張葉，李嫻靜，楊勇

(1.中國藥科大學新藥安全評價研究中心，江蘇 南京 211198；2.中國藥科大學基礎醫(yī)學與臨床藥學學院，江蘇 南京 211198)

對鈉鉀三磷酸腺苷酶(Na+/K+-ATPase)的研究始于1957年，Skou 教授發(fā)現(xiàn) Na+/K+-ATPase是調節(jié)離子進出細胞的一種方式，且該酶需要在鈉離子和鉀離子存在下發(fā)揮活性[1]?；谶@一發(fā)現(xiàn)，Skou 教授榮獲了1997年的諾貝爾化學獎。作為一種重要的離子泵，Na+/K+-ATPase最重要的作用就是介導跨膜活性離子的轉運[2]。作為 P 型 ATPase家族(也被稱為E1-E2 ATPase)的一員，Na+/K+-ATPase能利用 ATP 水解產(chǎn)生的磷酸基團進行 α 基團上天冬氨酸殘基的磷酸化和去磷酸化反應，從而將特定離子轉運進出細胞[3]。P型 ATPase按照保守序列可分為5個亞家族(PI～V)，其中PII ATP 酶亞家族包括Na+/K+-ATPase，肌漿網(wǎng) Ca2+泵，胃內H+/K+-ATPase[4]。其中 Na+/K+-ATPase和H+/K+-ATPase是唯一以逆向轉運方式起作用的P型ATPase。Na+/K+-ATPase作為主要的膜整合蛋白之一，能同時將3個 Na+泵出細胞并將兩個 K+泵入細胞，維持細胞膜內外的鈉鉀離子濃度差，可調節(jié)跨膜電化學梯度，促進膜靜息電位的形成，對質膜上其他反應的發(fā)生至關重要[5]。

除了廣為人知的離子泵的作用外，Na+/K+-ATPase與其他膜蛋白及胞質蛋白的動態(tài)相互作用的報道越來越多，這種相互作用在細胞生物活動中至少發(fā)揮兩種重要作用：①早期研究重點關注的 Na+/K+-ATPase對胞內外離子濃度動態(tài)調節(jié)，包括 Na+、K+、Ca2+；②通過與信號蛋白的直接相互作用，在細胞信號轉導中發(fā)揮重要作用，或作為信號整合劑將特定膜組織區(qū)域內的影響因子和效應器僑聯(lián)在一起。過去二十年的研究表明，Na+/K+-ATPase的信號轉導功能的改變參與了許多臨床疾病如肥胖、高血壓、腫瘤等的進展[6]。 Na+/K+-ATPase還被證明作為治療尿毒癥心肌病和組織纖維化的治療靶標[7-8]。最近研究發(fā)現(xiàn)，Na+/K+-ATPase在腫瘤中異常表達，且能通過調節(jié)各種與細胞存活和死亡相關途徑在腫瘤的發(fā)生，增殖和轉移中發(fā)揮作用[9-13]。強心苷是動植物來源的天然化合物，如洋地黃毒苷、地高辛、毒毛旋花子苷K。強心苷類藥物作為 Na+/K+-ATPase的天然抑制劑能抑制 Na+/K+-ATPase的活性。該類藥物臨床一直用于心力衰竭和心律不齊等心血管類疾病的治療。但最近研究發(fā)現(xiàn)，強心苷通過抑制 Na+/K+-ATPase活性和其他機制發(fā)揮抗腫瘤活性，本文對 Na+/K+-ATPase的抗腫瘤作用的研究進展，Na+/K+-ATPase抑制劑(強心苷類藥物等)作為腫瘤潛在治療策略進行了報道。

1 Na+/K+-ATPase的結構和功能特征

Na+/K+-ATPase是由α和β亞基以及屬于FXYD(苯丙氨酸-X-酪氨酸-天冬氨酸,簡寫F-X-Y-D)蛋白家族的調節(jié)亞基組成的異源寡聚體。通過分解 ATP 獲得能量，進行 Na+、K+逆濃度梯度的主動轉運，即能把Na+從細胞內轉運到細胞外，把K+從細胞外轉運入細胞內，維持細胞膜內外的K+、Na+濃度差以及細胞內外液的滲透壓穩(wěn)定。

