紀(jì)雄發(fā) 邵宏偉 張余

（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院廣東省人民醫(yī)院骨科，廣州 510000）

2020 年骨科植入材料的全球市值約為490.2 億美元，并以5.1%的增長率快速升高[1]。長期以來，中國在臨床實(shí)踐過程中所使用的假體等植入物主要由強(qiáng)生、捷邁邦美、史賽克等歐美公司提供。伴隨我國科技實(shí)力的增強(qiáng)和外資的進(jìn)入，國內(nèi)企業(yè)的技術(shù)、工藝、研發(fā)和管理水平都得到大幅提升，截至2019年國內(nèi)企業(yè)所占市場份額達(dá)到40%，銷售額增至60 億美元[2]。目前，臨床應(yīng)用的骨科植入體以惰性金屬材料為主，其加工方式主要為傳統(tǒng)的模具成型和機(jī)床加工。在“健康中國2030”規(guī)劃綱要和“中國制造2025藍(lán)皮書（2018）”的戰(zhàn)略背景下，國內(nèi)在此領(lǐng)域取得了長足進(jìn)步，但與歐美發(fā)達(dá)國家之間仍存在差距[3]。傳統(tǒng)的骨科生物材料存在許多缺點(diǎn)，如生物活性不足、骨整合性能差及術(shù)后翻修率高等問題，對(duì)患者的康復(fù)和生活質(zhì)量產(chǎn)生了嚴(yán)重困擾[4]。我國極為重視骨科生物材料的基礎(chǔ)研究并投入大量研究資源，適合臨床應(yīng)用的新一代骨科生物材料成為研發(fā)熱點(diǎn)，有望實(shí)現(xiàn)彎道超車。

骨科生物材料需要在體內(nèi)應(yīng)用，因此研究存在諸多挑戰(zhàn)：①材料成分和結(jié)構(gòu)與機(jī)體之間復(fù)雜的相互作用；②針對(duì)篩選出的關(guān)鍵作用進(jìn)行材料設(shè)計(jì)；③新材料的生物驗(yàn)證。經(jīng)典的研究思路主要是通過研究者的經(jīng)驗(yàn)對(duì)生物材料進(jìn)行設(shè)計(jì)制造，再通過細(xì)胞和動(dòng)物等模型進(jìn)行功能驗(yàn)證[5]。這種研究方案效率低下，研發(fā)周期長，失敗風(fēng)險(xiǎn)高且存在臨床應(yīng)用的倫理問題，極大限制了生物材料的臨床轉(zhuǎn)化進(jìn)程[6]。材料的高通量設(shè)計(jì)研究是指通過材料計(jì)算科學(xué)大規(guī)模生成并制備出具有不同性質(zhì)與結(jié)構(gòu)的生物材料，使用實(shí)驗(yàn)室手段研究其對(duì)細(xì)胞行為的影響，從而篩選出關(guān)鍵的材料因素。高通量設(shè)計(jì)研究作為材料研究的熱門研究方法，在骨科生物材料的設(shè)計(jì)和應(yīng)用領(lǐng)域也有極高的應(yīng)用潛力。本文就近年來骨科生物材料高通量設(shè)計(jì)研究的關(guān)鍵因素、制備技術(shù)及應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，并展望其發(fā)展前景。

1 骨科生物材料高通量設(shè)計(jì)研究的關(guān)鍵因素

生物材料與體內(nèi)細(xì)胞的相互作用是個(gè)復(fù)雜的過程，涉及眾多的信號(hào)通路[7]，目前進(jìn)行深入研究的難度較大。通過近幾十年來的材料生物學(xué)研究，總結(jié)出影響細(xì)胞行為的關(guān)鍵因素是生物材料的成分、結(jié)構(gòu)（納米尺度、微米尺度、大體尺度）、表面功能化方法等，通過對(duì)這些因素的高通量設(shè)計(jì)研究，有望獲得最優(yōu)的骨科生物材料。

