葉維貞，劉向榮

心腦血管疾病在全球的病死率長期位于前列。數(shù)據(jù)顯示，心腦血管疾病是中國非傳染性疾病死亡的首要原因[1]。N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）是RNA轉(zhuǎn)錄后一種重要的表觀遺傳學(xué)修飾。研究發(fā)現(xiàn)，m6A修飾與心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。因此，本文對(duì)m6A修飾及相關(guān)調(diào)控蛋白在心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展中的作用進(jìn)行綜述。

1 m6A修飾概述

1.1 m6A修飾的特點(diǎn)及功能 迄今已發(fā)現(xiàn)170多種RNA表觀修飾，主要包括m6A、N1-甲基腺苷、5-甲基胞苷等，其中m6A是真核生物信使RNA（messenger RNA，mRNA）豐度最高的內(nèi)部修飾[3]。1974年，Desrosiers等[4]在Novikoff肝癌細(xì)胞mRNA的甲基化核苷中發(fā)現(xiàn)了m6A修飾。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，m6A不僅存在于酵母、植物、哺乳動(dòng)物等真核生物中，還存在于病毒、細(xì)菌、支原體中[5]。m6A修飾的位置通常具有高度的序列保守性，更傾向在RRACH（R=A、G；H=A、C、U）基序上。對(duì)mRNA m6A修飾富集的位置進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其在序列編碼區(qū)（coding sequence，CDS）和3’非翻譯區(qū)（3’ untranslated region，3’UTR）豐度較高，而且在兩者交界區(qū)域，終止密碼子附近有一個(gè)最高峰值，這種位置的分布特異性提示m6A修飾很可能具有特殊功能。

目前發(fā)現(xiàn)，若m6A修飾發(fā)生于5’非翻譯區(qū)，則能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)錄本5’帽端非依賴性的蛋白翻譯[6]。若m6A修飾僅發(fā)生于3’UTR，則能夠與YT521-B同源結(jié)構(gòu)域家族蛋白（YT521-B homology domain family，YTHDF）1結(jié)合，進(jìn)一步招募翻譯真核起始因子3（eukaryotic translation initiation factor 3，eIF3），促使5’帽端和3’poly尾端形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而促進(jìn)5’帽端依賴性的蛋白翻譯[6]。若m6A修飾發(fā)生于CDS或3’UTR，則能夠與YTHDF2結(jié)合，進(jìn)一步縮短RNA 3’poly尾端，促進(jìn)mRNA降解[6]。另外，發(fā)生于CDS或3’UTR的m6A修飾位點(diǎn)也能與胰島素樣生長因子2信使RNA結(jié)合蛋白（insulin-like growth factor 2 mRNA binding proteins，IGF2BPs）結(jié)合，招募RNA結(jié)合蛋白人抗原R或Matrin 3蛋白，提高mRNA穩(wěn)定性[6]。因此，m6A修飾調(diào)控mRNA的方式有多種，如調(diào)控mRNA前體的可變剪切、影響與微小RNA（microRNA，miRNA）結(jié)合效率、影響蛋白翻譯效率及mRNA穩(wěn)定性等[7]。

m6A不僅存在于mRNA，也存在于其他各種非編碼RNA上，包括長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）及miRNA等。與mRNA不同，m6A在lncRNA上更傾向于在整體轉(zhuǎn)錄本上平均分布，無特別的位置分布且功能上也存在差異，其功能包括降低lncRNA的穩(wěn)定性和調(diào)控lncRNA結(jié)合miRNA[8-9]。對(duì)于circRNA，m6A修飾可降低circRNA的穩(wěn)定性，促進(jìn)circRNA出核及翻譯多肽、調(diào)控細(xì)胞固有免疫[10-11]。在miRNA中，m6A可促進(jìn)miRNA前體的可變剪切，并可與miRNA聯(lián)合調(diào)控基因的表達(dá)[12]。

