李雨含， 李嘉鑫， 張?jiān)娿懀?張耀華， 李雨慶， 曾菊梅

1. 口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院，四川 成都（610041）；2. 四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院/華西第四醫(yī)院，四川 成都（610041）

齲病是發(fā)生于牙體硬組織的慢性菌斑性疾病，主要致齲病原體是變異鏈球菌。大量研究表明，噬菌體不僅能有效感染特定的宿主細(xì)菌，還可以裂解生物膜，達(dá)到傳統(tǒng)抗菌藥物無(wú)法實(shí)現(xiàn)的穿透生物膜的效果。

近年來(lái)，已有多個(gè)領(lǐng)域開(kāi)展噬菌體的臨床應(yīng)用，在齲病相關(guān)方面有數(shù)項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室研究的進(jìn)展。本文將從變異鏈球菌噬菌體與齲病防治方面作一綜述，希望能為齲病防治工作提供一種新的可能性。

1 傳統(tǒng)齲病防治策略面臨的問(wèn)題

齲病是以細(xì)菌為主要病原菌的牙體硬組織慢性進(jìn)行性破壞的疾病。許多研究表明變異鏈球菌是主要的致齲菌之一，其致齲性主要包括產(chǎn)酸和耐酸力強(qiáng)、能合成細(xì)胞內(nèi)外多糖、對(duì)牙體組織粘附力強(qiáng)。值得強(qiáng)調(diào)的是，齲病的發(fā)生不是單純的致齲菌導(dǎo)致的，而是牙菌斑生物膜微生態(tài)失衡的結(jié)果。牙菌斑生物膜是粘附在牙體組織表面的一種整體生存的微生物生態(tài)群體。當(dāng)細(xì)菌以生物膜形式存在時(shí)耐藥性明顯增強(qiáng)，抗菌劑不僅不能有效清除生物膜，還可能誘導(dǎo)耐藥性產(chǎn)生。生物膜參與耐藥形成有多種機(jī)制，如物理屏障作用、細(xì)菌密度感應(yīng)系統(tǒng)［1］、生物膜中基因表型改變、氧化應(yīng)激反應(yīng)［2］等；但這些機(jī)制都不是單獨(dú)存在的，不同機(jī)制間可能存在協(xié)同作用。

目前臨床上對(duì)口腔齲齒的防治方式多是利用機(jī)械手段或者化學(xué)抗菌劑的方法來(lái)抑制消滅這些口腔細(xì)菌和菌斑。但由于抗菌劑的作用是非特異的，可將口腔內(nèi)的致病菌和有益細(xì)菌一起清除，最終破壞口腔環(huán)境生態(tài)平衡，并導(dǎo)致新的疾病發(fā)生。近年來(lái)，致病菌的耐藥病例日漸增多，耐藥現(xiàn)象給臨床抗感染治療留下了極大挑戰(zhàn)。目前認(rèn)為致病菌的耐藥性與生物膜形成有關(guān)，因?yàn)樯锬な沟脗鹘y(tǒng)抗菌劑無(wú)法有效對(duì)致齲細(xì)菌發(fā)揮作用［3］。

2 噬菌體及其基本特性

噬菌體是一類(lèi)由蛋白質(zhì)外殼和核酸組成的細(xì)菌依賴(lài)性的病毒，也稱(chēng)細(xì)菌病毒。大多數(shù)噬菌體結(jié)構(gòu)為有尾部結(jié)構(gòu)的二十面體，包括了一個(gè)二十面體的頭部，一個(gè)中空的針狀結(jié)構(gòu)及外鞘組成的尾部，以及尾絲和尾針組成的基部。對(duì)于有尾噬菌體來(lái)說(shuō)，依據(jù)其尾部結(jié)構(gòu)又可以分為長(zhǎng)尾噬菌體科、短尾噬菌體科和肌尾噬菌體科。變異鏈球菌噬菌體屬于其中的長(zhǎng)尾噬菌體科，頭部為等軸二十面體衣殼，尾部為非收縮性長(zhǎng)尾，其衣殼直徑估計(jì)為（67 ± 0.4）nm，非收縮尾的長(zhǎng)度估計(jì)為（283 ± 7）nm，寬（8.3 ± 0.1）nm［4］。

