査中萍，鄭興飛，周黎，王紅波，殷得所，胡建林，董華林，游艾青，徐得澤

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所/糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064）

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，世界上有超過(guò)50%的人口以稻米作為主要食物來(lái)源。長(zhǎng)期的人工選擇造成栽培稻品種育種資源過(guò)于狹窄，水稻育種出現(xiàn)了產(chǎn)量、抗性、品質(zhì)難以進(jìn)一步突破的“卡脖子”難題。打破這種局面的最好辦法就是增加品種的遺傳多樣性。野生稻作為常規(guī)栽培稻的原始祖先，在其漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中，為了適應(yīng)不同的地理區(qū)域和復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境，逐步形成了抗病、抗蟲、抗逆等多種優(yōu)良特性［1-8］，其中長(zhǎng)雄蕊野生稻是現(xiàn)在栽培稻的野生近緣種，保存了許多常規(guī)栽培稻中沒(méi)有的或者已經(jīng)消失的優(yōu)良基因［9-13］。因此，長(zhǎng)雄蕊野生稻可以作為一種優(yōu)異的種質(zhì)資源來(lái)改善當(dāng)今栽培稻品種遺傳基礎(chǔ)狹窄的局面。近年來(lái)，許多以稻米為主食的發(fā)展中國(guó)家人口越來(lái)越多，而耕地面積越來(lái)越少，于是科學(xué)家們逐漸把注意力轉(zhuǎn)向發(fā)掘和利用長(zhǎng)雄蕊野生稻的一些有利性狀，來(lái)拓寬栽培稻品種，從而改良現(xiàn)有的栽培品種，提高水稻的品質(zhì)和產(chǎn)量。但長(zhǎng)雄野生稻自交幾乎不結(jié)實(shí)，長(zhǎng)雄野生稻與栽培稻雜交時(shí)很難產(chǎn)生可育雜種，表現(xiàn)出很強(qiáng)的生殖隔離特點(diǎn)，因此提高長(zhǎng)雄野生稻與栽培稻雜交種的成苗率，有效獲得長(zhǎng)雄野生稻與栽培稻的雜交后代對(duì)于有效利用長(zhǎng)雄野生稻具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

長(zhǎng)雄野生稻W(wǎng)29、W32、W35為本課題組經(jīng)多年在湖北武漢和海南陵水兩地稻蔸繁殖留存。優(yōu)良栽培稻恢復(fù)系IP094、IP095、IP098，于2020年5月10日每間隔10 d分期播種，于8月10日至9月15日進(jìn)行長(zhǎng)雄野生稻與栽培稻雜交授粉。雜交后套袋，雜交袋標(biāo)注父本、母本名稱及授粉日期。

1.2 方法

1.2.1 幼胚消毒接種 栽培稻與長(zhǎng)雄野生稻授粉5～9 d后收取雜交后的種子，剝?nèi)シf殼，將去除穎殼的雜交種放在滅菌的50 mL三角瓶中，在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行雜交種消毒。首先用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇表面消毒雜交種，再用有效氯含量為1.5%～2.0%的次氯酸鈉溶液浸泡雜交種15 min，之后用無(wú)菌水清洗5次，每次2 min以上，最后將消毒后的雜交種置于裝有無(wú)菌紙的15 cm培養(yǎng)皿中備用。

1.2.2 胚拯救 消毒好的雜交種在超凈工作臺(tái)上，用鑷子挑取完整幼胚，置于裝有培養(yǎng)基的50 mL三角瓶?jī)?nèi)進(jìn)行幼胚離體培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度28℃、空氣相對(duì)濕度70%、光照度為1 000～1 500 lx的恒溫培養(yǎng)室內(nèi)，每天光照時(shí)間為14 h。幼胚離體培養(yǎng)基為1/2 MS+植物凝膠3 g/L+NAA 0.2 mg/L。