1.2 m6A修飾相關(guān)酶 m6A修飾是一個(gè)動(dòng)態(tài)且可逆的過程[13]，主要由三種催化酶實(shí)現(xiàn)，分別為m6A甲基轉(zhuǎn)移酶、m6A去甲基化酶及m6A結(jié)合蛋白。

m6A甲基轉(zhuǎn)移酶也稱m6A編碼器，RNA可由甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體介導(dǎo)甲基化修飾。甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體由多種蛋白復(fù)合形成，包括甲基轉(zhuǎn)移酶3（methyltransferase-like 3，METTL3）、甲基轉(zhuǎn)移酶14（methyltransferase-like 14，METTL14）、Wilms腫瘤1-相關(guān)蛋白（Wilms’ tumor 1-associating protein，WTAP）、RNA結(jié)合蛋白15等。METTL3是最主要的m6A修飾蛋白，METTL14輔助其結(jié)合底物[14]。而WTAP定位于METTL3-METTL14異二聚體，可提高催化活性。RNA結(jié)合蛋白15可與富含U的序列結(jié)合，使該序列附近的RRACH基序更易發(fā)生m6A修飾[15]。

m6A去甲基化酶又稱“消碼器”，主要包括脂肪和肥胖相關(guān)蛋白（fat mass and obesity associated protein，F(xiàn)TO）和α-酮戊二酸酯依賴性雙加氧酶同系物5（α-ketoglutarate dependent dioxygenase alkB homolog 5，ALKBH5）。與甲基轉(zhuǎn)移酶的作用方式不同，去甲基化酶通常由一個(gè)蛋白即可發(fā)揮去除m6A修飾的作用。FTO是最早被發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶，可以在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中去除m6A修飾，主要與肥胖和代謝有關(guān)；ALKBH5主要在細(xì)胞核中發(fā)揮作用[16]。

m6A結(jié)合蛋白又稱“讀碼器”，目前發(fā)現(xiàn)，m6A結(jié)合蛋白通過直接或間接結(jié)合RNA發(fā)揮作用，且一個(gè)m6A RNA轉(zhuǎn)錄本如果結(jié)合不同的“讀碼器”，后續(xù)會(huì)產(chǎn)生不同的反應(yīng)。直接結(jié)合RNA的“讀碼器”一般有一個(gè)專門識(shí)別m6A修飾的特定結(jié)構(gòu)域，如YT521-B同源（YT521-B homology，YTH）結(jié)構(gòu)域家族識(shí)別蛋白，其包括YTHDF1、YTHDF2及YTHDF3。當(dāng)m6A RNA轉(zhuǎn)錄本與YTHDF2和YTHDF3結(jié)合時(shí)，會(huì)促進(jìn)其降解；當(dāng)m6A RNA轉(zhuǎn)錄本與YTHDF1和YTHDF3結(jié)合時(shí)，能夠促進(jìn)蛋白翻譯[17]。此外，有些m6A結(jié)合蛋白不含特定識(shí)別結(jié)構(gòu)域，只含有普通RNA結(jié)合域，如IGF2BPs和eIF3。當(dāng)m6A結(jié)合蛋白與IGF2BPs結(jié)合后，將維持RNA轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性[18]；與eIF3結(jié)合后，可以促進(jìn)翻譯的啟動(dòng)[19]。

2 m6A修飾與心腦血管危險(xiǎn)因素

m6A可直接或間接地參與心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展。研究表明，m6A與心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素及其發(fā)生發(fā)展過程中的病理變化有關(guān)，如高血壓、高血脂、糖尿病、超重和肥胖等[20]。

2.1 高血壓 高血壓是心腦血管疾病的主要危險(xiǎn)因素之一。Mo等[21]研究了m6A相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（m6A-associated single nucleotide polymorphism，m6A-SNP）與血壓在大規(guī)模全基因組研究中的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)較多m6A-SNP均與血壓相關(guān)，而且在甲基化位點(diǎn)附近的m6ASNP會(huì)導(dǎo)致m6A甲基化位點(diǎn)的增加或減少，推測(cè)可能因?yàn)閱魏塑账岫鄳B(tài)性影響了m6A甲基化或轉(zhuǎn)錄的錯(cuò)義突變及變異，但還有待驗(yàn)證?？傊?，m6A-SNP在血壓調(diào)節(jié)中可能發(fā)揮一定作用，但具體機(jī)制尚未明確。

2.2 2型糖尿病 2型糖尿病約占糖尿病的90%，研究表明m6A修飾與2型糖尿病密切相關(guān)[22-23]。研究發(fā)現(xiàn)，m6A水平升高可刺激大鼠脂肪細(xì)胞的葡萄糖氧化，降低葡萄糖濃度，提示適當(dāng)水平的m6A才能維持適當(dāng)?shù)钠咸烟菨舛萚22]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，由于2型糖尿病患者m6A去甲基化酶FTO的表達(dá)增加，導(dǎo)致m6A水平降低，從而進(jìn)一步增加了患者心腦血管疾病風(fēng)險(xiǎn)[23]。此外，Yang等[24]研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者M(jìn)ETTL3和METTL14水平升高。同時(shí)高糖刺激FTO表達(dá)增加，從而誘導(dǎo)叉頭轉(zhuǎn)錄因子、葡萄糖-6-磷酸酶及二酯酰甘油轉(zhuǎn)移酶2表達(dá)增加，這與2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。故推測(cè)在2型糖尿病患者中，血糖升高可刺激FTO表達(dá)增加，導(dǎo)致m6A水平降低，從而使甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3和METTL14繼發(fā)性表達(dá)增加。

