音銘 李文庭

肝纖維化是肝臟的一種損傷-修復(fù)過(guò)程，其特征就是細(xì)胞外基質(zhì)(Extra cellular matrix，ECM)過(guò)度增生并沉積在肝臟，導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)和功能的異常。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)的激活和增殖是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[1-2]。肝活檢被認(rèn)為是評(píng)價(jià)纖維化的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，該技術(shù)有創(chuàng)，可重復(fù)性差，這些特點(diǎn)限制了其臨床應(yīng)用。目前無(wú)創(chuàng)診斷方法越來(lái)越受到人們的推崇，臨床上常用的無(wú)創(chuàng)診斷包括基于影像的無(wú)創(chuàng)診斷模型和基于血清學(xué)指標(biāo)的無(wú)創(chuàng)診斷模型，但目前的模型診斷準(zhǔn)確性會(huì)受肥胖、高黃疸等多種因素的影響，且其特異性和敏感性較低，所以應(yīng)用在臨床實(shí)踐中準(zhǔn)確性不高[3]。目前，越來(lái)越多的研究學(xué)者都在尋找敏感性、可靠性高的肝纖維化無(wú)創(chuàng)生物標(biāo)志物。

MicroRNA(miRNA)是一種長(zhǎng)約22個(gè)左右核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，通過(guò)調(diào)節(jié)RNA的轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后修飾等生物學(xué)過(guò)程來(lái)調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)[4]。miRNA不僅存在于各種組織和細(xì)胞中，還穩(wěn)定地存在于循環(huán)血液中。已有研究表明，miRNAs可以通過(guò)靶向與肝星狀細(xì)胞活化、免疫細(xì)胞反應(yīng)和肝細(xì)胞凋亡相關(guān)的分子過(guò)程中的底物結(jié)合來(lái)調(diào)控肝纖維化進(jìn)程[5-7]。在這篇綜述中，我們將分析miRNA在肝纖維化進(jìn)展中的作用，并為肝臟纖維化的診斷和分子靶向治療提供新的思路。

一、抑制肝纖維化進(jìn)展的miRNA

(一)miR-185 miR-185由人體22q11.21染色體上的基因編碼，它最初被描述為癌癥進(jìn)展的調(diào)節(jié)因子。大量研究顯示，miR-185與肝病關(guān)系密切。Li等[8]對(duì)149例患者(肝癌40例，肝硬化54例，慢性丙型肝炎患者55例)及45名健康對(duì)照者血清標(biāo)本進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示，肝癌患者血清miR-185水平明顯低于肝硬化患者，進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，miR-185具有良好的肝癌診斷價(jià)值。同樣，miR-185在HBV及相關(guān)肝癌的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。體外研究顯示，miR-185-5p能與肝細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子ELK1結(jié)合，顯著抑制HBV蛋白表達(dá)及HBV復(fù)制；在肝細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)ELK1能促進(jìn)HBV復(fù)制，且能逆轉(zhuǎn)miR-185-5p對(duì)HBV復(fù)制的抑制效應(yīng)[9]。

miR-185與纖維化的關(guān)系也得到了證實(shí)。Sun等[10]研究顯示，TGF-β1通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum,ER)促進(jìn)HK2細(xì)胞(人腎上皮細(xì)胞系)活化并表達(dá)ɑ-SMA，促進(jìn)腎纖維化的進(jìn)展；此機(jī)制是通過(guò)上調(diào)HK2細(xì)胞ATF6(activating transcription factor 6)實(shí)現(xiàn)的；miRNA-185可與ATF6結(jié)合，下調(diào)ATF6活性，抑制HK2細(xì)胞活化。同時(shí)，在單側(cè)尿道梗阻小鼠模型(unilateral urethral obstruction,UUO)，miR-185-5p能顯著抑制腎纖維化的進(jìn)展。Wang等[11]研究顯示，miR-451與星狀細(xì)胞XPO-1結(jié)合，上調(diào)miR-185活性，兩者均與EphB2(Erythropoietin-producing hepatocellular receptor B2)結(jié)合，下調(diào)EphB2表達(dá)，從而抑制星狀細(xì)胞活化。同樣，該機(jī)制在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型中得到驗(yàn)證。這些結(jié)果提示miR-185可能成為肝纖維化治療的新靶點(diǎn)。