1.1 生物材料成分

生物材料的成分和配比對(duì)干細(xì)胞的黏附、增殖和分化產(chǎn)生重要影響[8-10]。Khan 等[11]用市面上購買的廉價(jià)且特性良好的生物可降解聚合物，通過高通量設(shè)計(jì)研究的材料配方與微陣列技術(shù)相結(jié)合，分析135種二元聚合混合物對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）的生長和分化等生物功能的作用。通過實(shí)驗(yàn)確定混合物具有良好的細(xì)胞黏附性，某些特定組合的混合物顯示出明顯的類骨結(jié)構(gòu)，可為BMSCs 的生長和成骨分化提供三維仿生支架從而促進(jìn)骨再生的進(jìn)程。Dolatshahi-Pirouz 等[12]通過高通量設(shè)計(jì)研究得出適用于骨組織修復(fù)的材料配方，同時(shí)利用三維細(xì)胞裝載的凝膠微陣列用于篩選不同的基質(zhì)成分，以快速且高性價(jià)比的方式篩選不同條件，可以廣泛應(yīng)用于組織工程。細(xì)胞和蛋白質(zhì)陣列在生物反應(yīng)的高通量設(shè)計(jì)研究中表現(xiàn)出顯著的效用，但是缺乏活體組織和器官本身的復(fù)雜性。Beachley等[13]將組織細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）顆粒作為二維陣列與細(xì)胞相結(jié)合，生成三維細(xì)胞-基質(zhì)微組織陣列。通過對(duì)ECM 進(jìn)行高通量設(shè)計(jì)研究，將組織的特定成分與生物活性相聯(lián)系，為生物材料的研究設(shè)計(jì)、深入了解再生和疾病機(jī)制提供新途徑[13]。

1.2 生物材料結(jié)構(gòu)

材料的表面形貌性質(zhì)對(duì)細(xì)胞的分化有顯著的調(diào)控作用[14,15]。在無成骨誘導(dǎo)劑的情況下，依賴材料表面微納結(jié)構(gòu)的改變重新編程細(xì)胞分化方向，被認(rèn)為是下一代骨科植入物設(shè)計(jì)的新方向[16]。Faia-Torres等[17]在臨床相關(guān)的生物可降解聚合物材料聚己內(nèi)酯（polycaprolactone,PCL）的表面設(shè)計(jì)了從亞微米到微米范圍（0.5～4.7 μm）的表面粗糙度梯度（Ra），以及平均峰間距離（RSm）從214 μm逐漸變化到33 μm。在一系列高通量設(shè)計(jì)研究的結(jié)構(gòu)組合中，研究其對(duì)BMSCs在缺乏地塞米松（desamethasone,Dex）的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（osteogenic induction medium,OIM）和基礎(chǔ)生長培養(yǎng)基（basal growth medium,BGM）中堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、Ⅰ型膠原蛋白（collagen type I,COLⅠ）的表達(dá)以及礦化能力的影響。與對(duì)照組相比，在OIM 中Ra:1.53 μm/RSm:79 μm 和BGM 中Ra:0.93 μm/RSm:135 μm 分別顯示出更佳的促成骨性能。對(duì)線性變化Ra 的高通量設(shè)計(jì)研究顯示，僅0.93 μm的平均PCL粗糙度就可以作為可溶性成骨誘導(dǎo)劑的有效替代物。這一策略可為材料表面的設(shè)計(jì)提供指導(dǎo)，以增強(qiáng)材料的成骨性能。表面圖案化在引導(dǎo)細(xì)胞行為方面也發(fā)揮著重要作用，但目前直接在金屬植入物上設(shè)計(jì)高分辨率的微圖案仍是巨大挑戰(zhàn)，且缺乏能夠?qū)Ⅲw外篩選的轉(zhuǎn)化作為體內(nèi)組織反應(yīng)的證據(jù)。Zhu等[18]利用光刻技術(shù)和電感耦合等離子體（inductively coupled plasma,ICP）的干法蝕刻技術(shù)，在鈦合金基底上精確制造形狀和尺寸可控的微圖案，構(gòu)建出包含34 個(gè)具有不同幾何參數(shù)微槽圖案的鈦合金用于對(duì)成骨細(xì)胞接觸引導(dǎo)的體外高通量設(shè)計(jì)研究，在體外系統(tǒng)研究了表面圖案尺寸、細(xì)胞形態(tài)特征、增殖和成骨標(biāo)志物表達(dá)之間的相關(guān)性。研究結(jié)果顯示，微槽圖案參數(shù)對(duì)成骨細(xì)胞的增殖幾乎無影響，但對(duì)細(xì)胞的形態(tài)、方向、焦點(diǎn)黏附（focal adhesion,FA）的形成和體外的成骨分化有明顯的調(diào)節(jié)。而脊寬3 μm、槽寬7 μm、深度2 μm 的特定凹槽圖案可以通過調(diào)節(jié)FA 的分布有效排列細(xì)胞，形成各向異性的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，從而促進(jìn)成骨分化。該研究提出的微加工方法可擴(kuò)展到鈦合金上制造各種形狀和尺寸控制的微圖案，而且還為骨科植入物的表面結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)提供了啟示。