2.3 高脂血癥 研究表明m6A修飾在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用[25-28]。肝臟YTH結(jié)構(gòu)域包含蛋白2（YT521-B homology domain containing 2，YTHDC2）通過識(shí)別m6A位點(diǎn)，抑制肝臟脂肪基因mRNA的穩(wěn)定性，從而阻止其翻譯和表達(dá)[25]。抑制YTHDC2表達(dá)可導(dǎo)致小鼠肝臟中三酰甘油的積累。此外，當(dāng)敲除m6A甲基轉(zhuǎn)移酶Mettl3時(shí)，可使過氧化物酶體增殖物激活受體α mRNA穩(wěn)定性增強(qiáng)，從而提高其表達(dá)水平，減少脂質(zhì)積累[26]。

另外，研究發(fā)現(xiàn)METTL3通過脂肪酸合酶mRNA的m6A甲基化抑制肝臟對(duì)胰島素的敏感性，從而促進(jìn)脂肪酸合成[27]。研究發(fā)現(xiàn)已有大量脂質(zhì)相關(guān)的m6A-SNP，并表明m6A-SNP可能發(fā)揮調(diào)控脂質(zhì)代謝的作用[28]。

2.4 肥胖 研究表明，m6A修飾與肥胖的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[25，29-32]。Wang等[29]發(fā)現(xiàn)m6A去甲基化酶FTO通過靶向自噬相關(guān)蛋白5和自噬相關(guān)蛋白7調(diào)節(jié)自噬體和脂肪的形成；敲除小鼠Fto，可減少白色脂肪生成，并在體內(nèi)抑制靶向自噬相關(guān)蛋白5和自噬相關(guān)蛋白7依賴的自噬。在高脂飲食造成的小鼠肥胖模型中，發(fā)現(xiàn)m6A水平升高，肝臟中METTL3蛋白水平增加，F(xiàn)TO表達(dá)下降，故推測(cè)METTL3上調(diào)和FTO下調(diào)可能是導(dǎo)致肥胖患者m6A水平升高的原因[25]。此外，F(xiàn)TO通過抑制豬肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞中的Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞的分化，從而促進(jìn)脂肪形成。因此，抑制FTO的表達(dá)可抑制前體脂肪細(xì)胞的增殖和分化，從而抑制脂肪形成[30]。FTO也可通過調(diào)節(jié)有絲分裂促進(jìn)脂肪細(xì)胞的增殖[31]。研究發(fā)現(xiàn)m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體中WTAP、METTL3、METTL14通過促進(jìn)有絲分裂擴(kuò)增過程的細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變而促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化和增殖，也可促進(jìn)脂肪形成[32]。該結(jié)果推測(cè)可能因?yàn)閙6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體和FTO調(diào)控的基因不同。

3 m6A修飾在心血管疾病中的作用

研究表明，心肌缺血后m6A修飾增加[2，33]。由于METTL3表達(dá)明顯上調(diào)，m6A甲基化水平升高，從而抑制缺氧-復(fù)氧處理的心肌細(xì)胞自噬，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。敲除Mettl3可降低經(jīng)過缺氧-復(fù)氧處理的心肌細(xì)胞或缺血-再灌注處理的小鼠心臟組織中m6A水平，誘導(dǎo)自噬的增強(qiáng)，并減少細(xì)胞的凋亡[33]。

m6A去甲基化酶A L K BH 5過表達(dá)也可以減輕M ET TL3對(duì)缺氧-復(fù)氧處理的心肌細(xì)胞的影響，減少細(xì)胞凋亡。轉(zhuǎn)錄因子EB（transcription factor EB，TFEB）是METTL3作用的下游元件，METTL3可通過甲基化TFEB促進(jìn)RNA結(jié)合蛋白異構(gòu)核糖核蛋白D（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D，HNRNPD）與TFEB mRNA前體的結(jié)合，降低TFEB的表達(dá)水平，同時(shí)也可以相反地影響ALKBH5和METTL3，即與ALKBH5啟動(dòng)子結(jié)合并激活其轉(zhuǎn)錄，減少細(xì)胞凋亡。還可通過下調(diào)mRNA的穩(wěn)定性抑制METTL3，從而增強(qiáng)心肌細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞凋亡[33]。

