徐曉瑩，黃華，陳坤，徐惠章，史文凱，張金浩，王鶴

（煙臺市海洋經(jīng)濟研究院，山東 煙臺 264000）

雨生紅球藻Haematococcus pluvialis 屬綠藻門、綠藻綱、團藻目、紅球藻科、紅球藻屬，是自然界中蝦青素含量最高的生物[1,2]，已被廣泛應用于水產(chǎn)和家畜、禽養(yǎng)殖、醫(yī)藥、食品、化妝品等領域。利用雨生紅球藻生產(chǎn)天然蝦青素已成為高值經(jīng)濟微藻技術(shù)研發(fā)的熱點。但雨生紅球藻培育條件要求高，易被其他微藻、雜菌污染，生長緩慢，培養(yǎng)周期長。因此，篩選生長速率快、蝦青素含量高的雨生紅球藻株是亟待解決的問題。本文主要概述了雨生紅球藻育種研究現(xiàn)狀，并展望其應用前景。

1 雨生紅球藻的藻種改良趨勢

與大部分微藻不同，雨生紅球藻具有游動細胞和不動細胞等多形態(tài)交互變化的生活史特征，并受培養(yǎng)基組成和環(huán)境條件的影響。從游動細胞向不動細胞的轉(zhuǎn)變過程通常伴隨著蝦青素的不斷積累，因此,近年來有關雨生紅球藻的研究主要集中在蝦青素的誘導因素及其相關代謝與調(diào)控機制[3-8]。雨生紅球藻生長緩慢，培養(yǎng)條件要求高，細胞難以進行高密度培養(yǎng)。目前商業(yè)化生產(chǎn)的雨生紅球藻，基本上都是采用傳統(tǒng)光自養(yǎng)方式，即在開放式跑道池或各類光生物反應器中進行。光自養(yǎng)方式產(chǎn)率低，對室外光照條件要求高，收獲物的培養(yǎng)密度也不高，一般僅為1～3 g·L-1[9,10]。這直接造成了雨生紅球藻藻粉的供應遠不能滿足下游蝦青素生產(chǎn)加工產(chǎn)業(yè)的需求。

除了光自養(yǎng)的生長方式外，也嘗試通過異養(yǎng)或混養(yǎng)的方式培養(yǎng)雨生紅球藻，迄今已證明，乙酸鈉是雨生紅球藻最有效的有機碳源[11-13]。Hata 等[14]通過分批補料添加乙酸鈉的方式使雨生紅球藻細胞培養(yǎng)密度達到7 g·L-1；Wan 等[15]報道，雨生紅球藻的異養(yǎng)培養(yǎng)密度可達26 g·L-1，生物量產(chǎn)率達64.1 mg·L-1·h-1。這表明雨生紅球藻的異養(yǎng)或混養(yǎng)培養(yǎng)方式可有效提高雨生紅球藻的生物量產(chǎn)出，降低生產(chǎn)成本。

異養(yǎng)雨生紅球藻的生長優(yōu)勢強于自養(yǎng)方式，可獲得高密度培養(yǎng)物，但是，雨生紅球藻的異養(yǎng)培養(yǎng)仍存在明顯的缺陷。首先，生長速率較低。乙酸對細胞生長起抑制作用，在傳統(tǒng)微生物發(fā)酵中乙酸一般是作為一種不利的副產(chǎn)物，以乙酸為底物的發(fā)酵過程一般效率較低。Hata 等[14]和Wan 等[15]的研究中都采用pH 調(diào)控的方式進行補料，控制體系濃度與添加量。他們都發(fā)現(xiàn)乙酸并不利于雨生紅球藻游動營養(yǎng)細胞的繁殖，這導致細胞的生長速率低，為獲得高密度培養(yǎng)物往往需要長時間培養(yǎng)。