α 亞基作為催化亞基由10個跨膜螺旋(M1～M10)組成，這些螺旋上有 Na+和 K+和其他配體的結合位點，包括3個胞質結構域：催化功能域 (A)，核苷酸結合域 (N) 和參與 ATP 水解磷酸化結構域 (P)[14-16]。其中 ATP 分子能與 α 亞基的 N 結構域結合，ATP 發(fā)生水解產(chǎn)生的磷酸基團能與 P 結構上的天冬氨酸殘基結合[17]。在人類中，Na+/K+-ATPase的 α 亞基有四種不同的亞型：α1、α2、α3 和 α4，分別由α1多肽 (ATP1A1)、α2 多肽(ATP1A2)、α3多肽(ATP1A3)和α4多肽(ATP1A4)的4種不同的基因編碼而成[18]。ATP1A1 幾乎在所有細胞中均等表達，而 ATP1A2 主要在骨骼、心臟、平滑肌、腦(主要在星形膠質細胞)、肺和脂肪組織中表達。ATP1A3 主要在神經(jīng)元和心臟中表達。ATP1A4 僅在精子細胞中檢測到，對于精子的活動性和男性生育能力至關重要[19]。

β 亞基是一種小型糖蛋白，最初被認為作為分子伴侶發(fā)揮作用。Na+/K+-ATPase的 β 亞基不參與任何催化反應，它能與 α 亞基的 M7 和 M10 螺旋相互作用，調節(jié)α亞基中的離子運輸。β 亞基還可以幫助維持上皮細胞的極化和細胞的運動。抑制 β 亞基功能會導致促進細胞運動的緊密連接喪失，最終導致癌癥轉移[16]。β 亞基包含3種不同的亞型，分別由β1多肽 (ATP1B1)、β2多肽(ATP1B2)和 β3多肽(ATP1B3)編碼得到。ATP1B1 存在于大多數(shù)組織中，與α 亞基一起形成組織內最廣泛表達的 Na+/K+-ATPase亞型-α1β1復合體。β2存在于神經(jīng)元，松果體，骨骼肌中，介導神經(jīng)元與神經(jīng)膠質細胞的相互作用，促進神經(jīng)突觸生長。β3 在睪丸，肝臟，肺臟，腎臟中表達[20]。

γ亞基又被稱為FXYD2，是由66～68個氨基酸組成的小分子多肽。FXYD2 是 FXYD 蛋白家族一員，該家族蛋白被證明可以調節(jié)催化亞基的活性。其中 FXYD2 被證明與離子通道的開放有關[21]。此外，還有文獻報道 FXYD2 能調節(jié) α 亞基配體的親和力[22]。盡管 FXYD2 具有某些調節(jié)作用，但已發(fā)現(xiàn) Na+/K+-ATPase在沒有γ亞基存在下也能正常工作[17]。

如上文所說，Na+/K+-ATPase除了進行 Na+、K+的運輸，參與和維持細胞膜內外的電化學梯度外，還能與鄰近的膜蛋白相互作用形成信號復合體，進行細胞內的級聯(lián)信號反應，傳遞信息。其中NKA/Src/ROS信號通路的激活導致氧化應激失衡，加劇腫瘤、動脈粥樣硬化、糖尿病、慢性腎病等疾病發(fā)展[23-25]。此外越來越多的證據(jù)表明作為一種多功能蛋白，Na+/K+-ATPase在細胞黏附復合物形成和維持中發(fā)揮的關鍵作用。 Na+/K+-ATPase能與許多信號分子和肌動蛋白細胞骨架結合，形成多蛋白復合物，促進細胞間緊密連接和獨立連接的形成[26]。有學者解釋稱在細胞膜上存在兩種 Na+/K+-ATPase：一種是作為能量轉換離子泵的經(jīng)典酶池，另一種是局限于小窩的發(fā)揮信號傳導功能的酶池[27]。在不同的細胞和組織中，這種信號體的組成以及結合的蛋白質可能是不同的，這就導致該信號體在不同組織中尤其是在正常和病理狀態(tài)下，如癌癥中發(fā)揮不同功能。