噬菌體通常具有感染特異性、宿主依賴(lài)性、指數(shù)增殖等特性。另外，噬菌體能夠產(chǎn)生一種肽聚糖水解酶，即噬菌體裂解酶。裂解酶靶向接觸特定的細(xì)菌，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖快速水解而使細(xì)菌迅速裂解死亡［5］。除了浮游細(xì)菌，裂解酶還可以破壞生物膜基質(zhì)，或通過(guò)降解細(xì)菌之間的交流信號(hào)的酶，破壞生物膜中細(xì)菌的群體感應(yīng)，從而有效裂解生物膜［6］。

3 變異鏈球菌特異性噬菌體的發(fā)現(xiàn)

眾多實(shí)驗(yàn)室研究已經(jīng)證明，噬菌體能有效地殺滅浮游細(xì)菌以及裂解生物膜。但是生物膜的特殊結(jié)構(gòu)可能成為噬菌體的完美避難所，使得變異鏈球菌噬菌體難以分離。目前已有的關(guān)于變異鏈球菌噬菌體分離及鑒定的研究數(shù)量并不多。

最早Greer 等和Klein 等觀察到幾株變異鏈球菌裂解并釋放出病毒顆粒，表明可能存在原噬菌體。1977 年，Brady 等通過(guò)電子顯微鏡從一位患者的牙菌斑樣本中觀察到了噬菌體樣顆粒。這些噬菌體樣顆粒截面為六邊形，直徑約為1 100 nm，中央含有一個(gè)高密度的核。1988 年，Armau 等成功地從1 000 多個(gè)牙菌斑樣本中分離出了變異鏈球菌的 特 異 性 噬 菌 體M102。1993 年，Delisle 和Rost?kowski 證實(shí)并擴(kuò)展Armau 等的初步觀測(cè)結(jié)果，從中分離出了三種變異鏈球菌噬菌體，經(jīng)鑒定均為烈性噬菌體，分別命名為M102、e10 和f1［7］。三者形態(tài)同屬于長(zhǎng)尾噬菌體科。三種噬菌體的基因組均由長(zhǎng)31～35 kb 的線性雙鏈DNA 組成且具有一些共同序列，表明其可能來(lái)自相同的祖先。

2012 年，Delisle 等［4］對(duì)來(lái)自同一實(shí)驗(yàn)室不同批次的M102 噬菌體再次測(cè)序分析，在其中發(fā)現(xiàn)了M102AD。M102AD 同樣為烈性噬菌體，其形態(tài)、尺寸與M102 一致，在核苷酸水平也高度相似。噬菌體M102AD 只能感染少數(shù)血清型c 菌株，與此同時(shí)c 特異性抗血清可以阻斷M102AD 的吸附。

2015 年，Dalmasso 等［8］分離出了一種新型變異鏈球菌噬菌體φAPCM01。噬菌體φAPCM01 亦屬于長(zhǎng)尾噬菌體科，核苷酸水平與M102、M102AD 相似性達(dá)85%，能在數(shù)小時(shí)內(nèi)有效地抑制變異鏈球菌的生長(zhǎng)及其生物膜代謝活動(dòng)。

4 噬菌體在齲病防治中的應(yīng)用前景

目前齲病防控已經(jīng)比較成熟，主要有刷牙等機(jī)械方法以及潔牙、涂氟、窩溝封閉等臨床預(yù)防手段；在某些情況下還可在機(jī)械性控制菌斑的基礎(chǔ)上，配合抗菌劑使用。目前常見(jiàn)的防控措施都對(duì)公眾的口腔健康意識(shí)提出了較高的要求。根據(jù)2017 年第四次全國(guó)口腔健康流行病學(xué)調(diào)查，5 歲兒童患齲率為70.9%，12 歲兒童恒牙患齲率為38.5%，35～44 歲年齡組恒牙患齲率為89.0%，仍有待改善［9］。