1.2.3 組培苗煉苗及移栽 胚拯救培養(yǎng)20 d后，待幼胚離體培養(yǎng)的組培苗三葉一心約8～10 cm時(shí)，將幼苗從培養(yǎng)基上取出并在流水下小心洗去附著在幼苗根系上的培養(yǎng)基，適當(dāng)剪去過(guò)長(zhǎng)的葉片及根系，再將幼苗放在盛有清水的50 mL三角瓶中于培養(yǎng)室內(nèi)煉苗培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為28℃、空氣相對(duì)濕度為70%、光照度為4 000～5 000 lx，每天光照14 h，5～7 d后，將幼苗移入育秧盤中，育秧盤放在溫室中，進(jìn)行常規(guī)水肥管理。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 幼胚離體培養(yǎng)2 d后胚芽及胚根陸續(xù)在培養(yǎng)基上發(fā)育生長(zhǎng)，1周后統(tǒng)計(jì)幼胚離體培養(yǎng)效率（幼胚離體培養(yǎng)效率=綠苗數(shù)/接種的幼胚數(shù)×100%）。移栽10 d后統(tǒng)計(jì)成活率（成活率=移栽成活苗數(shù)/移栽總苗數(shù)×100%）。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生稻與栽培稻雜交及雜交胚取材時(shí)間

以栽培稻為母本、野生稻為父本，剪穎雜交后雜交子粒都能發(fā)育，但野栽雜交子粒存在胚敗育現(xiàn)象，表現(xiàn)在雜交子粒與雙親正常子粒相比，部分雜交子粒胚乳充實(shí)度與雙親相似，部分雜交子粒胚乳充實(shí)度較差，另一部分雜交子粒胚完全退化，僅剩種皮，種皮內(nèi)沒(méi)有胚乳發(fā)育。雜交子粒隨著授粉時(shí)間推移，表現(xiàn)出子粒和胚都慢慢萎縮，因此取材時(shí)間為授粉后第7天較好。授粉后第1～6天胚發(fā)育太小，不便于挑取幼胚；授粉后第8～9天子粒和胚都萎縮，亦不便于挑取幼胚。

2.2 種間雜交苗的獲得

幼胚培養(yǎng)效果見圖1，由圖1可以看出，幼胚在離體培養(yǎng)基上培養(yǎng)第2天即可看到胚芽萌動(dòng)伸出培養(yǎng)基上，培養(yǎng)第3天胚芽約1～1.5 cm，同時(shí)胚根萌動(dòng)，培養(yǎng)第4天時(shí)胚芽達(dá)到3 cm，胚根1 cm。之后胚芽胚根幾乎同時(shí)生長(zhǎng)，達(dá)到一步成苗。9個(gè)組合共接種450個(gè)幼胚，共獲得發(fā)育良好健壯的綠苗438株，胚拯救率為97.3%。

圖1 胚拯救培養(yǎng)效果

2.3 組培苗煉苗及移栽

胚拯救20 d后待幼胚離體培養(yǎng)的組培苗三葉一心約8～10 cm時(shí)，按“1.2.3”進(jìn)行煉苗及移栽，移栽后常規(guī)水肥管理，注意加強(qiáng)管理，防止陽(yáng)光直射及暴風(fēng)雨，移栽10 d后統(tǒng)計(jì)成活率，共移栽438株，10 d后成活434株，成活率99.1%。

圖2 組培苗煉苗

3 討論

本研究在野生稻與常規(guī)稻雜交后第7～9天進(jìn)行雜交合子胚離體培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了授粉后盡早取胚，從而有效防止了栽培稻與長(zhǎng)雄野生稻遠(yuǎn)緣雜種胚早衰，能使大量遠(yuǎn)緣雜交胚在離體條件下培養(yǎng)從而繼續(xù)發(fā)育成正常幼苗。而且本研究幼胚離體培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單、易操作，培養(yǎng)周期短、效率高，幼胚離體培養(yǎng)成苗率高達(dá)96.4%（成苗率=幼胚離體培養(yǎng)效率×成活率），提高了長(zhǎng)雄野生稻與栽培稻遠(yuǎn)緣雜交成苗率。

本研究胚拯救獲得的F1代組培苗證明了遠(yuǎn)緣雜交的可行性，為野生稻優(yōu)良基因轉(zhuǎn)育到栽培稻中創(chuàng)制新的水稻育種材料、有效利用野生稻、進(jìn)一步挖掘和定位野生稻優(yōu)良抗性基因奠定了基礎(chǔ)。