2 Na+/K+-ATPase作為腫瘤治療的潛在靶點

與相應正常組織相比，在人類癌癥中 Na+/K+-ATPase各亞型表達水平發(fā)生改變[26]，許多有關 Na+/K+-ATPase促癌作用的報道已證明與 Na+/K+-ATPase的 α 和 β 亞基的差異表達相關，但與 γ 亞基沒有關系。如α1亞基在包括非小細胞肺癌[28]、腎細胞癌[29]、膠質細胞瘤[30]和黑色素瘤[31]中表達上調，而 α3 亞基在結腸癌中表達上調[32]。相反的是，α1 亞基據(jù)報道在前列腺癌中表達下調[33]，因此，Na+/K+-ATPase的α亞基代表了一些與不良預后相關的癌癥類型的潛在新靶點。人 A549 非小細胞肺癌細胞中α1亞基的特異性敲除顯著降低了它們的遷移和增殖，進一步表明α1亞基作為這種腫瘤的治療靶標的潛在用途[28]。此外，β 亞基不僅在 Na+/K+-ATPase本身的調控中發(fā)揮重要作用，而且在抑制癌癥轉移和腫瘤發(fā)生的抗腫瘤作用中扮演重要角色，這一點現(xiàn)在被越來越多的人所了解。β 亞基的表達量在腫瘤中也發(fā)生了變化，已經(jīng)有許多報道證實 Na+/K+-ATPase的β1 亞基在人上皮癌細胞中表達下調。Espineda等[34]指出，當腫瘤細胞下調β1 表達時，會顯著減少鈣粘蛋白表達，這促使腫瘤細胞彼此相互分離，有利于它們的遷移和轉移。因此，β1 亞基的下調似乎是許多上皮癌細胞變得獨立侵襲的必要條件。此外，有研究報道 β 亞基的表觀遺傳調控，即 ATP1B1 甲基化下調 β 亞基的表達能促進腎癌細胞的生長，強心苷類藥物由于能抑制 Na+/K+-ATPase活性而被證明對癌細胞具有抗增殖作用。

除了已發(fā)表文章外，也有許多專利強調了 Na+/K+-ATPase作為未來抗腫瘤靶點的可能性，Rajasekaran報告發(fā)現(xiàn)，膀胱癌早期階段 Na+/K+-ATPase蛋白的總體表達水平較低，隨著腫瘤的進展，表達水平會增加。α 亞基高表達和 β 亞基低表達的患者有早期復發(fā)的高風險；而具有低表達 α 亞基和高表達 β 亞基的患者具有較長的無復發(fā)時間，這表明 Na+/K+-ATPase的 α 和 β 亞基表達水平是膀胱癌患者復發(fā)時間的有效預測因子[35]。類似的，研究人員報道，在腎透明細胞癌中β亞基表達降低可能與腎透明細胞癌的侵襲性有關[36]。相比之下，Venta Na Medical Systems發(fā)現(xiàn)宮頸組織中 Na+/K+-ATPase β1 亞基表達的增加與宮頸從低度到高度發(fā)育不良直到宮頸癌的發(fā)病進展相關，可作為宮頸癌發(fā)病的生物標志物[37]?？傊?，Na+/K+-ATPase的表達在大多數(shù)癌組織中發(fā)生改變似乎是非常明顯的，因此可以作為一種有用的新的生物標志物和治療靶點。

3 Na+/K+-ATPase對腫瘤的促進作用

由于存在結構上的突變以及酶活性的波動，Na+/K+-ATPase參與一些疾病如糖尿病，阿爾茨海默病的發(fā)病機制[17]，最近，逐漸有報道發(fā)現(xiàn) Na+/K+-ATPase也參與促進腫瘤生長的部分機制，影響包括上皮間質細胞轉化 (EMT)、絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 級聯(lián)過程、磷酸肌醇3激酶 (PI3K) /蛋白激酶B (Akt) /哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 (mTOR) 信號通路、膽固醇穩(wěn)態(tài)等細胞過程和途徑。

