石強(qiáng) 徐建廣

脊髓損傷常導(dǎo)致?lián)p傷節(jié)段以下肢體出現(xiàn)嚴(yán)重運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)功能障礙。由于缺乏有效治療方法，脊髓損傷患者的預(yù)防、治療和康復(fù)成為亟待解決的問(wèn)題。近年來(lái)，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)在脊髓損傷治療中受到較多關(guān)注。MSC的療效主要來(lái)自旁分泌效應(yīng)，而非MSC的分化和植入，因此含有各種旁分泌介質(zhì)的MSC來(lái)源外泌體可能成為脊髓損傷的治療策略之一。

1 MSC來(lái)源外泌體治療脊髓損傷的機(jī)制

外泌體廣泛存在于體液中，它是細(xì)胞外囊泡的主要亞類之一，幾乎所有類型細(xì)胞均會(huì)分泌外泌體[1]。MSC來(lái)源外泌體含有大量不同種類的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等活性物質(zhì)，與MSC相比，外泌體更容易獲得和儲(chǔ)存，并且其應(yīng)用幾乎不受倫理限制。外泌體的體積明顯小于MSC，因此不會(huì)被肺組織和肝組織捕獲，并且可穿過(guò)血脊髓屏障[2]。MSC來(lái)源外泌體治療脊髓損傷的機(jī)制涉及以下一些方面。

1.1 抗炎作用

促炎因子[如白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α]與抗炎因子的相對(duì)水平與脊髓損傷患者的功能恢復(fù)相關(guān)。Romanelli等[3]使用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCMSC)來(lái)源外泌體在體外直接與活化的小膠質(zhì)細(xì)胞相互作用，發(fā)現(xiàn)其可在繼發(fā)性損傷過(guò)程中抑制促炎因子表達(dá)。他們對(duì)脊髓損傷大鼠模型靜脈注射該外泌體，發(fā)現(xiàn)其可抑制IL-1β和IL-6的表達(dá)，抑制瘢痕形成，從而有助于運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。

神經(jīng)炎癥的特征是由各種外部刺激激活體內(nèi)的常駐免疫細(xì)胞。這種激活由核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白 (NLRP) 3炎癥小體介導(dǎo)，在繼發(fā)性脊髓損傷中起關(guān)鍵作用[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體可在脊髓損傷后被觸發(fā)和上調(diào)[5-6]，而抑制NLRP3炎癥小體激活可以促進(jìn)大鼠脊髓損傷后的功能恢復(fù)[5-7]。Huang等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，硬膜外脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體可促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，減少損傷體積。在脊髓損傷動(dòng)物模型中靜脈給予該外泌體，可顯著抑制NLRP3炎癥小體活化并降低炎癥因子表達(dá)。該外泌體在脊髓損傷后可上調(diào)抗凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤 (Bcl) -2的表達(dá)，降低促凋亡蛋白Bcl-2關(guān)聯(lián)蛋白X(Bax)的表達(dá)。Sun等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，hUCMSC來(lái)源外泌體可降低促炎因子TNF-α、IL-6、干擾素-γ和粒細(xì)胞集落刺激因子的水平，同時(shí)升高抗炎因子IL-4和IL-10的水平。

1.2 促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化

MSC來(lái)源外泌體的治療效果與其促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化有關(guān)。巨噬細(xì)胞是具有廣泛功能可塑性的異質(zhì)細(xì)胞，分為M1和M2兩種表型[10]。M1型巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生促炎因子、活性氧(ROS)和一氧化氮，促進(jìn)組織的炎癥和損傷。M2型巨噬細(xì)胞通常產(chǎn)生抗炎因子，并減少受傷部位促炎因子產(chǎn)生，從而導(dǎo)致組織重塑。

巨噬細(xì)胞可以從一種表型轉(zhuǎn)換到另一種表型，這是由損傷或感染后產(chǎn)生的炎癥因子誘導(dǎo)的[10-11]。M1型巨噬細(xì)胞對(duì)受損脊髓有加重?fù)p傷的作用，而M2型巨噬細(xì)胞在有抑制性底物時(shí)可以促進(jìn)軸突再生[12-13]。脊髓損傷后，M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量增加而M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量減少，兩者共同作用加重了損傷[13-14]。研究顯示，hUCMSC來(lái)源外泌體可觸發(fā)巨噬細(xì)胞從M1型向M2型分化[10]。Lankford等[15]的研究顯示，靜脈注射MSC來(lái)源外泌體可使其迅速到達(dá)受損脊髓，并可特異性結(jié)合M2型巨噬細(xì)胞，表明M2型巨噬細(xì)胞可以減輕脊髓損傷。

