peripheral neuropathy,CIPN)；通過建立體外順鉑誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性模型研究，表明PINK1/Parkin/線粒體自噬對順鉑誘導(dǎo)的PC12神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能障礙具有保護(hù)作用，Parkin蛋白過表達(dá)時(shí)顯著增加了神經(jīng)元的長度和核直徑[41]。且最新研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可增強(qiáng)腸線粒體中PINK1和Parkin水平，改善DQ所致的線粒體腫脹、空泡化和嵴破裂；而當(dāng)白藜蘆醇含量降低時(shí)ROS生成量增多、線粒體膜電位改變、空腸線粒體DNA含量及線粒體復(fù)合物Ⅰ-Ⅳ活性增加，表明在仔豬DQ中毒時(shí)，白藜蘆醇在保護(hù)腸道屏障、改善氧化還原狀態(tài)、減輕線粒體損傷和誘導(dǎo)線粒體自噬方面具有顯著作用[42]。有研究[43-44]發(fā)現(xiàn)，三丁醇在DQ中毒的豬仔中可增加腸道線粒體自噬蛋白(PINK1和Parkin蛋白)的表達(dá)，降低了氧化應(yīng)激和腸道炎癥，誘導(dǎo)了線粒體自噬，改善線粒體功能，進(jìn)而減輕神經(jīng)功能障礙。因此在發(fā)生DQ中毒后，早期及時(shí)維持或增強(qiáng)PINK1及Parkin蛋白的表達(dá)對于神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)是相當(dāng)有意義的。

綜上所述，神經(jīng)保護(hù)蛋白PINK1/Parkin與DQ中毒神經(jīng)元損傷之間通過NF-kB/P53信號通路以及線粒體自噬相互聯(lián)系，DQ中毒后給予藥物干預(yù)可以通過增加線粒體自噬蛋白PINK1和Parkin的表達(dá)改善線粒體功能，減輕神經(jīng)元損傷。因此，臨床上發(fā)生急性DQ中毒時(shí)，維持PINK1和Parkin蛋白表達(dá)，加強(qiáng)PINK1/Parkins信號通路調(diào)控的線粒體自噬將會是減輕DQ中毒神經(jīng)元損傷的工作重點(diǎn)，也是我們的努力方向，期望能進(jìn)一步明確DQ中毒神經(jīng)損傷的機(jī)制，為DQ中毒神經(jīng)損傷的治療提供合理的理論依據(jù)。