(二)miR-29 新近研究顯示，miR-29在組織纖維化過(guò)程中發(fā)揮抑制作用。Huang等[12]探索了miR-29a在非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)中的作用。研究人員構(gòu)建了miR-29a轉(zhuǎn)基因小鼠并給予高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD小鼠模型。結(jié)果顯示，miR-29a轉(zhuǎn)基因小鼠(miR-29a+NAFLD)體質(zhì)量明顯低于NAFLD模型小鼠；miR-29a能減少NAFLD小鼠肝臟膠原纖維(collagen1ɑ1,Col1A1)沉積，降低肝組織IL-6、MCP-1、過(guò)氧化物酶體增生物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)等炎癥因子表達(dá)。進(jìn)一步細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，miR-29a通過(guò)抑制肝細(xì)胞CD36表達(dá)發(fā)揮抗肝纖維化作用。Xu等[13]深入探索了組氨酸脫甲基酶KDM4/miR-29與星狀細(xì)胞活化的關(guān)系。研究結(jié)果顯示，與靜息星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cells，HSCs)相比，活化的HSCs高表達(dá)Acta2，但其KDM4明顯低于靜息HSCs。研究團(tuán)隊(duì)還分離了小鼠原代HSCs，在原代HSCs活化過(guò)程中，KDM4水平逐漸降低。敲除KDM4能加速HSCs活化，同時(shí)miR-29水平明顯降低。進(jìn)一步研究顯示，KDM4與SREBP2結(jié)合促進(jìn)miR-29，從而抑制HSCs活化。

Wang等[14]深入研究了miR-29a在HSCs活化及肝纖維化進(jìn)程中的作用。研究者構(gòu)建了miR-29a轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)果顯示，與正常小鼠相比，miR-29a轉(zhuǎn)基因小鼠肝組織α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMΑ)明顯減弱。在膽道結(jié)扎小鼠模型(bile duct-ligation,BDL),過(guò)表達(dá)miR-29a后小鼠肝纖維化減弱，伴隨著肝組織BRD4(bromodomain-4 protein)表達(dá)下降。過(guò)表達(dá)miR-29a后，HSCs增殖和遷移能力明顯下降，同時(shí)BRD4和EZH2(Enhancer of Zeste Homolog 2)表達(dá)減弱。據(jù)此，miR-29a通過(guò)下調(diào)BRD4活性，發(fā)揮抗纖維化作用。miR-29a類(lèi)似物或可成為治療肝纖維化的新療法。

(三)miR-9 新近發(fā)現(xiàn)miR-9與纖維化關(guān)系密切。Han等[15]深入探索了miR-9在肺纖維化中的作用機(jī)制。研究人員發(fā)現(xiàn)，人體纖維化肺組織NEAT1表達(dá)高于正常組織，而miR-9水平低于正常肺組織，兩者呈負(fù)相關(guān)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，TGF-β1刺激下人肺腺癌細(xì)胞A549及人支氣管上皮細(xì)胞活化，高表達(dá)NEAT1、膠原纖維Ⅰ(Collagen Ⅰ)、膠原纖維Ⅲ(Collagen Ⅲ)和α-SMA，而miR-9水平明顯降低，敲除NEAT1或過(guò)表達(dá)miR-9均可逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)，提示NEAT1可與miR-9結(jié)合，抑制miR-9活性，促進(jìn)纖維化進(jìn)展。在博來(lái)霉素(bleomycin,BLM)誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型中，肺組織纖維化分級(jí)明顯高于正常小鼠，敲除小鼠NEAT1后，肺纖維化分級(jí)明顯降低，這說(shuō)明NEAT1/miR-9能在肺纖維化進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。

Tu等[16]探索了miR-9-3p在肝病發(fā)病機(jī)制中的作用。結(jié)果顯示，miR-9-3p在肝癌組織中的水平明顯低于正常肝組織，高表達(dá)miR-9-3p后，肝癌細(xì)胞遷移及侵襲能力明顯下降，說(shuō)明miR-9-3p在肝病中發(fā)揮重要作用。Fu等[17]深入探索了miR-9與肝纖維化的關(guān)系，結(jié)果表明，在人體肝組織中，隨著纖維化分級(jí)升高，多藥耐藥相關(guān)蛋白1(MRP1)表達(dá)增強(qiáng)，而miR-9水平降低。在星狀細(xì)胞活化過(guò)程中，可觀察到類(lèi)似趨勢(shì)。miR-9能明顯降低HSCs的增殖活性，減少細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)，抑制miR-9活性能逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng)。深入研究顯示，miR-9能與MRP1結(jié)合，抑制MRP1表達(dá)及Hedgehog信號(hào)通路活性，發(fā)揮抗纖維化效應(yīng)，這也在進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得以證實(shí)。Dong等[18]研究表明，miR-9-5p可通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β受體1(TGFBR1)和TGF-β受體2(TGFBR2)抑制TGF-β1途徑的HSC活化。以上研究均表明miRNA-9具有抗肝纖維化的潛力。

二、促進(jìn)肝纖維化的miRNA

(一)miR-942 miR-942是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與肝癌細(xì)胞相關(guān)的一種新的miRNA，Zhang等[19]研究顯示，抑制miR-942水平后，肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲及糖酵解能力明顯下降；circ_0001445(一種Circular RNA)能顯著抑制miR-942活性，從而延緩肝癌進(jìn)展。Liu等[20]研究顯示，活化HSCs高表達(dá)miR-942；且在HBV患者中，隨著纖維化分級(jí)的升高，miR-942水平增加，提示miR-942可以作為一種生物標(biāo)志物來(lái)評(píng)估肝纖維化的分級(jí)。