1.3 減少A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞

星形膠質(zhì)細(xì)胞在脊髓損傷過(guò)程中的作用非常重要，它們可以阻礙或促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的恢復(fù)[16]。Liddelow等[17]研究發(fā)現(xiàn)，A1型和A2型星形膠質(zhì)細(xì)胞分別由神經(jīng)炎癥和缺血誘導(dǎo)產(chǎn)生。A2型星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)上調(diào)某些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)發(fā)揮保護(hù)作用；而A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞在脊髓損傷后可迅速產(chǎn)生，并對(duì)髓鞘、突觸和神經(jīng)元有神經(jīng)毒性作用。因此，抑制A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞可能是治療脊髓損傷的方法之一。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)來(lái)源外泌體能有效促進(jìn)脊髓損傷后的功能恢復(fù)，其可能機(jī)制是抑制A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活[18]。A1星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物(C3補(bǔ)體)將以核因子-κB(NF-κB)依賴的方式上調(diào)[19]。NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可被多種炎癥因子激活，如TNF-α、IL-1、ROS。脊髓損傷的繼發(fā)性炎癥反應(yīng)受NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)，抑制該通路可促進(jìn)脊髓損傷后的功能恢復(fù)[20]。Wang等[20]的研究顯示，BMSC來(lái)源外泌體通過(guò)抑制NF-κB p65的核移位，有效減少了脊髓損傷誘導(dǎo)產(chǎn)生的A1型星形膠質(zhì)細(xì)胞。

1.4 保護(hù)血脊髓屏障

血脊髓屏障由基底膜、周細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞足突共同形成[21]，負(fù)責(zé)維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。周細(xì)胞作為神經(jīng)血管單位的一部分，對(duì)維持血管完整性和屏障特性非常重要。Jo等[22]的研究顯示，周細(xì)胞維持微血管穩(wěn)定性的主要機(jī)制可能為以下3種：①促進(jìn)內(nèi)皮緊密連接蛋白的表達(dá)；②調(diào)節(jié)跨細(xì)胞的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)；③調(diào)節(jié)緊密連接的排列。

脊髓損傷后保持血脊髓屏障的完整性可能成為治療方法之一。研究表明，BMSC來(lái)源外泌體可通過(guò)NF-κB p65途徑抑制周細(xì)胞遷移，從而在脊髓損傷后保持血脊髓屏障完整性，減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，促進(jìn)軸突再生和運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)[23]。Yuan等[24]直接使用周細(xì)胞來(lái)源外泌體治療脊髓損傷。他們發(fā)現(xiàn)，治療后可減少細(xì)胞凋亡，改善損傷脊髓的微循環(huán)，預(yù)防損傷和水腫的發(fā)生。

2 MSC來(lái)源外泌體的微RNA

微RNA(miRNA)是一種內(nèi)源性非編碼核糖核酸，長(zhǎng)度為20～24個(gè)核苷酸。成熟miRNA用Dicer酶處理后，通常與目的信使RNA(mRNA)相互作用，并結(jié)合到3’端，抑制目的mRNA的翻譯，促進(jìn)降解。越來(lái)越多的證據(jù)表明，具有雙層膜結(jié)構(gòu)的外泌體可作為miRNA的載體靶向脊髓損傷部位，外泌體可以穿透血腦屏障或血脊髓屏障，從而增強(qiáng)miRNA的治療效果[25]。MSC可通過(guò)預(yù)先轉(zhuǎn)染特定miRNA質(zhì)粒來(lái)分泌含高水平特定miRNA的外泌體[26]。目前在脊髓損傷治療研究中，主要涉及的外泌體miRNA為miRNA-21、miRNA-133b和miRNA-126。

2.1 miRNA-21

miRNA-21在脊髓損傷治療中得到最多研究。Zhou等[27]確定，miRNA-21修飾的BMSC來(lái)源外泌體可顯著促進(jìn)功能恢復(fù)，減少病變體積和細(xì)胞凋亡，其主要通過(guò)下調(diào)促凋亡基因FasL的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。miRNA靶基因分析表明，miRNA-21含有與FasL基因3′非翻譯區(qū)互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，這表明FasL基因是其直接靶基因。Xu等[28]報(bào)道，MSC來(lái)源外泌體的miRNA-21通過(guò)下調(diào)PTEN基因表達(dá)調(diào)節(jié)脊髓損傷患者神經(jīng)元的凋亡和分化，PTEN基因是miRNA-21的靶基因。進(jìn)一步的研究顯示，腫瘤抑制基因程序性細(xì)胞死亡因子4也是MSC來(lái)源外泌體分泌的miRNA-21的靶基因[29]。Ji等[30]的研究表明，MSC來(lái)源外泌體對(duì)肥胖大鼠脊髓損傷的保護(hù)作用減弱是由于存在胰島素抵抗，胰島素抵抗降低了外泌體分泌的miRNA-21水平。

2.2 miRNA-133b

miRNA-133b在神經(jīng)元的分化、生長(zhǎng)和凋亡中起重要作用[31],一些分子[如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3、RhoA和cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)]介導(dǎo)了miRNA-133b對(duì)脊髓損傷的保護(hù)作用。