1.3 表面功能化方法

植入物表面特性的差異間接調(diào)節(jié)了影響細(xì)胞命運(yùn)的大量信號(hào)通路，基質(zhì)化學(xué)和微觀結(jié)構(gòu)的變化也被證明能夠影響干細(xì)胞的生物學(xué)行為，但其深層機(jī)制尚不清楚[19]。Li 等[20]選擇經(jīng)過組織培養(yǎng)的聚苯乙烯（tissue culture-treated polystyrene，TCP）和左旋聚乳酸[poly(L-lactic acid),PLLA]基質(zhì)進(jìn)行BMSCs 的培養(yǎng)，這些基質(zhì)具有不同的地形（Fl：扁平狀、Fs：纖維狀）和化學(xué)成分（Pr：原始、Am：胺化），隨后對(duì)BMSCs進(jìn)行RNA 測序分析。差異表達(dá)基因（differentially expressed genes,DEGs）分析顯示，表面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)比表面化學(xué)成分能更明顯改變基因表達(dá)。與TCP控制相比，F(xiàn)l 和Fs 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)在基因表達(dá)方面表現(xiàn)出相反的表達(dá)譜。此外，化學(xué)處理的效果與拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的效果以協(xié)同的方式相互作用，Pr 樣品比Am 樣品促進(jìn)更多的DEGs表達(dá)。該研究強(qiáng)調(diào)培養(yǎng)表面對(duì)整體基因表達(dá)譜的調(diào)節(jié)具有重要作用，而且還提供了細(xì)胞與材料相互作用的新見解。生物肽被廣泛用于表面修飾，以開發(fā)適配性更好的植入物，其中包括細(xì)胞黏附精甘天冬氨酸肽和抗菌肽（antimicrobial peptide,AMP）。然而，如何篩選出預(yù)期活性的肽序列仍是巨大挑戰(zhàn)。Fang等[21]開發(fā)了高通量的策略，以點(diǎn)擊反應(yīng)為平臺(tái)制備具有肽密度梯度的表面，從而篩選出具有所需活性的位置。該策略為合理設(shè)計(jì)和制備功能性生物材料提供了可行策略。此外，陽極氧化是另一個(gè)簡單、高通量和低成本的化學(xué)反應(yīng)過程，產(chǎn)生的納米多孔氧化物涂層可以促進(jìn)骨結(jié)合并賦予抗菌和免疫調(diào)節(jié)特性[22]。上述這些表面改性方式可為優(yōu)化植入物表面性質(zhì)提供高通量的篩選手段，加速骨科生物材料的轉(zhuǎn)化進(jìn)程。

2 骨科生物材料高通量設(shè)計(jì)研究的制備技術(shù)

