常大偉，雷 琦，閆 瑾，王虎玄

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021)

0 引言

麝香草酚(Thymol)，又名百里香酚，具有刺激性氣味，極易溶于乙醇、乙醚、氯仿等溶劑中[1].麝香草酚是牛至精油和百里香精油的主要活性成分，已被證實(shí)具有抗氧化、抗菌、抗癌、抗炎、抗痙攣等多種活性[2].因此，麝香草酚可以作為一種很有前途的抗菌劑應(yīng)用于食品保藏、功能性食品和醫(yī)藥制劑中.例如，Esquivel-Chávez通過添加不同量的麝香草酚，有效地抑制了接種到芒果傷口的微生物菌絲的生長以及降低了芒果的腐爛程度[3].然而，麝香草酚水溶性低、揮發(fā)性高、芳香氣味強(qiáng)，限制了它的廣泛應(yīng)用[4].

環(huán)糊精與客體形成包合物是一種應(yīng)用較為廣泛的方法，用此方法可以極大地克服某些物質(zhì)的一些缺點(diǎn)，如水溶性差、生物利用度差、氣味難聞等[5].環(huán)糊精與客體之間通過分子間作用力結(jié)合，使得客體分子部分或全部進(jìn)入主體，形成包合物[6].其中，β-CD是環(huán)糊精中最常用的壁材，因?yàn)樗子谏a(chǎn)、成本較低、空腔大小適宜且它的外表親水、內(nèi)腔親油，有利于包合疏水性物質(zhì)[7].目前，制備包合物的方法有多種，如飽和水溶液法、超聲波法、超臨界流體法、研磨法等[8].在這些方法中，飽和水溶液法被認(rèn)為是獲得包合物的最常用方法之一，具有簡單和高效的優(yōu)點(diǎn)，由于濾餅含水較少，縮短了獲得包合物的干燥時間，更有利于降低包合物干燥過程中的能耗和熱降解[9].因此，本實(shí)驗(yàn)采用飽和水溶液法制備麝香草酚-β-CD包合物.雖然甘永江等[10]在研究中測定了麝香草酚在β-CD及其衍生物溶液中的溶解度，繪制相溶解度曲線，并比較了不同烷基化β-CD對麝香草酚的增溶作用，但是對于包合物在高溫下的穩(wěn)定性沒有研究.

本文在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立最佳的制備工藝，同時對包合物進(jìn)行表征，對包合物的高溫穩(wěn)定性、溶解性進(jìn)行評價，以解決麝香草酚在生產(chǎn)加工中水溶性差、易揮發(fā)及緩釋等問題.

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

麝香草酚(89-83-8),上海阿拉丁生化科技股份有限公司；β-CD,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇(分析純),天津市天力化學(xué)試劑有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2600型紫外可見分光光度計(jì),龍尼柯(上海)儀器有限公司；UV-1800型紫外可見分光光度計(jì),上海美普達(dá)儀器有限公司；加熱磁力攪拌器,蘇州賽恩斯儀器有限公司；L500-A臺式低速離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；DZF型真空干燥箱,北京科偉永興儀器有限公司；WH-3微型漩渦混合儀,上海滬西分析儀器廠有限公司；真空傅里葉紅外光譜儀,德國布魯克(Bruker)公司；Smart Lab 9kW X射線衍射儀,日本理學(xué)Rigaku.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 麝香草酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

麝香草酚無水乙醇溶液(1.0 mg/mL)在200～500 nm掃描，確定最大吸收波長.

準(zhǔn)確稱取麝香草酚20 mg置于容量瓶中，加入無水乙醇定容至20 mL進(jìn)行溶解，配制得到質(zhì)量濃度為1 000μg/mL的儲備液.精密量取儲備液1 mL，并用蒸餾水稀釋，得到10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液.在最大吸收波長下，測定上述標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度.以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過最小二乘法擬合出線性回歸方程.