其次，異養(yǎng)過程也不利于蝦青素積累。有研究證明：異養(yǎng)生長的蝦青素積累效率遠低于光自養(yǎng)誘導條件[16]。為提高細胞積累蝦青素的效率，Hata 等[14]通過強光誘導后，單蝦青素產(chǎn)率為4.4 mg·L-1·d-1，并不高于自養(yǎng)過程的6.3 mg·L-1·d-1。Wan 等[15]則通過細胞稀釋、光自養(yǎng)培養(yǎng)以及光誘導蝦青素積累的三步過程，實現(xiàn)了6.4 mg·L-1·d-1的蝦青素產(chǎn)率，持平于自養(yǎng)過程。但是，這種方式并未跳過傳統(tǒng)二步法的雨生紅球藻蝦青素生產(chǎn)過程。因此，雨生紅球藻異養(yǎng)生長能力仍然有待改善，獲得具有更高異養(yǎng)細胞生長速率、能夠利用糖類等更多碳源底物的高效誘導積累蝦青素優(yōu)良藻株，可能是未來藻種異養(yǎng)性狀改良較有發(fā)展?jié)摿Φ难芯糠较颉?/p>

2 雨生紅球藻的育種研究現(xiàn)狀

為進一步促進雨生紅球藻的商業(yè)化應用，提高產(chǎn)品價值和產(chǎn)業(yè)效益，選擇適應能力強、生長繁殖快的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)雨生紅球藻是努力方向。

2.1 選擇育種

選擇育種是利用現(xiàn)有種類通過馴化與自然選擇而育成新品種。這種育種方法簡單易行、安全性好。張寶玉等[17]通過自然選育的方式，比較分析了四個品系的雨生紅球藻在不同溫度下的生長速率、生物量、蝦青素含量和產(chǎn)量，選育出適合在較高和較低溫度下大規(guī)模培養(yǎng)的雨生紅球藻品系。但該育種方式下藻株發(fā)生變異的機率較小，育種周期長，選育的藻株普遍存在遺傳性狀不穩(wěn)定的缺點。

2.2 誘變育種

誘變育種操作簡單、成本低、效率高，使用較為廣泛。通過物理或化學誘變選育雨生紅球藻的報道較多。Tjahjono 等[18]用甲基磺酸乙酯（EMS）誘變處理雨生紅球藻，并利用瓊脂板分離方法篩選出具有氟啶酮抗性的兩個突變株、具有達草滅抗性的四個突變株以及具有尼古丁抗性的多個突變株。Tripathi等[19]分別采用不同照射時間的紫外線和不同濃度的甲基磺酸乙酯（EMS）處理雨生紅球藻，發(fā)現(xiàn)藻細胞的生長速率和蝦青素含量隨著誘變劑量的增加而增加，但藻細胞存活率下降；將處理后存活的藻細胞進一步用除草劑進行篩選，并未得到單一的突變株。蔣霞敏等[20]主要研究了不同劑量紫外線照射后雨生紅球藻細胞生長、色素含量等指標的變化。結(jié)果顯示：經(jīng)紫外線輻射后，藻細胞葉綠素和類胡蘿卜素含量增加；經(jīng)紫外輻射4～5 min 后，藻細胞蝦青素含量顯著提高。肖媛等[21]研究了波長范圍為280～320 nm 的紫外線（UV-B）輻射對雨生紅球藻細胞的一系列生理生化過程的影響。結(jié)果表明：UV-B輻射可降低雨生紅球藻光合活性，抑制生物量的增加，改變類胡蘿卜素和蝦青素的含量并影響細胞內(nèi)ROS 的含量，降低抗氧化酶活性。丁雅婷等[22]探索了等離子體、喹禾靈等不同誘變方式及不同篩選條件對雨生紅球藻的影響，最終篩選出生物量和蝦青素含量均有所提高的三株優(yōu)良性狀突變藻株。誘變育種對遺傳物質(zhì)DNA 的操作針對性不強，且在操作時對人體及環(huán)境有一定的危害性，但現(xiàn)代分子遺傳學和基因工程等相關科學技術(shù)的迅猛發(fā)展為定向誘變奠定了基礎。