上皮間質轉化是腫瘤發(fā)展和侵襲的關鍵過程，Na+/K+-ATPase的 β 亞基已被證明有助于調節(jié)特定細胞上皮極化的完整性，相鄰的 β 亞基之間形成二聚體，通過 β - β 橋增強細胞間的黏附。當β亞基的表達增高時，鈣黏蛋白(E-cadherin)的活性降低，從而導致 EMT 和癌癥的侵襲和轉移[38]。

MAPK 家族與細胞周期，增殖凋亡相關，研究發(fā)現(xiàn)，強心苷類藥物 G 毒毛旋花苷能通過抑制 v-src 禽肉瘤 Na+/K+-ATPase活性活化 p38 MAPK，從而上調 p53 等轉錄因子的表達[39]，此外，MAPK 信號通路的激活還能促進核因子-κB(NF-κB)表達，從而激發(fā) Fas 介導的細胞凋亡[40]。

PI3K/Akt/mTOR通路參與調節(jié)細胞增殖，凋亡和自噬，Barwe等[41]發(fā)現(xiàn)PI3K的激活與Na+/K+-ATPase的α亞基的表達增加有關，即調節(jié)亞基 p85 結合到 α 亞基上富脯氨酸結構域從而促進PI3K活性上調，從而調節(jié)細胞自噬，促進腫瘤細胞存活。

膽固醇也能與催化亞基 - α 亞基結合，兩者的相互作用已被證明可以調節(jié)膽固醇的運輸、合成和代謝。α亞基能與小窩蛋白-1的 N 端結構域相互作用從而調節(jié)細胞膜上小窩蛋白-1和膽固醇的含量，鈉鉀泵表達降低破壞了對質膜上膽固醇運輸和合成的調節(jié)，Na+/K+-ATPase作為膽固醇代謝調節(jié)劑的作用可能是腫瘤生長如乳腺癌的關鍵因素[42-43]。

此外，也有文獻報道抑制 Na+/K+-ATPase后影響細胞鈣穩(wěn)態(tài)，從而誘導腫瘤細胞的程序性死亡[44]。在耐藥的膠質母細胞瘤細胞中，當 G 毒毛旋花苷上調 ATP1A2 和 ATP1A3 表達時，可使腫瘤細胞對化療藥物敏感，并誘導細胞壞死[45]。

4 Na+/K+-ATPase抑制劑作為新型抗腫瘤藥物的臨床前研究

4.1 強心苷類藥物結構特征 強心苷類化合物包括強心甾和蟾蜍二烯內酯，是一類17位有內酯結構的甾體核結構。由于甾核骨架和17位內酯結構上取代基以及空間立體結構具有多樣性，強心苷類藥物具有多種類型[46]，其中最廣為人知的有地高辛，洋地黃毒苷，G 毒毛旋花苷，夾竹桃苷等。自從1785年Sir William Withering出版《關于毛地黃的記述》開始，臨床醫(yī)生就使用洋地黃制劑來治療水腫、心律不齊和慢性心力衰竭。強心苷類藥物，尤其是洋地黃現(xiàn)在仍廣泛用于治療充血性心力衰竭和心律失常的正性肌力藥物[47]。目前人們普遍認為強心苷類藥物介導的效應主要是由該類藥物與 Na+/K+-ATPase相互作用并抑制 Na+/K+-ATPase活性產(chǎn)生的[48]。

4.2 強心苷類藥物的抗腫瘤作用 近些年有關強心苷類藥物抗腫瘤作用的報道顯著增加，除了對腫瘤細胞有效的抗增殖作用之外，令人感興趣的是它們在對正常細胞和腫瘤細胞表現(xiàn)出不同的作用。對于正常細胞，強心苷類藥物是沒有活性的，甚至表現(xiàn)出促增殖作用，但卻能選擇性誘導腫瘤細胞凋亡[26]。Jiang等[49]發(fā)現(xiàn)強心苷蟾毒靈能通過抑制p38 MAPK信號通路在非小細胞肺癌細胞中展示出抗增殖活性。原海蔥苷A是另一種強心苷，已被證明可以抑制膠質母細胞瘤增殖和誘導其凋亡，同時提高小鼠的存活率[50]。強心苷還能通過不同機制對乳腺癌的生長具有抑制作用，Kometiani等[51]發(fā)現(xiàn)G 毒毛旋花苷通過抑制 Na+/K+-ATPase介導的表皮生長因子受體(Src/EGFR)和 p42/44絲裂原活化蛋白激酶的激活，調節(jié) p21 Cip 介導的通路，導致雌激素受體陰性的人乳腺癌細胞系MDA-MB-435的細胞周期阻滯，抑制細胞生長。