1.3.2 包合物制備工藝

采用飽和水溶液法制備包合物[11]，稱取適量的β-CD，加入蒸餾水，使用磁力攪拌器加熱至完全溶解，然后在磁力攪拌下加入一定量的麝香草酚溶液，并在一定溫度下攪拌數(shù)小時，完畢后置4 ℃冰箱過夜，第二天抽濾，經(jīng)無水乙醇洗滌2～3次后，置于25 ℃真空干燥箱中12 h，干燥至恒重，得到疏松的包合物粉末.

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

選取壁芯比(摩爾比)、攪拌時間、攪拌溫度作為影響包合物的三個因素.分別進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，計(jì)算各單因素的包合率和載量.

(1)壁芯比

選取壁芯比(摩爾比)因素水平為0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、攪拌時間為2.5 h、攪拌溫度為50 ℃，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn).

(2)攪拌時間

選取壁芯比(摩爾比)因素水平為1∶1、攪拌時間為0.5 h、1.5 h、2.5 h、3.5 h、4.5 h、攪拌溫度為50 ℃，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn).

(3)攪拌溫度

選取壁芯比(摩爾比)因素水平為1∶1、攪拌時間為2.5 h、攪拌溫度為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn).

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇對包合率影響較大的壁芯比A、攪拌溫度B、攪拌時間C為考察因素，以包合率Y為指標(biāo)，利用Design Expert軟件建立的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，對包合物的包合條件進(jìn)行優(yōu)化.響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平如表1所示.

表1 響應(yīng)面因素水平表

1.3.5 包合率和載量

將放置過夜的包合物溶液抽濾，并用無水乙醇洗滌兩次，以洗去未被包合的麝香草酚，記錄濾液的體積，將濾液進(jìn)行離心，離心條件選擇4 000 r/min、5 min.之后用紫外分光光度計(jì)測定吸光度，根據(jù)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到未被包合的麝香草酚的質(zhì)量.可用以下式(1)、(2)計(jì)算包合率和載量.

(1)

式(1)中：W0是初始加入麝香草酚的質(zhì)量，g;W1是微膠囊中的麝香草酚的質(zhì)量，g;CE是包合率，%.

(2)

式(2)中：W1是微膠囊中的麝香草酚的質(zhì)量，g;W2是初始加入β-CD的質(zhì)量，g;LC是載量，%.

1.4 包合物的表征

1.4.1β-CD及其形成的包合物的紅外光譜

采用紅外光譜法測定β-CD、麝香草酚、物理混合物、包合物.光譜范圍為4 000～400 cm-1，分辨率 4 cm-1，掃描累加次數(shù)32次.

1.4.2 XRD

將β-CD、麝香草酚、物理混合物、包合物測定，掃描速度8 °/min，掃描范圍5 °～60 °.

1.5 增溶倍數(shù)

分別稱取包合物0.5 g和麝香草酚0.1 g置于裝有8 mL蒸餾水的50 mL的離心管中，使包合物和麝香草酚在水溶液中達(dá)到飽和狀態(tài)，放入37 ℃恒溫?fù)u床中避光振蕩24 h，使得溶解達(dá)到平衡.靜置過夜，使用0.22μm的微孔膜進(jìn)行過濾，將濾液用蒸餾水適當(dāng)稀釋，在237 nm測定麝香草酚的含量，計(jì)算出包合物中麝香草酚的溶解度及增溶倍數(shù)[12].每種物質(zhì)重復(fù)測量3次.

1.6 高溫穩(wěn)定性

為了使麝香草酚與包合物中麝香草酚的釋放形成鮮明對比，分別稱取麝香草酚10.0 g、麝香草酚-β-CD包合物5.0 g于直徑為90 mm的玻璃皿中，置于100 ℃的烘箱中，麝香草酚每隔10 min測量一次質(zhì)量，包合物每隔1 h測量一次質(zhì)量，并按照以下公式(3)、(4)進(jìn)行計(jì)算釋放率，一式三份.

