蒙秋 謝興潤 張靜 王海燕 黃守國

化療是中晚期宮頸癌患者重要的治療手段，雖然初期患者對化療反應(yīng)良好，但隨著宮頸癌細(xì)胞對化療藥物的抵抗和耐受的產(chǎn)生，化療耐藥會(huì)導(dǎo)致宮頸癌化療失敗[1]。順鉑是宮頸癌的基礎(chǔ)化療藥，對順鉑的化療耐藥是臨床治療中的一個(gè)障礙[2]。因此，研究與順鉑類化療抵抗相關(guān)的分子機(jī)制以提高化療效果具有重要意義。研究表明，circRNA對婦科惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要的調(diào)控作用，在耐藥性中起著至關(guān)重要的作用，可為抗腫瘤藥物耐藥性的研究提供新的靶點(diǎn)，針對其靶向治療有望成為治療宮頸癌的新策略[3,4]。研究報(bào)道，敲除circMAN2B2可通過調(diào)節(jié)miR-1205/S100A8軸抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，侵襲，遷移并減小腫瘤大小[5]。circMAN2B2敲低通過miR-1275/FOXK1軸可顯著抑制H1299和A549肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[6]。而circMAN2B2對宮頸癌細(xì)胞及順鉑的敏感性的影響尚不清楚。而circRNA可通過調(diào)控miRNA影響腫瘤進(jìn)展，研究顯示，miR-216a-3p在宮頸癌中低表達(dá)，高表達(dá)可抑制宮頸癌的增殖，集落形成和侵襲[7]。檸檬苦素降低miR-216a甲基化水平，從而增加miR-216a-3p表達(dá)并隨后抑制Wnt/β-catenin途徑來減弱乳腺癌細(xì)胞對阿霉素的耐藥性[8]，表明miR-216a-3p參與調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的進(jìn)展，且與癌細(xì)胞的藥物耐藥性有關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究circMAN2B2對宮頸癌細(xì)胞及順鉑的敏感性的影響是否與miR-216a-3p有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌HeLa細(xì)胞(貨號(hào)：HZX600，上海滬崢生物科技有限公司)；RPMI-1640完全培養(yǎng)基(貨號(hào)：M0201A，上海盈灣生物科技有限公司)；順鉑(貨號(hào)：13119-100，艾美捷科技有限公司)；MTT試劑盒(貨號(hào)：M1020，上海恒斐生物科技有限公司)；Trizol試劑(貨號(hào)：5301100，杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：R1012，廣州東盛生物科技有限公司)；SYBR Premix ExTaqTM試劑盒(貨號(hào)：RR420A，武漢科昊佳生物科技有限公司)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒(貨號(hào)：KA3784，上海群己生物科技有限公司)；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(貨號(hào)：AD10-2，上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)；RIPA蛋白裂解液(貨號(hào)：RIPA20110527，上海研謹(jǐn)生物科技有限公司)；二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒(貨號(hào)：701780-480，美國Cayman公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞的建立 宮頸癌HeLa細(xì)胞用RPMI-1640完全培養(yǎng)基在37℃條件下培養(yǎng)，取對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞，將其分別暴露于不同濃度順鉑梯度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直至在1 μmol/L順鉑濃度的培養(yǎng)基中正常生長，所得細(xì)胞即順鉑耐藥宮頸癌細(xì)胞HeLa/DDP。

1.3 細(xì)胞分組 取對數(shù)生長期細(xì)胞HeLa/DDP，將si-NC、si-circMAN2B2轉(zhuǎn)染至HeLa/DDP細(xì)胞中，再用2 μmol/L順鉑處理，記為DDP+si-NC組、DDP+si-circMAN2B2組；將si-circMAN2B2分別與anti-miR-NC、anti-miR-216a-3p轉(zhuǎn)染至HeLa/DDP細(xì)胞中，再用2 μmol/L順鉑處理，記為DDP+si-circMAN2B2+anti-miR-NC組、DDP+si-circMAN2B2+anti-miR-216a-3p組。