STAT3分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中，負(fù)責(zé)神經(jīng)元增殖分化及軸突再生[32]，活化的STAT3介導(dǎo)由脊髓損傷引起的炎癥反應(yīng)[33]。RhoA在大鼠脊髓損傷后上調(diào)，作用于Rho相關(guān)激酶，RhoA與神經(jīng)元的死亡相關(guān)[34]。轉(zhuǎn)錄因子CREB在軸突再生中也起重要作用，激活CREB能夠?qū)顾枨室种苿┑淖饔?，并促進(jìn)體內(nèi)的軸突再生[35]。

Qiu等[36]證明，外源性miRNA-133b可顯著增加STAT3的磷酸化水平，參與脊髓損傷大鼠脊髓軸突再生。有研究顯示，RhoA是miRNA-133b的直接靶基因，MSC來(lái)源外泌體釋放的miRNA-133b可促進(jìn)軸突生長(zhǎng)[37]。Li等[38]進(jìn)一步證實(shí)，靜脈注射miRNA-133b修飾的MSC來(lái)源外泌體對(duì)脊髓損傷后的神經(jīng)元有保護(hù)作用，并能促進(jìn)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，其作用一部分來(lái)自于細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控激酶(ERK)1/2、STAT3和CREB的激活以及RhoA表達(dá)的抑制。Ren等[35]的研究表明，含miRNA-133b的外泌體通過(guò)影響與脊髓損傷動(dòng)物軸突再生和促進(jìn)神經(jīng)元功能恢復(fù)相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，顯著促進(jìn)神經(jīng)絲蛋白、生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(GAP)-43、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(GFAP)和髓鞘堿性蛋白的表達(dá)。

2.3 miRNA-126

近期研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-126能促進(jìn)脊髓損傷后的功能恢復(fù)。Hu等[39]的文獻(xiàn)報(bào)道，脊髓損傷后miRNA-126表達(dá)降低。該過(guò)程可能與Sprouty相關(guān)EVH1結(jié)構(gòu)域抑制蛋白(SPRED)-1、磷酸肌醇-3激酶(PI3K)調(diào)節(jié)亞單位2和血管細(xì)胞黏附分子1的靶基因表達(dá)下調(diào)有關(guān)。一些研究使用miRNA-126修飾的MSC來(lái)源外泌體治療脊髓損傷。Huang等[40]證明，含miRNA-126的外泌體能促進(jìn)脊髓損傷后的血管生成和神經(jīng)發(fā)生，減輕細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)脊髓損傷模型大鼠的功能恢復(fù)。Yuan等[41]采用靜脈注射miRNA-126修飾的MSC來(lái)源外泌體，發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)功能恢復(fù)和軸突再生。與miRNA-21相似，miRNA-126可能激活ERK1/2、STAT3和CREB，同時(shí)抑制RhoA表達(dá)。

2.4 其他miRNA

Yu等[42]將miRNA-29b修飾的BMSC來(lái)源外泌體注射到大鼠模型，發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)脊髓損傷大鼠的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，減少脊髓組織的病理?yè)p傷，促進(jìn)神經(jīng)元再生。其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)神經(jīng)再生相關(guān)蛋白(如神經(jīng)絲蛋白200、GAP-43和GFAP)的表達(dá)有關(guān)。

Zhao等[43]發(fā)現(xiàn)，BMSC來(lái)源外泌體在缺血脊髓中具有神經(jīng)保護(hù)作用。該效應(yīng)可能與BMSC預(yù)轉(zhuǎn)染后分泌高表達(dá)miRNA-25的外泌體相關(guān)，這表明miRNA-25有增強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)的作用。

miRNA-544也是具有神經(jīng)保護(hù)作用的外泌體miRNA。Li等[44]使用miRNA-544類似物轉(zhuǎn)染大鼠BMSC以獲得高表達(dá)miRNA-544的外泌體，并在脊髓損傷大鼠模型中靜脈注射這種外泌體。研究結(jié)果表明，miRNA-544可促進(jìn)脊髓損傷后神經(jīng)元的功能恢復(fù)。此外，miRNA-544在BMSC中的過(guò)表達(dá)減輕了脊髓損傷引起的組織學(xué)缺陷和神經(jīng)元缺失。

Liu等[45]的研究發(fā)現(xiàn)，外泌體miRNA-216a-5p通過(guò)抑制Toll樣受體4 /NF-κB和PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將小膠質(zhì)細(xì)胞從M1促炎表型轉(zhuǎn)變?yōu)镸2抗炎表型，從而增強(qiáng)治療作用。

3 結(jié)語(yǔ)

脊髓損傷治療是一個(gè)巨大挑戰(zhàn)，目前尚缺乏有效治療方法。來(lái)源于MSC的外泌體可以穿過(guò)血脊髓屏障，其作為良好的藥物載體在脊髓損傷治療中有較大潛力。未來(lái)需要開(kāi)展更多研究來(lái)闡明外泌體在脊髓損傷中的具體作用，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。