2.3 基因工程育種

基因工程育種是在分子水平上對基因進行操作的復雜技術(shù)，是將外源基因通過體外重組后導入受體細胞內(nèi)，使目標基因能在受體細胞內(nèi)復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達的操作?；蚬こ逃N目標明確、針對性強，但安全性還有待進一步驗證。鄭凱靜等[23]利用RT-PCR 技術(shù)從一株雨生紅球藻總RNA 中擴增出β-胡蘿卜素羥化酶基因的cDNA 序列，并經(jīng)過多序列比對分析表明，雨生紅球藻與萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii 的親緣關系較近，與其他高等植物以及細菌的親緣關系較遠。王娜[24]等從雨生紅球藻中克隆出IPP 異構(gòu)酶基因（ipiHp1），并利用根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens 侵染法和基因槍轉(zhuǎn)化法，將目的基因?qū)胗晟t球藻中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分轉(zhuǎn)化子的生物量與野生型相似，農(nóng)桿菌侵染法轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子A3 蝦青素含量比野生型顯著提高，而基因槍轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子蝦青素含量與野生型并無顯著性差異。龔文芳等[25]利用杜氏鹽藻Dunaliella salina lycB 基因構(gòu)建雨生紅球藻RNAi載體，并將其導入雨生紅球藻細胞，發(fā)現(xiàn)能干擾雨生紅球藻番茄紅素環(huán)化酶，進而影響其β-胡蘿卜素合成代謝。侯善茹等[26]以植物表達載體構(gòu)建了農(nóng)桿菌介導的雨生紅球藻轉(zhuǎn)化方法，成功并穩(wěn)定地表達了報告基因GFP 和YFP，拓寬了pBI121 載體的應用范圍，為雨生紅球藻的轉(zhuǎn)化開辟了新的遺傳轉(zhuǎn)化途徑?？傮w而言，目前雨生紅球藻轉(zhuǎn)化仍然主要依賴于基因槍方法，但可用的表達載體以及篩選標記少、外源基因不能表達等問題仍有待進一步解決。

2.4 細胞融合與雜交育種

細胞融合是將酶解去壁的2 種不同細胞的原生質(zhì)體融合在一起，經(jīng)生長分化，誘導形成新品種。細胞融合可以打破物種界限，實現(xiàn)遠源基因重組，縮短育種周期，提高育種水平。Tjahjono 等[18]將雨生紅球藻的一系列抗抑制物突變體進行原生質(zhì)融合后得到雜交株，其蝦青素的含量是野生型的3 倍。Abomohra 等[27]研究了雨生紅球藻與一株金藻門的藻株Ochromonas danica 的細胞融合，并通過脂肪酸分析證明了融合子不同于兩種親本藻株。小球藻Chlorella vulgaris 和雨生紅球藻同屬綠藻門，親緣關系較近，因此曾有研究者提出將雨生紅球藻同小球藻進行原生質(zhì)體的融合，希望能獲得快速生長和抗逆性強的雜交品種[28]。但該研究雖然獲得了雜交的株系，但并未開展異養(yǎng)株的篩選工作，僅對雜交克隆的脂肪酸組成等雜交表型進行了分析。為提高雨生紅球藻糖異養(yǎng)生長能力，研究人員利用PEG 介導融合技術(shù)將雨生紅球藻與小球藻原生質(zhì)體進行融合。試驗中觀察到典型的融合現(xiàn)象，獲得了雨生紅球藻形態(tài)的融合子克隆，其生長速率比野生型雨生紅球藻顯著提高，但在后續(xù)傳代過程中表型分化現(xiàn)象時有出現(xiàn)，說明異源基因組間的重組效率不高[29]。雖然關于雨生紅球藻細胞融合的研究較少，但細胞融合可以突破有性雜交過程中的隔離機制，拓寬育種領域，為遠源物種間遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑，應用前景廣闊。

3 總結(jié)與展望

雨生紅球藻的育種研究進展較為緩慢，早期大多采用傳統(tǒng)的選擇育種和誘變育種方法，育種時間長，工作量大。隨著細胞生物學和分子生物學的不斷發(fā)展，細胞融合和基因工程等新的育種技術(shù)不斷應用于雨生紅球藻的育種工作中，為培育穩(wěn)定遺傳的良種藻株提供了快速高效的途徑。將傳統(tǒng)的育種技術(shù)與現(xiàn)代育種技術(shù)相結(jié)合，取長補短，是未來微藻良種培育的關鍵。將原生質(zhì)體融合技術(shù)同基因組誘變技術(shù)相結(jié)合，建立更高效的藻種間基因組雜交篩選技術(shù)，為雨生紅球藻藻種改良建立更穩(wěn)定的改造體系與平臺。