1.4 MTT檢測細(xì)胞增殖抑制率 將HeLa、HeLa/DDP細(xì)胞分別用濃度為1、2、4、8、16、32 μmol/L的順鉑處理，培養(yǎng)48 h后按MTT試劑盒說明操作，用酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度(OD)值，細(xì)胞增殖抑制率=(1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD對照組)×100%。繪制抑制率曲線，計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。其他各組細(xì)胞按上述方法檢測細(xì)胞增殖抑制率。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測circMAN2B2和miR-216a-3p的表達(dá)水平 提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照試劑盒說明進(jìn)行PCR，相對表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。circMAN2B2和miR-216a-3p分別以GAPDH和U6為內(nèi)參，circMAN2B2上游引物序列：5’-CCCAACATGAGTGAGCCTGT-3’，下游引物序列：5’-GCACCGAGGCATTGAAGAAC-3’；GAPDH上游引物序列：5’-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3’，下游引物序列：5’-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3’；miR-216a-3p上游引物序列：5’-CACAGTGGTCTCTGGGATTATG-3’，下游引物序列：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測circMAN2B2和miR-216a-3p的靶向調(diào)控 構(gòu)建circMAN2B2野生型表達(dá)載體WT-circMAN2B2和突變型表達(dá)載體MUT-circMAN2B2，將其分別與miR-NC和miR-216a-3p共轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞中；按照說明書檢測熒光素酶活性。將pcDNA、pcDNA-circMAN2B2、si-NC、si-circMAN2B2轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞中，按1.5中方法檢測miR-216a-3p表達(dá)水平。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集1.3中各組細(xì)胞，按試劑盒操作進(jìn)行，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.8 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測蛋白表達(dá) 提取1.3中各組細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒定量。蛋白經(jīng)SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉，然后用一抗和二抗孵育，暗室曝光顯影，定影，用Quantity One分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 順鉑對宮頸癌HeLa細(xì)胞和宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞HeLa/DDP增殖抑制率的影響 用不同濃度的順鉑作用HeLa和HeLa/DDP細(xì)胞，與HeLa細(xì)胞比較，HeLa/DDP細(xì)胞增殖抑制率顯著降低，IC50值升高(P<0.05)。見表1。

表1 順鉑對宮頸癌HeLa細(xì)胞和宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞HeLa/DDP增殖抑制率的影響

2.2 circMAN2B2和miR-216a-3p在HeLa細(xì)胞和HeLa/DDP細(xì)胞中的表達(dá) 與HeLa細(xì)胞比較，HeLa/DDP細(xì)胞中circMAN2B2表達(dá)水平升高，miR-216a-3p表達(dá)水平降低(P<0.05)。見表2。

表2 circMAN2B2和miR-216a-3p在HeLa細(xì)胞和HeLa/DDP細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 circMAN2B2靶向調(diào)控miR-216a-3p的表達(dá) StarBase預(yù)測顯示，circMAN2B2的序列中含有與miR-216a-3p互補(bǔ)的核苷酸序列。WT-circMAN2B2與miR-216a-3p共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性低于WT-circMAN2B2與miR-NC組共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(P<0.05)，而MUT-circMAN2B2與miR-216a-3p或miR-NC共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。過表達(dá)circMAN2B2，miR-216a-3p表達(dá)水平降低(P<0.05)，抑制circMAN2B2表達(dá)后miR-216a-3p表達(dá)水平升高(P<0.05)。見圖1，表3、4。

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

圖1 circMAN2B2的序列中含有與miR-216a-3p互補(bǔ)的核苷酸序列

2.4 抑制circMAN2B2表達(dá)聯(lián)合順鉑(2 μmol/L)對HeLa/DDP細(xì)胞增殖和凋亡的影響 與DDP+si-NC組比較，DDP+si-circMAN2B2組circMAN2B2表達(dá)水平降低，miR-216a-3p表達(dá)水平升高，細(xì)胞增殖抑制率升高，細(xì)胞凋亡率升高，Ki-67、Bcl-2表達(dá)水平降低，Bax表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2，表5。

