陳 曉，盧英紅，何才通

（玉林市婦幼保健院優(yōu)生遺傳科，廣西 玉林 537000）

出生缺陷也被稱為先天異常，其包括形態(tài)結(jié)構(gòu)異常、生理功能異常及代謝缺陷等，我國的出生缺陷發(fā)生率約為5.6%，每年新增出生缺陷兒約90萬例，出生缺陷已成為我國圍產(chǎn)兒、嬰幼兒死亡及兒童殘疾的主要原因之一[1]。染色體異常是導(dǎo)致新生兒出生缺陷的主要原因，其包括染色體數(shù)目異常、染色體大片段缺失/重復(fù)、致病性基因組拷貝數(shù)變異等[2]。產(chǎn)前診斷中有臨床意義的染色體異常主要為性染色體非整倍體異常與21-、13-、18- 三體異常。出生缺陷導(dǎo)致患者家庭陷入沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力，也給社會(huì)帶來了巨大的難題。遺傳因素導(dǎo)致的出生缺陷目前尚無有效的治療手段，只能通過產(chǎn)前篩查和診斷預(yù)防患兒的出生缺陷。無創(chuàng)產(chǎn)前檢測技術(shù)（NIPT）是針對孕婦外周血中母體與胎兒游離DNA片段，利用下一代高通量測序技術(shù)與生物信息分析技術(shù)，分析胎兒是否發(fā)生染色體非整倍體變異的一項(xiàng)產(chǎn)前篩查技術(shù)，該技術(shù)開創(chuàng)了產(chǎn)前篩查的新時(shí)代，并迅速得到全球的普遍認(rèn)可，對降低出生缺陷率，減少不必要的有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷率具有重要意義[3]。本文主要探討無創(chuàng)產(chǎn)前檢測的臨床應(yīng)用研究進(jìn)展，現(xiàn)綜述如下。

1 NIPT的發(fā)展概況

在NIPT技術(shù)投入臨床應(yīng)用前，傳統(tǒng)的血清學(xué)生化篩查一直是臨床用來進(jìn)行唐氏篩查的主要手段之一。血清學(xué)產(chǎn)前篩查檢測方法簡單，檢測成本較低，且得到國家與政府的補(bǔ)助，是目前我國普及率最廣的一種產(chǎn)前篩查技術(shù)。篩查陽性者需要進(jìn)行絨毛、羊水、臍帶血穿刺等侵入性產(chǎn)前診斷，雖可進(jìn)行染色體分析，但會(huì)對篩查者的機(jī)體造成一定的損害，有一定的風(fēng)險(xiǎn)性，應(yīng)用較為局限。而傳統(tǒng)的血清學(xué)篩查技術(shù)的假陽性率較高，會(huì)造成很多不必要的侵入性產(chǎn)前診斷，增加了侵入性產(chǎn)檢的風(fēng)險(xiǎn)，如流產(chǎn)、宮內(nèi)感染等；再者，因個(gè)體的不同其檢出率也不甚理想，導(dǎo)致大量出生缺陷患兒漏檢。胎兒細(xì)胞凋亡后殘留的DNA進(jìn)入母體循環(huán)被稱為胎兒DNA，其進(jìn)入母體循環(huán)后可被檢測，并在產(chǎn)后第二周完全降解。NIPT技術(shù)通過大規(guī)模的平行測序，對循環(huán)在母體外周血內(nèi)的胎兒游離DNA進(jìn)行檢測，開創(chuàng)了產(chǎn)前篩查的新時(shí)代，該技術(shù)的應(yīng)用可以減少孕婦因等待結(jié)果而產(chǎn)生的焦慮，原因在于它在懷孕12周起即可檢測，其通過檢測孕婦外周血內(nèi)胎兒游離DNA來對胎兒的染色體進(jìn)行分析，該檢測方式對母體與胎兒都具有安全性、可靠性，在減少孕婦生理和心理上的負(fù)擔(dān)上具有很大的優(yōu)勢，且其尤其適用于高齡孕婦，這類人群更傾向于進(jìn)行染色體非整倍性風(fēng)險(xiǎn)的產(chǎn)前檢測。