高通量材料篩選基于高通量設(shè)計(jì)研究和數(shù)據(jù)庫建立，其中計(jì)算材料設(shè)計(jì)是材料科學(xué)的一個(gè)新興領(lǐng)域[23]。通過將材料的基礎(chǔ)理論與智能數(shù)據(jù)挖掘和數(shù)據(jù)庫建設(shè)相結(jié)合，并利用當(dāng)前超級(jí)計(jì)算機(jī)架構(gòu)的力量，可快速產(chǎn)生、管理和分析巨大的材料數(shù)據(jù)庫，為研究材料和細(xì)胞的相互作用以及發(fā)現(xiàn)新型材料奠定理論基礎(chǔ)[24,25]。同時(shí)通過拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)優(yōu)化，可基于計(jì)算機(jī)高通量篩選的方式獲得力學(xué)適配的植入體結(jié)構(gòu)，避免出現(xiàn)應(yīng)力遮擋造成的并發(fā)癥[26]。在材料臨床數(shù)據(jù)庫領(lǐng)域，張余團(tuán)隊(duì)通過收集腫瘤患者不同類型植入體（如羥基磷灰石類、金屬類、有機(jī)高分子類等）的臨床數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)植入后腫瘤的復(fù)發(fā)率，建立植入物-腫瘤復(fù)發(fā)數(shù)據(jù)庫，可為骨腫瘤相關(guān)生物材料的高通量設(shè)計(jì)研究提供參考。另一方面，實(shí)現(xiàn)生物材料高通量設(shè)計(jì)研究的關(guān)鍵在于高通量篩選。傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)式的制備方法效率低、穩(wěn)定性差，無法滿足大規(guī)模的異質(zhì)性材料制備。隨著新技術(shù)的出現(xiàn)，該難題正逐漸被攻克。目前最有應(yīng)用前景的實(shí)現(xiàn)方式主要包括微陣列、3D打印和微流控等技術(shù)。

2.1 微陣列技術(shù)

新型生物材料的高通量設(shè)計(jì)研究可通過組合方法篩選不同材料來實(shí)現(xiàn)，以確定滿足特定生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的最佳成分。Hook 等[27]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于聚合物組合的研究來說，微陣列是一種適合的實(shí)現(xiàn)形式，可滿足在單一平臺(tái)上監(jiān)測成千上萬細(xì)胞與材料的相互作用。聚合物微陣列可以通過將單體打印到芯片后進(jìn)行聚合制備。材料的表面特性可以通過飛行時(shí)間二次離子質(zhì)譜法（time-of-flight secondary ion mass spectrometer,ToF-SIMS）、X 射線光電子能譜（X-ray photoelectron spectroscopy,XPS）和水接觸角（water contact angle,WCA）測量等方法進(jìn)行分析并與生物性能相關(guān)聯(lián)，在分析表面特性的基礎(chǔ)上，也可為材料設(shè)計(jì)提供相關(guān)的基礎(chǔ)?；诰酆衔镂㈥嚵械母咄坎牧峡蓱?yīng)用于從異質(zhì)性細(xì)胞群體中分離特定的細(xì)胞，研究干細(xì)胞的附著和分化以及細(xì)胞的可控轉(zhuǎn)染。高通量聚合技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展可基于聚合物微陣列的組合空間探索生物現(xiàn)象并提高效率，這可為發(fā)現(xiàn)更多優(yōu)化的聚合物材料奠定基礎(chǔ)。

2.2 3D打印技術(shù)

基于3D打印技術(shù)的多孔支架開發(fā)在骨組織工程領(lǐng)域受到極大關(guān)注[28-30]。然而，現(xiàn)有生物材料常不能滿足臨床對(duì)結(jié)構(gòu)支持、骨誘導(dǎo)性和可控生物降解性的要求。3D打印與傳統(tǒng)的材料加工方法截然不同，其作為一種自下而上的制備技術(shù)，可控微結(jié)構(gòu)可在復(fù)雜組合中滿足骨缺損的需求[31]。宏觀層面上材料的最優(yōu)組成和配比以及微觀層面上疾病的狀態(tài)和植入物的相互作用均是3D 打印骨科植入體需要考慮的因素[31]。3D打印技術(shù)個(gè)性化制備的特點(diǎn)，使得研究者能夠高通量篩選出有利于骨缺損修復(fù)的材料組成和結(jié)構(gòu)，為骨科植入物材料研究體系提供海量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[30]。

2.3 微流控技術(shù)