4.3 新型 Na+/K+-ATPase抑制劑的研究進展 除了大量關于新的潛在抗腫瘤強心苷的分離和鑒定的科學文獻外，在強心苷結構基礎上，設計優(yōu)化新的 Na+/K+-ATPase抑制劑和配體作為潛在抗腫瘤藥物的報道也顯著增加。在分析了 Na+/K+-ATPase的結合口袋和具代表性的強心苷藥物的結構特點后，有文獻確定了導致抗腫瘤活性的關鍵 Na+/K+-ATPase抑制劑結構特征：需有10位的醛基(-COH)；14位的-羥基(氫鍵供體基團)，環(huán)C和環(huán)D的順式構型；和位于17位的強心甾或蟾蜍二烯內酯基團，這些是 Na+/K+-ATPase抑制劑對腫瘤生長具有高抑制作用所必需的[26，52]。如Lefranc等[53]發(fā)現(xiàn) UNBS1450(一種新型的強心苷類藥物)能顯著降低膠質瘤細胞內ATP濃度，擾亂肌動蛋白細胞骨架，導致膠質瘤細胞自噬死亡。PBI-05204作為一種夾竹桃苷的結構改造物，在與吉西他濱聯(lián)合治療后，不僅降低了夾竹桃苷的細胞毒性作用，還提高了吉西他濱的抗腫瘤活性[54]。

5 討論與展望

Na+/K+-ATPase作為一種遍布全身的重要酶類，當結構功能發(fā)生改變時，會引起腫瘤等疾病。 Na+/K+-ATPase最初被定義為細胞滲透壓調節(jié)器，但越來越多的研究證明它還能參與細胞內各種信號傳導途徑并調節(jié)它們的功能。近些年來逐漸有報道將其作為治療癌癥的潛在藥物靶點。盡管 Na+/K+-ATPase的整體表達被認為是癌癥復發(fā)潛在風險預測因子，但預測方式具體還是表現(xiàn)在不同亞基的表達水平。如高表達α亞基低表達β亞基被認為是腫瘤復發(fā)的高風險因素，低α表達水平高β表達水平的患者腫瘤復發(fā)風險低。α亞基作為信號傳導元件，能調控影響腫瘤細胞生存和生長多種通路，越來越受到人們的關注。但有關β亞基在腫瘤調控中發(fā)揮的作用的研究較少，β 亞基在抑制腫瘤細胞黏附和腫瘤發(fā)展中的作用也尚未清楚，未來對β亞基與腫瘤的關系的研究可能會揭示其與不同腫瘤的相關性，進一步揭示 Na+/K+-ATPase在腫瘤進展中發(fā)揮的整體作用。

盡管作為天然存在的 Na+/K+-ATPase的抑制劑，強心苷類藥物已經(jīng)被用于治療心功能不全很長一段時間了，但是它們在腫瘤治療中的作用也是不可忽視的。了解強心苷在癌癥發(fā)展和生長過程中的作用可以幫助我們進一步了解如何治療癌癥。最新研究認為強心苷類藥物通過改變細胞內外的離子濃度來抑制 Na+/K+-ATPase的功能，也許只是其眾多抑制腫瘤生長的機制之一。研究發(fā)現(xiàn)，強心苷可通過內源性和外源性途徑以及自噬途徑觸發(fā)癌細胞凋亡，可作為另一種抗腫瘤機制。有關強心苷類藥物的抗腫瘤活性機制還需進一步研究。迄今為止，關于使用強心苷作為抗癌藥物的所有公開臨床數(shù)據(jù)都限于實體瘤。這些臨床研究大多樣本量較小，并且沒有隨機對照，因此，數(shù)據(jù)需進一步證實。系統(tǒng)藥理學的方法能在分子和細胞水平上更好地理解強心苷如何殺死腫瘤細胞，這可能有助于確定強心苷干預的主要靶點和信號通路。