(3)

(4)

式(3)、(4)中：Y1是麝香草酚的釋放率，%;m0是麝香草酚初始時刻的質(zhì)量，g;mt是t時刻麝香草酚的質(zhì)量，g；Y2是包合物中麝香草酚的釋放率，%;M0是包合物中麝香草酚初始時刻的質(zhì)量，g;Mt是包合物中t時刻麝香草酚的質(zhì)量，g.

2 結(jié)果與討論

2.1 麝香草酚標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.1 最大吸收波長的選擇

圖1是麝香草酚在在200～500 nm波長處進(jìn)行掃描結(jié)果圖.從圖1可知，麝香草酚的最大吸收波長為237 nm.

圖1 麝香草酚的最大吸收波長

2.1.2 麝香草酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2是麝香草酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，以麝香草酚的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo).由圖2可知，麝香草酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.004 7x+0.021 4，其中x表示麝香草酚溶液的濃度，y表示麝香草酚溶液在237 nm處的吸光度值.R2=0.997 8，表明在所選取的濃度范圍內(nèi)麝香草酚溶液的濃度與吸光度值具有較好的線性關(guān)系.

圖2 麝香草酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 壁芯比對包合率和載量的影響

圖3是壁芯比對包合率和載量的影響.由圖3可得，隨著壁芯比的提高，包合率逐漸增大.韋永琴[13]也得到同樣的結(jié)果，隨著主客投料摩爾比的增加包合率先迅速增加后略有增加，其原因可能是在摩爾比小于1∶1時，芯材還沒有完全進(jìn)入空腔，當(dāng)達(dá)到1∶1時芯材幾乎全部進(jìn)入空腔，因此包合率迅速增加，再增加壁芯比使得包合率略有增加.載量隨著壁材的增加而減小，因?yàn)棣?CD的空腔的大小及數(shù)量是恒定的，因此當(dāng)壁材持續(xù)增加，包合的芯材不變，使得載量持續(xù)降低.

圖3 壁芯比對包合率和載量的影響

2.2.2 攪拌時間對包合率和載量的影響

圖4表示的是攪拌時間對包合率和載量的影響.從圖4可以明顯地觀察到，隨著攪拌時間的延長，包合率和載量先增大后降低.當(dāng)攪拌時間少于2.5 h時，芯材與壁材沒有完全接觸，芯材很難較好地分散在β-CD的空腔中，導(dǎo)致包合效果不好，而隨著攪拌時間延長，包合反應(yīng)逐漸達(dá)到平衡，包合率增大[14].包合物通過分子作用力結(jié)合，而這種結(jié)合力較弱，當(dāng)大部分麝香草酚被包合時，繼續(xù)延長攪拌時間會破壞已經(jīng)形成的作用力，導(dǎo)致包合率降低[15].

圖4 攪拌時間對包合率和載量的影響

2.2.3 攪拌溫度對包合率和載量的影響

圖5是攪拌溫度對包合率和載量的影響.從圖5可以看出，隨著溫度的升高，包合率和載量呈現(xiàn)先增大后降低的趨勢.從30 ℃升高到50 ℃，分子運(yùn)動加快，分子的碰撞幾率增大，麝香草酚進(jìn)入β-CD空腔的幾率增大，使得包合率和載量增大[16].而溫度繼續(xù)升高，包合率和載量降低的原因是包合反應(yīng)是放熱反應(yīng)，當(dāng)達(dá)到平衡溫度后溫度繼續(xù)升高不利于反應(yīng)向正反應(yīng)方向進(jìn)行，因此包合率和載量會降低[17].