表4 circMAN2B2調(diào)控miR-216a-3p的表達(dá)

圖2 抑制circMAN2B2表達(dá)聯(lián)合順鉑對HeLa/DDP細(xì)胞增殖和凋亡的影響;A 增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；B 細(xì)胞凋亡流式圖

表5 抑制circMAN2B2表達(dá)聯(lián)合順鉑對HeLa/DDP細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.5 干擾miR-216a-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制circMAN2B2表達(dá)對HeLa/DDP順鉑敏感性的作用 與DDP+si-circMAN2B2+anti-miR-NC組比較，DDP+si-circMAN2B2+anti-miR-216a-3p組miR-216a-3p表達(dá)水平降低，細(xì)胞增殖抑制率降低，細(xì)胞凋亡率降低，Ki-67、Bcl-2表達(dá)水平升高，Bax表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3，表6。

圖3 干擾miR-216a-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制circMAN2B2表達(dá)對HeLa/DDP順鉑敏感性的作用;A 增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；B 細(xì)胞凋亡流式圖

表6 干擾miR-216a-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制circMAN2B2表達(dá)對HeLa/DDP順鉑敏感性的作用

3 討論

宮頸癌對放化療不敏感是造成患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、預(yù)后差的重要原因，因此研究宮頸癌化療敏感性的相關(guān)機(jī)制，對克服宮頸癌患者的化療耐藥以及延長患者生存期具有重要意義[9,10]。順鉑耐藥是宮頸癌化療的常用藥物，本實(shí)驗(yàn)通過順鉑梯度暴露法構(gòu)建順鉑耐藥宮頸癌細(xì)胞株HeLa/DDP，且發(fā)現(xiàn)HeLa/DDP細(xì)胞增殖抑制率低于HeLa細(xì)胞，而半數(shù)抑制濃度高于HeLa細(xì)胞，表明HeLa/DDP細(xì)胞對順鉑耐藥，構(gòu)建成功。研究報(bào)道circRNA可影響腫瘤細(xì)胞的化療耐藥性[11]。circMAN2B2在胃癌組織中高表達(dá)；沉默circMAN2B2明顯降低了SNU-16和AGS細(xì)胞的活力，存活率，遷移率，但增強(qiáng)了細(xì)胞凋亡，circMAN2B2可能通過調(diào)節(jié)miR-145以及PI3K/AKT和JNK途徑發(fā)揮其功能[12]。敲除circMAN2B2可通過海綿化miR-217抑制肝癌細(xì)胞系Hep-G2和Huh-7的增殖[13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HeLa/DDP細(xì)胞中circMAN2B2表達(dá)水平高于HeLa細(xì)胞，提示circMAN2B2或與HeLa細(xì)胞的順鉑耐藥有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步抑制circMAN2B2表達(dá)的同時(shí)用順鉑作用HeLa/DDP細(xì)胞，結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖抑制率升高，細(xì)胞凋亡率升高，Ki-67、Bcl-2表達(dá)水平降低，Bax表達(dá)水平升高；表明抑制circMAN2B2表達(dá)可抑制HeLa/DDP細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡；抑制circMAN2B2表達(dá)增強(qiáng)了HeLa細(xì)胞對順鉑的敏感性。

已有研究報(bào)道，miR-216a-3p抑制宮頸癌的增殖和侵襲[7]。且研究報(bào)道m(xù)iR-216a-3p在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖[14]。miR-216a-3p可抑制肺癌細(xì)胞的活力，遷移，侵襲和增殖，同時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-216a-3p在HeLa/DDP細(xì)胞中低表達(dá)，表明miR-216a-3p或與宮頸癌的順鉑敏感性有關(guān)。此外，本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)circMAN2B2靶向調(diào)控miR-216a-3p；而干擾miR-216a-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制circMAN2B2表達(dá)對HeLa/DDP順鉑敏感性的作用。

綜上所述，抑制circMAN2B2表達(dá)可能通過上調(diào)miR-216a-3p增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。