4 m6A修飾在腦血管疾病中的作用

研究表明，在腦血管疾病中m6A甲基化水平升高[34]。與未缺血組相比，小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）1 h再灌注后3 h、6 h，F(xiàn)TO mRNA水平均降低；再灌注后12 h，F(xiàn)TO mRNA及其蛋白水平均降低，總?cè)ゼ谆富钚越档?，使雄性小鼠總體m6A水平升高；再灌注后24 h，雌性小鼠總體m6A水平也升高，而且m6A結(jié)合蛋白YTHDF1、YTHDF3 mRNA表達(dá)水平升高[34]。整體過程中m6A甲基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)并無明顯改變，但總?cè)ゼ谆富钚詤s降低[34]。其中神經(jīng)元中FTO的mRNA及蛋白表達(dá)均下調(diào)，ALKBH5表達(dá)未發(fā)生改變，可推測(cè)腦缺血后由于FTO下調(diào)，使m6A去甲基化減少，造成m6A水平升高。由于FTO是一種氧依賴性酶，故腦缺血后細(xì)胞缺血缺氧使FTO表達(dá)及活性下降，m6A水平升高，可能是引起繼發(fā)性腦損傷的原因之一[35-36]。

此外，Xu等[37]研究還發(fā)現(xiàn)MCAO發(fā)生后ALKBH5蛋白水平也顯著增加，但因總m6A甲基化水平升高，可推測(cè)ALKBH5蛋白水平的增加是繼發(fā)性改變。研究發(fā)現(xiàn)，在氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧治療后，敲除Alkbh5可加重缺氧造成的腦損傷，而FTO過表達(dá)可減輕氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧引起的損傷[37]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這是由于敲除Alkbh5，使凋亡相關(guān)蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl2）基因轉(zhuǎn)錄本m6A甲基化提高，Bcl2 mRNA降解，降低了Bcl2的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而FTO的過表達(dá)增加了Bcl2 mRNA及蛋白水平，并減輕了缺氧引起的細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞焦亡是一種細(xì)胞程序性死亡方式，表現(xiàn)為細(xì)胞不斷脹大直至細(xì)胞膜破裂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物釋放，進(jìn)而激活強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)[38]。腦缺血/再灌注損傷常常會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元的不可逆損傷，常表現(xiàn)為細(xì)胞焦亡。研究表明低溫治療可以減輕缺血再灌注造成的細(xì)胞焦亡[39]。Diao等[39]發(fā)現(xiàn)低溫可以通過抑制抑癌基因磷酸酶與張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homologous protein，PTEN）的m6A甲基化，從而激活磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路磷酸化，保護(hù)神經(jīng)元免受缺血缺氧引起的細(xì)胞焦亡。在缺氧/復(fù)氧的神經(jīng)元中，細(xì)胞活性下降，總RNA和PTEN mRNA的甲基化及表達(dá)水平升高，而低溫治療可保留細(xì)胞活力，使PTEN mRNA甲基化及表達(dá)水平降低，從而激活磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制細(xì)胞焦亡[39]。研究發(fā)現(xiàn)MicroRNA-421-3p作用于m6A讀碼蛋白YTHDF1，使其抑制炎癥信號(hào)通路核因子κB中p65 mRNA翻譯，從而抑制腦缺血/再灌注損傷中的炎癥反應(yīng)[40]。

目前，m6A的動(dòng)態(tài)調(diào)控與心腦血管疾病的關(guān)系已經(jīng)成為心腦血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。m6A調(diào)控心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制大多從調(diào)控甲基轉(zhuǎn)移酶與去甲基化酶的平衡方面推測(cè)獲得，但具體機(jī)制尚未明確。此外，由于當(dāng)前技術(shù)的限制，對(duì)單獨(dú)mRNA m6A位點(diǎn)的改變?nèi)杂幸欢y度。綜上所述，對(duì)m6A動(dòng)態(tài)且可逆的進(jìn)行調(diào)控，從而影響心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展，可為心腦血管疾病的預(yù)防和治療提供新的靶點(diǎn)和思路。

【點(diǎn)睛】本文綜述了m6A修飾及相關(guān)調(diào)控蛋白在心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，為心腦血管疾病的預(yù)防和治療提供新的思路。