2 NIPT在目標(biāo)疾病上的應(yīng)用

NIPT的目標(biāo)疾病為21- 三體、18- 三體、13- 三體綜合征。施丹華等[4]選取10 503例孕婦進(jìn)行NIPT檢測，對大量數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，NIPT檢測對21- 三體、18- 三體、13- 三體的靈敏度均達(dá)到了100.00%，特異度也都達(dá)到了99.98%，陽性預(yù)測值分別為90.91%，80.00%，33.33%，其研究結(jié)果表明，NIPT檢測在對21- 三體、18- 三體、13- 三體的檢測中具有較高的準(zhǔn)確性。值得注意的是，相對于13- 三體，NIPT在檢測21- 三體和18- 三體上具有更大的優(yōu)勢。廣東省婦幼回顧性分析2014年至2016年孕婦NIPT檢測的相關(guān)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)NIPT對于21- 三體、18- 三體、13- 三體染色體非整倍體的檢測敏感度均達(dá)100%，特異度分別為99.7%、100%、99.7%，陽性預(yù)測值分別為68%、100%、66.67%，陰性預(yù)測值均達(dá)100%[5]。周穎等[6]對9 470例產(chǎn)篩高風(fēng)險(xiǎn)或高齡妊娠孕婦的NIPT結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明NIPT對目標(biāo)疾病的敏感性達(dá)100%，特異性達(dá)98.79%，21- 三體、18- 三體、13- 三體的陽性預(yù)測值分別為98%、81.81%、58.82%。

目前，NIPT在單胎妊娠中的應(yīng)用研究較多且較成熟，但在雙胎妊娠上的可行性和臨床應(yīng)用仍相對較少，雙胎NIPT檢測存在局限性，該檢測方式不能檢測所有染色體。王佳燕等[7]選取同意行NIPT檢測的雙胎孕婦215例，其研究結(jié)果表明雙胎21- 三體、18- 三體、13- 三體的靈敏度為97.3%、90.9%、100%，假陽性率為0。目前研究顯示，NIPT對單絨雙胎的非整倍體篩查準(zhǔn)確性較高，而在雙絨毛膜性雙胎妊娠中，每個(gè)胎兒向母體循環(huán)產(chǎn)生的DNA量是不同的，若其中異常胎兒DNA片段低于NIPT的檢測下限4%，或正常胎兒的片段較多時(shí)，會(huì)增加檢測的假陰性，因而目前主張以胎兒DNA濃度比例較低的一胎用于風(fēng)險(xiǎn)計(jì)算[8]。有研究表明，當(dāng)在無超聲異常的情況下，NIPT在雙胎妊娠對21- 三體的檢出率與單胎妊娠相當(dāng)，敏感性達(dá)100%，特異性在99%以上[9]。此外，有研究認(rèn)為，NIPT在通過體外受精 -?胚胎移植方式（IVF）助孕的染色體非整倍體產(chǎn)前篩查中也具有較好的應(yīng)用價(jià)值[10]。經(jīng)過多年的臨床應(yīng)用，NIPT在常見的胎兒染色體非整倍體檢測上的價(jià)值得到了廣泛的認(rèn)可，且在該領(lǐng)域已發(fā)展成熟，甚至在未來有望取代目前的血清學(xué)產(chǎn)前篩查技術(shù)。