微流控作為另外一種高通量設(shè)計(jì)研究的手段正在成為研究的熱點(diǎn)技術(shù)，而能夠模擬骨骼結(jié)構(gòu)和功能的微流控芯片將為骨骼相關(guān)生物醫(yī)學(xué)研究提供重要平臺(tái)[32]。羥基磷灰石（hydroxyapatite,HA）是一種生物活性陶瓷材料，具有與骨礦化產(chǎn)物相似的結(jié)構(gòu)和組成。Tang 等[33]使用HA 作為微流控芯片組件，以提供一個(gè)高度仿生的骨環(huán)境，采用陶瓷立體光刻（stereolithography apparatus,SLA）技術(shù)打印了具有不同微通道結(jié)構(gòu)的HA 基底，最小溝槽寬度為50 μm。帶有微通道的HA 基底被一層薄的聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane,PDMS）密封，制成了HA-PDMS微流控芯片。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)表明，與單純PDMS 組相比，HA組更有利于成骨分化。此外，模型藥物鹽酸多柔比星（doxorubicin,DOX）的濃度梯度在圣誕樹結(jié)構(gòu)的HA-PDMS芯片上成功生成，并測定了DOX的半數(shù)最大抑制濃度（half maximal inhibitory concentration,IC50）。該研究結(jié)果表明，HA-PDMS 微流控芯片在骨科藥物的高通量篩選和骨科相關(guān)研究領(lǐng)域具有巨大潛力。Lee 等[34]使用微流控三維骨組織模型，對(duì)骨科植入物相關(guān)生物材料的功效進(jìn)行高通量的評(píng)估，同時(shí)研究植入物細(xì)菌感染的相關(guān)問題，將含有抗生素和雙相磷酸鈣（biphasic calcium phosphate,BCP）的納米顆粒，分散在多聚物基質(zhì)中，構(gòu)建出一個(gè)由八個(gè)含有微圖案的培養(yǎng)室組成的微流控體系，對(duì)其殺菌和促成骨效應(yīng)進(jìn)行評(píng)估。該研究顯著減少了所需的生物材料樣品和培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的數(shù)量，以及可在原位監(jiān)測生物材料與骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)相互作用，加快骨科植入材料的研發(fā)進(jìn)程。

3 骨科生物材料高通量設(shè)計(jì)研究的應(yīng)用現(xiàn)狀和展望

在通過高通量設(shè)計(jì)研究篩選出最優(yōu)的骨科植入材料并進(jìn)行臨床應(yīng)用方面，3D 打印技術(shù)走在前列[35]。臨床醫(yī)師將患者數(shù)據(jù)傳輸至專業(yè)3D 打印公司，分析軟件基于骨缺損的特點(diǎn)通過高通量的篩選獲得最優(yōu)的形狀和結(jié)構(gòu)，最后通過3D 打印將植入體打印為個(gè)性化產(chǎn)品，應(yīng)用于人體修復(fù)缺損部位[36]?；诨颊叩膫€(gè)性化3D 打印技術(shù)是骨科醫(yī)師需要把握的發(fā)展方向[37]，但是基于3D 打印技術(shù)的骨再生策略在骨科領(lǐng)域仍未得到充分驗(yàn)證，可能是由于缺乏對(duì)指導(dǎo)和促進(jìn)骨形成的生物機(jī)制的了解[38]。用于骨再生的設(shè)計(jì)系統(tǒng)（即固定系統(tǒng)和支架）仍處于概念狀態(tài)，進(jìn)展緩慢。通過高通量設(shè)計(jì)研究進(jìn)行更高效率的研究，獲得更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以豐富骨科生物材料設(shè)計(jì)的理論體系，在未來幾年將明顯加速該領(lǐng)域的進(jìn)展，將開發(fā)出安全、強(qiáng)大和標(biāo)準(zhǔn)化的臨床解決方案[39]。

4 小結(jié)

骨科生物材料的高通量設(shè)計(jì)研究作為一種新興的材料研究手段，可大規(guī)模研究材料性質(zhì)對(duì)自體修復(fù)的作用，篩選出具有臨床應(yīng)用價(jià)值的材料因素，對(duì)骨科植入體進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，有望極大促進(jìn)骨科生物材料臨床轉(zhuǎn)化的進(jìn)展。