目前替代抗生素的優(yōu)選方案有一半是基于噬菌體完成的，噬菌體相關(guān)制劑現(xiàn)已應(yīng)用于皮膚潰瘍、化膿性感染、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）感染、傷口感染預(yù)防、燒傷、呼吸道感染等臨床問(wèn)題中，以及食品安全、工業(yè)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。對(duì)于噬菌體相關(guān)制劑的研發(fā)主要包括野生型噬菌體、工程噬菌體和噬菌體裂解酶三個(gè)方面。

4.1 經(jīng)典的活噬菌體制劑

通過(guò)分離特異性噬菌體直接用于抗菌治療?；钍删w制劑在特異性、親和力、安全性方面都表現(xiàn)良好，但由于結(jié)構(gòu)較不穩(wěn)定，通常不能在未冷卻的情況下儲(chǔ)存［10］。現(xiàn)有的活噬菌體制劑可以通過(guò)凍干、噴霧干燥、添加穩(wěn)定性增強(qiáng)劑的方式，或?qū)⑹删w并入軟膏、可生物降解聚合物基質(zhì)或微粒中加工成較穩(wěn)定的制劑，在一定程度上解決穩(wěn)定性的問(wèn)題［11］。

4.2 噬菌體裂解酶制劑

噬菌體產(chǎn)生的裂解酶可以消化細(xì)菌細(xì)胞壁，從而釋放組裝好的噬菌體顆粒，其在裂解生物膜中也同樣表現(xiàn)優(yōu)異。噬菌體裂解酶制劑與活噬菌體制劑相比較而言，其分子量小，穩(wěn)定性更高。Vázquez 等［12］將噬菌體裂解酶用于下呼吸道感染的研究，顯示出其特異性的快速致死能力，并且不會(huì)影響目標(biāo)細(xì)菌以外的其他菌群。Delisle 等［4］將多種變異鏈球菌噬菌體（M102、e10 和f1）的裂解酶加入牙膏、漱口水等中來(lái)防治齲齒及其他口腔疾病。Yang 等［13］發(fā)現(xiàn)了第一種可對(duì)抗變異鏈球菌所有已知的血清型的噬菌體裂解酶，能夠廣譜裂解大多數(shù)鏈球菌，其通過(guò)改造裂解酶中與感染宿主有關(guān)的結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建出嵌合裂解酶，從而改善裂解活性，擴(kuò)大宿主譜。

4.3 工程噬菌體

噬菌體展示技術(shù)有十多年的歷史，現(xiàn)在已成為公司抗體制備的主要工具，通過(guò)將外源基因片段與噬菌體特定蛋白基因在其表面進(jìn)行融合表達(dá)，從而展示出特定的外源肽。

2018 年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主Gregory P.Winter 和George P.Smith 在噬菌體展示技術(shù)的基礎(chǔ)上，將抗體抗原結(jié)合位點(diǎn)的遺傳信息插入到噬菌體DNA中，篩選出能與抗體特異性高度結(jié)合的噬菌體，為單抗藥物的開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)［14］。Alam 等［15］利用該技術(shù)合成出帶有多種抗原結(jié)合片段（Fabs）的噬菌體庫(kù)，并篩選出針對(duì)主要致齲病原體（變異鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌）的抗原結(jié)合片段。篩選出的抗原結(jié)合片段中，F(xiàn)ab SM?10、Fab SS?2 分別顯示出對(duì)變異鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌生物膜的較強(qiáng)生長(zhǎng)抑制作用。Alam 等［15］再通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，將前述兩種抗原結(jié)合片段注入提前已感染致齲病原體并長(zhǎng)期接受生齲飲食的小鼠體內(nèi)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示注入抗原結(jié)合片段的小鼠與對(duì)照組小鼠相比，齲齒總數(shù)明顯減少，提示抗原結(jié)合片段具有阻止齲齒形成的能力，這為齲病的防治帶來(lái)新的啟發(fā)。

5 噬菌體治療的優(yōu)勢(shì)及局限性

5.1 噬菌體治療的優(yōu)勢(shì)