3 NIPT次要結(jié)果的篩查作用

除21- 三體、18- 三體、13- 三體外，NIPT對其他染色體非整倍體和基因組拷貝數(shù)變異也有一定的檢出效果。另一項(xiàng)研究中，6 972例NIPT標(biāo)本中，性染色體非整倍體異常檢出率為0.29%，假陽性為58%，其中XO、XXY、XXX、 XYY的假陽性率分別為70%、0、50%、50%[11]?？卢|琳等[12]的研究結(jié)果中，14 235份NIPT樣本中檢出24例基因組拷貝數(shù)變異（CNV），其中17例行染色體微陣列分析驗(yàn)證，陽性符合率為86.7%，包括5號染色體及8號染色體微缺失、2號、9號、13號染色體微小重復(fù)等。黎冬梅等[13]選取10 005例孕婦行NIPT檢測，其研究結(jié)果提示CNV有32例，其中25例行介入性產(chǎn)前診斷，確診14例，包括微缺失9例、微重復(fù)5例，片段大小在587.75～36.05 kb之間，陽性預(yù)測值為56%。在鄭文吉等[14]研究結(jié)果中顯示，NIPT提示為20號染色體微缺失，采用單核苷酸多態(tài)性基因芯片（SNP Array）進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果為 arr[hgl9]5ql2.1（60 239 397～60 434 977）×1，缺失約195.5 kb，NIPT可以檢測出部分微缺失/微重復(fù)，對于檢測出部分微缺失/微重復(fù)的孕婦需進(jìn)行進(jìn)一步的基因芯片檢測進(jìn)行確診。胡芷洋等[15]研究中，1 191例NIPT標(biāo)本中提示9例為微缺失微重復(fù)綜合征，其中3例得到確診，包括1例18q21.31～23.23處23 Mb缺失、1例18q22.3～23處8.6 Mb缺失及1例9q24.3～13.2處36 Mb缺失，利用NIPT篩查微缺失微重復(fù)綜合征是可行的，但是如何選擇檢測對象還需討論，對NIPT報(bào)告中的微缺失微重復(fù)綜合征陽性病例，必須做進(jìn)一步檢查確診。NIPT除了目標(biāo)疾病，即21- 三體、18- 三體、13- 三體外，對于其他染色體非整倍體甚至基因組的拷貝數(shù)變異也有較高的檢出率，有利于提高異常染色體的檢出率，對于預(yù)防出生缺陷具有重要的意義。

4 NIPT的假陽性與假陰性

雖然NIPT技術(shù)在產(chǎn)前篩查應(yīng)用上已逐步走向成熟，且與傳統(tǒng)的血清學(xué)產(chǎn)前篩查相比具有更高的準(zhǔn)確性和敏感性，NIPT技術(shù)陽性預(yù)測值與陰性預(yù)測值均高于血清學(xué)產(chǎn)前篩查，然而，NIPT技術(shù)作為一種篩查手段，被批準(zhǔn)容許存在一定概率的假陽性和假陰性[16]。雖然科技的限制可以解釋部分錯(cuò)誤，但假陰性與假陽性結(jié)果都有其生物學(xué)基礎(chǔ)。事實(shí)上，孕婦血漿中的胎兒游離DNA來自絨膜絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層，而這些滋養(yǎng)層細(xì)胞的核型可能與胎兒細(xì)胞核型是不一致的，所以存在NIPT的篩查結(jié)果與胎兒細(xì)胞核型分析結(jié)果不一致的可能。一項(xiàng)回顧性分析研究中，約1 ∶ 426（14/5 967）的 13- 三體、18- 三體、21- 三體畸變風(fēng)險(xiǎn)的胎兒在做NIPT的時(shí)候有潛在的漏診風(fēng)險(xiǎn)，原因是它們的絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層并沒有染色體非整倍體畸變[17]。文萍等[18]對2例NIPT假陰性病例進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)病例1的胎兒染色體核型分析結(jié)果為易位型21-三體，高通量測序在胎盤和胎兒邊緣檢測到Chr13：（33 840 001～115 100 000）×3[ 60 ]/46，XY[ 40 ]，胎盤母體面的邊緣檢測 為 Chr13 ∶（340 080 001～115 100 000）×3[ 54 ]/46，XY[ 46 ]，臍帶組織為21- 三體，但胎兒面及母體面中心和近中心均未檢測到明顯的異常；病例2中胎兒18號染色體的高通量測序結(jié)果為18號染色體存在15.1 Mb的雜合缺失，提示患18號染色體部分單體綜合征?？梢姡軝z測原理的局限性，如限制性胎盤嵌合等，NIPT具有一定的假陽性與假陰性率，此外，孕婦孕期合并腫瘤、母體染色體異常、胎兒及胎盤染色體不一致等均可能影響NIPT的檢測結(jié)果。NIPT具有很高的靈敏度和特異度，但仍會(huì)存在低概率的假陽性和假陰性，當(dāng)孕婦在接受孕前篩查時(shí)，除重視NIPT技術(shù)帶來的便利外，還應(yīng)重視超聲學(xué)檢查等常規(guī)臨床檢查，進(jìn)一步降低孕前篩查過程中產(chǎn)生的假陽性與假陰性。