圖5 攪拌溫度對包合率和載量的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行了響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示，采用Design-Expert軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到麝香草酚-β-CD包合物的包合率與各自變量的模擬方程為：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Y=81.22+8.77A-1.30B+0.65C+0.52AB+0.30AC+207BC-8.79A2-5.52B2-3.40C2

回歸模型方差分析表(如表3所示)，根據(jù)表中F值的大小可以判斷各個因素對包合率影響的大小，F(xiàn)值越大，對包合率的影響越大[18].因此各因素對包合物包合率的影響程度是：壁芯比A>攪拌溫度B>攪拌時間C.此外，從表中也可得知，該模型的P<0.01，表明該模型為極顯著.決定系數(shù)為R2=0.977 0說明此模型的擬合情況較好，回歸方程代表性較好.從回歸方程各項(xiàng)方差分析結(jié)果還可看出該方程的失擬項(xiàng)P值為0.143 6，不顯著，表明該方程對試驗(yàn)擬合程度好、誤差小，可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測，因此該模型適用于飽和水溶液法制備麝香草酚-β-CD包合物工藝參數(shù)優(yōu)化.

表3 方差分析結(jié)果表

圖6是各因素交互作用對包合率影響的響應(yīng)面圖和等高線圖.由圖6可知，攪拌時間和攪拌溫度的等高線呈橢圓形，表明兩者的交互作用顯著；壁芯比和攪拌溫度的等高線呈橢圓形，說明兩者的交互作用顯著；壁芯比和攪拌時間的等高線圖接近圓形，說明兩者的交互作用不顯著.

通過回歸模型預(yù)測的包合物制備最優(yōu)條件：壁芯比1.25，攪拌溫度49.24 ℃，攪拌時間2.59 h，包合率預(yù)測83.49%.為了驗(yàn)證可靠性，按照上述最佳工藝調(diào)整試驗(yàn)實(shí)際方案為：壁芯比1.25∶1，攪拌溫度50 ℃，攪拌時間2.6 h.平行操作3次.結(jié)果顯示，平均包合率為84.51%，實(shí)際值與預(yù)測值相差不大，模型真實(shí)可靠.

之前，Tao等[19]的文章也有相似的研究，但是在他的研究中，包合條件是在25 ℃攪拌48 h，得到包合物的包合率為74.57%～82.55%，由此得知攪拌溫度與攪拌時間在一定程度上會影響包合效果.本研究通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，包合率達(dá)到84.51%，包合率與Tao等的研究相比有所提高，并且縮短了攪拌時間，降低了麝香草酚的損失.

(a)壁芯比與攪拌溫度響應(yīng)面圖

2.4 包合物的表征

2.4.1 傅里葉紅外光譜

該方法通常用于確定主體中客體分子的存在，以及它們之間的相互作用[20].對于β-CD，2 906 cm-1處吸收峰與C-H伸縮的振動有關(guān)；1 155 cm-1和1 031 cm-1處的吸收峰分別與C-O-C非對稱伸縮和對稱伸縮的振動有關(guān)[21].圖7是β-CD、麝香草酚、物理混合物、包合物的傅里葉紅外光譜圖，圖7中麝香草酚的紅外光譜圖顯示在3 224 cm-1處是O-H振動收縮；2 958 cm-1、2 927 cm-1是C-H的振動收縮；1 621 cm-1、1 585 cm-1、1 517 cm-1、1 459 cm-1處對應(yīng)C=C的伸縮振動；1 157 cm-1、1 108 cm-1、1 091 cm-1、1 058 cm-1的吸收峰歸因于C-O伸縮振動.圖7中物理混合物的紅外光譜還可以觀察到麝香草酚特征峰，但在包合物的光譜中麝香草酚的特征峰消失或減弱，例如，圖7中在2 958 cm-1處的亞甲基的C-H不對稱伸縮消失了這是因?yàn)棣?CD中OH基團(tuán)的伸縮振動覆蓋了麝香草酚在此處的吸收峰[22]，證明了麝香草酚-β-CD包合物的形成.包合物的圖譜中1 689～1 551 cm-1處的特征峰明顯減少，這是因?yàn)轺晗悴莘臃肿舆M(jìn)入在β-CD空腔中，從而減少了麝香草酚分子的運(yùn)動[23].