首先，特異性是噬菌體治療的關(guān)鍵之一，即噬菌體只針對(duì)感染的病原體，而不傷害其他共生菌群；其次，噬菌體的親和力通常很高，能快速吸附宿主細(xì)菌，從而發(fā)揮功能；最后，因?yàn)槭删w的高度特異性，不攻擊人體細(xì)胞，并且目前沒(méi)有臨床試驗(yàn)表明其存在免疫并發(fā)癥的副作用，所以理論上將其開(kāi)發(fā)成藥物具有較高的安全性。

另外，相比于傳統(tǒng)抗菌藥物，噬菌體還具有很強(qiáng)的生物膜降解能力，這是它獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。傳統(tǒng)抗菌藥物由于無(wú)法大量滲透生物膜形成的物理屏障，往往不能有效消滅菌斑生物膜。噬菌體產(chǎn)生的裂解酶不僅可以破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，還能摧毀生物膜基質(zhì)從而穿透生物膜［16］，所以噬菌體療法作為一種抗生物膜措施，在齲病防治方面有巨大潛力。

5.2 噬菌體治療面臨的困境

目前對(duì)于齲病致病菌特異性噬菌體的發(fā)現(xiàn)仍較少，特別是對(duì)于變異鏈球菌噬菌體的分離鑒定的研究并不多見(jiàn)；另外由于噬菌體的高度特異性，一種噬菌體只能感染一種細(xì)菌，治療疾病時(shí)可能需要多種噬菌體共同參與；如果將噬菌體運(yùn)用到齲病防治工作中，更多的齲病病原菌特異性噬菌體的分離鑒定實(shí)驗(yàn)還有待開(kāi)展。

噬菌體具有抗原性，一方面可以通過(guò)促進(jìn)人體固有免疫清除細(xì)菌，另一方面其免疫原性可誘導(dǎo)特異性體液記憶［17］，可能引起人體免疫合并癥。烈性噬菌體快速溶解細(xì)菌導(dǎo)致內(nèi)毒素和炎癥介質(zhì)的釋放，也為免疫反應(yīng)提供條件，但目前沒(méi)有臨床試驗(yàn)表明相關(guān)免疫并發(fā)癥的發(fā)生。

另外，細(xì)菌可能產(chǎn)生噬菌體感染抗性。有研究顯示細(xì)菌中存在CRISPR?Cas 系統(tǒng)［18］，可能作為細(xì)菌的抗性機(jī)制抵御噬菌體感染；但是在理論上噬菌體有能力與宿主細(xì)菌共同進(jìn)化，進(jìn)化出克服細(xì)菌抗性機(jī)制的能力；并且有研究顯示多種噬菌體混合的雞尾酒療法可以避免這種抵御噬菌體感染的機(jī)制產(chǎn)生［19?20］。

最后，噬菌體具有復(fù)雜的藥效學(xué)/藥代動(dòng)力學(xué)，需要大量的臨床試驗(yàn)探討其作為藥物的給藥途徑、優(yōu)化劑量等［21］，這為噬菌體相關(guān)制劑作為正式的治療措施提出挑戰(zhàn)，也是噬菌體應(yīng)用到臨床防治工作中所要面對(duì)的最大難題。

6 結(jié) 語(yǔ)

噬菌體具有優(yōu)異的抗生物膜能力，并且只特異性攻擊宿主細(xì)菌，因此它理論上適用于齲病防治；但與大多數(shù)感染性疾病不同，齲病與多種細(xì)菌定植相關(guān)，而噬菌體往往宿主范圍狹窄。因此，在臨床防治工作中可以通過(guò)噬菌體聯(lián)合傳統(tǒng)治療或其他藥物使用，或使用多種噬菌體的雞尾酒療法來(lái)克服這類(lèi)問(wèn)題。

【Author contributions】Li YH wrote the article. Li JX，Zhang SM，Zhang YH，Li YQ collected the references. Zeng JM reviewed the arti?cle. All authors read and approved the final manuscript as submitted.