5 NIPT檢測失敗的原因

NIPT檢測失敗的標(biāo)準(zhǔn)主要包括：總游離DNA含量＞ 0.7、經(jīng)測序提示胎兒游離DNA比例＜ 4%等。一項(xiàng)31 832例NIPT結(jié)果回顧性分析研究中，199例出現(xiàn)首次檢測失敗，再次采血后，其中171例（85.9%）獲得了有效的結(jié)果，另外28例（14.1%）仍檢測失敗，即研究中NIPT檢測的最終失敗率為0.09%，28例最終檢測失敗的孕婦中，由于游離DNA含量過高的占39.2%，經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)胎兒游離DNA含量＜ 4%的占60.7%，對該28名NIPT最終檢測失敗的孕婦進(jìn)行隨訪，46.4%在中晚期孕期發(fā)生不良妊娠并發(fā)癥，32.1%因嚴(yán)重的母體疾病或胎兒畸形而引產(chǎn)，母體妊娠并發(fā)癥、其他臟器疾病、胎兒畸形等原因可能導(dǎo)致再次采血NIPT檢測仍然失敗[19]。盧婉等[20]對高齡且自愿進(jìn)行NIPT檢測的23 704例孕婦進(jìn)行回顧性分析，其研究結(jié)果顯示，NIPT檢測的最終失敗率為0.14%，并對檢測失敗的孕婦進(jìn)行隨訪，其中胎兒濃度低和Z值處于“灰區(qū)”是造成NIPT檢測失敗的主要原因，此外，孕周、孕婦體質(zhì)量指數(shù)、實(shí)驗(yàn)室操作、母體自身染色體核型、肝素用藥史等也可能引起NIPT檢測失敗。目前認(rèn)為，首次NIPT檢測失敗的孕婦，可以選擇再次抽血，而再次采血仍檢測失敗的孕婦，則應(yīng)考慮侵入性產(chǎn)前診斷。

6 小結(jié)與展望

與傳統(tǒng)的血清學(xué)產(chǎn)前篩查技術(shù)相比，NIPT具有更高的準(zhǔn)確性和敏感度，在一定程度上降低了不必要的侵入性產(chǎn)前診斷帶來的流產(chǎn)、宮內(nèi)感染等風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)生概率。NIPT對降低新生兒出生缺陷發(fā)生概率，提高出生人口質(zhì)量具有重要意義。然而，受檢測原理的限制，NIPT在應(yīng)用中難免會(huì)出現(xiàn)假陽性和假陰性的情況，假陰性對于妊娠結(jié)局的影響是非常嚴(yán)重的。此外，NIPT的檢測結(jié)果受到多種因素影響，如母體妊娠并發(fā)癥、其他臟器疾病、胎兒畸形等?；贜IPT具有出現(xiàn)假陽性、假陰性及檢測失敗等情況的可能，臨床醫(yī)生要把握好選擇NIPT檢測的孕婦的臨床指征，避免將該技術(shù)濫用于不適用的人群。另外，實(shí)驗(yàn)室要規(guī)范操作，同時(shí)嚴(yán)格監(jiān)控胎兒游離DNA濃度百分比，對于低于4%的胎兒含量應(yīng)建議進(jìn)行侵入性產(chǎn)前診斷。最后，臨床醫(yī)生應(yīng)該充分告知本項(xiàng)目的局限性，提醒孕婦即使NIPT結(jié)果是低風(fēng)險(xiǎn)，也必須完成后續(xù)的孕檢內(nèi)容，特別是系統(tǒng)B超檢查。總之，在臨床醫(yī)師與研究學(xué)者的不斷努力下，NIPT的檢測范圍不斷擴(kuò)展，準(zhǔn)確性也不斷提高，這些進(jìn)步將推進(jìn)NIPT在更多領(lǐng)域上的應(yīng)用，在預(yù)防出生缺陷，提高人口質(zhì)量上發(fā)揮更大的潛力。