圖7 β-CD、麝香草酚、物理混合物、包合物的傅里葉紅外光譜圖

2.4.2 XRD

特征峰在光譜中的出現(xiàn)、特征峰的升高或降低都是包合物形成的證據(jù)[24].

圖8是β-CD、麝香草酚、物理混合物、包合物的XRD圖.從圖8所示的物理混合物和麝香草酚的XRD衍射圖可以看出，麝香草酚在7.97 °、16.63 °、18.87 °、20.48 °、20.75 °和25.54 °處出現(xiàn)特征峰.由圖8物理混合物的衍射圖可以看出麝香草酚的特征峰還較明顯，并且物理混合物的衍射圖譜與β-CD的衍射圖譜相似，表明麝香草酚與β-CD之間沒有絡(luò)合作用.圖8中包合物的XRD衍射圖譜中，麝香草酚在7.97 °、25.54 °和10.58 °處的特征峰消失，在7.25 °處出現(xiàn)新峰，表明β-CD與麝香草酚發(fā)生了絡(luò)合作用.這些峰的變化說明麝香草酚經(jīng)β-CD包埋使得β-CD的結(jié)構(gòu)由籠型結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)向通道型結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步證實(shí)了包合物的形成[25].

圖8 β-CD、麝香草酚、物理混合物、包合物的XRD圖

2.5 增溶倍數(shù)

表4是37 ℃下麝香草酚與包合物中麝香草酚的溶解度.從表4中得出，麝香草酚在37 ℃時的溶解度為0.47±0.02 mg/mL，而包合物中的麝香草酚在37 ℃時的溶解度為0.67±0.3 mg/mL.包合物中麝香草酚的溶解度與未被包合的麝香草酚的溶解度相比增加了1.43倍，表明β-CD能夠增加麝香草酚在水中的溶解度.在Gürten等[26]的研究中也有相近的結(jié)果，替莫唑胺是一種水溶性低的抗癌藥物，并且它的穩(wěn)定性較差，經(jīng)過β-CD包合后，替莫唑胺的溶解度提高了1.25倍，從而提高藥物的利用度.

表4 37 ℃下麝香草酚與包合物中麝香草酚的溶解度

2.6 高溫穩(wěn)定性

圖9是100 ℃下麝香草酚與包合物中麝香草酚的釋放率圖.從圖9(b)得出，麝香草酚在100 ℃下120 min時的釋放率高達(dá)91.6%，而在圖9(a)中包合物中麝香草酚在2 h的釋放率只有13.7%，麝香草酚的釋放率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于包合物中麝香草酚的釋放率，表明包合后β-CD保護(hù)了麝香草酚，提高了麝香草酚的高溫穩(wěn)定性.同時也可以觀察到100 ℃下包合物在7 h后釋放率達(dá)到15.20%，而麝香草酚在2 h時釋放率達(dá)到91.6%，幾乎全部釋放，由此可見將麝香草酚包合有一定的緩釋性.

(a)包合物中麝香草酚在100 ℃的釋放率

3 結(jié)論

本研究對麝香草酚-β-CD包合物制備過程中的壁芯比、攪拌時間以及攪拌溫度進(jìn)行了優(yōu)化，以制備包合率較高的包合物.結(jié)果顯示，以壁芯比為1.25∶1、攪拌溫度為50 ℃、攪拌時間為2.6 h時，制備出包合率較高的包合物，此時包合率達(dá)到84.51%.同時，利用傅里葉紅外光譜和XRD表征手段證明了包合物的形成.此外，與單獨(dú)的麝香草酚相比，在β-CD的包合作用下，提高了麝香草酚的高溫穩(wěn)定性及水溶性，也表明麝香草酚-β-CD包合物具有一定的緩釋性.