PPARγ在靜息的HSCs中表達(dá)豐富，抑制PPARγ的表達(dá)可以促進(jìn)HSCs的激活。PPARγ激動(dòng)劑能抑制HSC表達(dá)α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α smooth muscle actin，α-SMA)和膠原纖維COL1A2。Tao等[21]研究證實(shí)，PPARγ水平隨著肝纖維化分期的增加而降低，并且與慢性乙型肝炎患者肝組織纖維化分級(jí)和HSC中α-SMA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)PPARγ3′UTR是miR-942的作用靶點(diǎn)，miR-942的過(guò)表達(dá)可以抑制PPARγ，而敲除miR-942可促進(jìn)PPARγ的表達(dá)。所以，miR-942通過(guò)抑制PPARγ促進(jìn)HSC活化，可能成為未來(lái)肝纖維化的重要治療靶點(diǎn)。

(二)miR-212 TGF β/Smads 信號(hào)通路在肝纖維化中起著至關(guān)重要的作用。TGF-β1是重要的促纖維化細(xì)胞因子,它促進(jìn)靜息HSCs活化并分泌大量的ECM,這是肝纖維化的關(guān)鍵機(jī)制。TGF-β1家族成員通過(guò)連接細(xì)胞膜受體(I 型和 II型)來(lái)傳導(dǎo)信號(hào)通路。TGF-β1連接受體后激活下游SMAD2 和 SMAD3以及SMAD4,這是一個(gè)穩(wěn)定而復(fù)雜的磷酸化過(guò)程。SMAD7 是 TGF-β1信號(hào)通路抑制劑,可與活化型 I 受體結(jié)合,阻斷 SMAD2/3 的磷酸化，它也可以聯(lián)合泛素 E3 連接酶,使TGF β1受體 I泛素化和降解。在體內(nèi)，肝細(xì)胞特異 SMAD7 減少可激活TGF β并介導(dǎo)纖維化形成。

Zhu等[22]在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，miR-212可以通過(guò)活化 TGF β1信號(hào)通路來(lái)誘導(dǎo) HSC 的活化,上調(diào)α-SMA和collagen在HSC的表達(dá)。而且，miR-212 可以直接作用于SMAD7，抑制SMAD7 的 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)。這說(shuō)明miR-212可以通過(guò)SMAD7靶向調(diào)節(jié)TGF-β1信號(hào)通路促進(jìn)HSCs活化。因此，miR-212亦有望成為新的肝纖維化標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)。

(三)miR-200c miR-200系列，包括miR-200a、miR-200b、miR-200c等，其中miR-200a表達(dá)上調(diào)可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HSC活化和增殖，miR-200b的上調(diào)通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路刺激HSCs的增殖和遷移，然而，很少有報(bào)道提到miR-200c在HSC激活和肝纖維化中的作用。

為了探究miR-200c在人(HSC)肝星狀細(xì)胞活化和肝纖維化進(jìn)展中的作用，Ma等[23]開(kāi)展了相關(guān)研究，其實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，miR-200c高表達(dá)可以上調(diào)HSCα-平滑肌肌動(dòng)蛋白(SMA)、波形蛋白、I型膠原蛋白和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的表達(dá)，同時(shí)，miR-200c可能通過(guò)下調(diào)FOG2蛋白表達(dá)促進(jìn)PI3K/Akt信號(hào)活化，從而激活HSC，誘導(dǎo)肝纖維化形成。因此，miR-200c是 HSCs活性、增殖和遷移的重要促進(jìn)因素,在肝纖維化中具有非常重要的作用。miR-200c可能是HSC活化和肝纖維化進(jìn)展的潛在標(biāo)志物，甚至是治療肝纖維化的潛在靶點(diǎn)。

總之，肝纖維化的機(jī)制非常復(fù)雜，在外源性因素的刺激下，靜息HSC被激活，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，并分泌出ECM，最終導(dǎo)致肝纖維化。一些研究表明，肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展與眾多信號(hào)通路有關(guān)，包括MAPK信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、TGFβ/Smad等[24-25]。miRNA 是人體中一類(lèi)基因表達(dá)調(diào)控因子，它可以通過(guò)靶向調(diào)節(jié)肝纖維化相關(guān)信號(hào)通路調(diào)控肝星狀細(xì)胞活性，從而發(fā)揮促纖維化或抗纖維化作用。盡管目前證實(shí)miRNA在肝纖維化病理過(guò)程中作用機(jī)制的發(fā)揮了重要作用，但我們對(duì)miRNA的認(rèn)識(shí)仍非常有限，需要進(jìn)一步研究來(lái)明確其調(diào)控肝纖維化進(jìn)展的機(jī)制。更重要的是，隨著臨床研究的廣泛開(kāi)展，會(huì)發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的miRNA的肝纖維化診斷價(jià)值，其具有重要的臨床意義。