李紅鵬 閆雅茹 張柳 李詩琪 李慶云

上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科 上海交通大學醫(yī)學院呼吸病研究所200025

目前，全球新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情防控形勢仍相當嚴峻，其病原體嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCo V-2)為β屬冠狀病毒的Sarbecovirus亞屬，基因與蝙蝠來源的冠狀病毒bat-SL-Co VZC45和bat-SL-covzcx21有88%同源性，與嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-Co V)基因同源性約79%，但與中東呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERSCo V)同源性僅為50%[1-3]，邊緣有形似日冕的突起，呈圓形、橢圓形等多形性，直徑60～140 nm[4]。SARS-Co V-2具有較強的傳染性，尚無針對病毒的特效藥物，因此，早期準確的診斷與隔離是疫情管控的關鍵。目前實驗室病原學診斷主要包括呼吸道或者血液標本實時熒光RT-PCR的病毒核酸檢測、病毒基因測序，以及病毒抗體檢測。本文總結3種檢測方法特點和臨床意義，并介紹高通量微流控技術在COVID-19疫情防控中的應用，以期為優(yōu)化COVID-19實驗室診斷和疫情防控提供參考。

1 核酸與抗體檢測

1.1 核酸檢測 SARS-Co V-2核酸是病毒感染后能最早檢測到的標志物，對早診斷、早治療和疫情防控具有重大意義[5]。

1.1.1 RT-PCR核酸檢測 RT-PCR核酸檢測是診斷SARS-Co V和MERS-Co V重要的手段，具有較高的特異度和敏感度[6-7]，亦是此次診斷COVID-19最常用的實驗室檢測方法。實時熒光RT-PCR通過熒光染料或熒光探針實時監(jiān)測PCR擴增過程，與普通PCR相比，實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，且通過熒光信號檢測代替普通電泳，極大地提高了檢測敏感度和特異度[8]。SARS-Co V-2基因組包括開放讀碼框1a/b(open reading frame 1ab，ORF1ab)、核衣殼編碼基因(nucleocapsid protein，N)、刺突編碼基因(spike protein，S)、膜蛋白編碼基因(membrane protein，M)和包膜蛋白編碼基因(envelope protein，E)[9]。檢測試劑盒基于SARS-Co V-2基因組進行選擇性擴增，不同試劑盒的檢測原理基本一致，但因其引物、探針設計存在不同，有單靶區(qū)段(ORF1ab)、雙靶區(qū)段(ORF1ab、N或E)、三靶區(qū)段(ORF1ab、N和E)的檢測和判讀差別。比對分析研究發(fā)現(xiàn)，ORF1ab片段和N基因序列是高度保守基因區(qū)域[10]。Corman等[11]利用ORF1ab和E基因為靶標對來自不同中心的500余份臨床標本進行檢測，均未出現(xiàn)假陽性結果，僅4例標本起初測定為弱陽性，復測為陰性，顯示高度敏感性；研究亦發(fā)現(xiàn)ORF1ab片段和N基因與其他310份呼吸道病毒和細菌標本之間基本無交叉反應，提示檢測的高度特異性。因此，當前核酸檢測主要針對ORF1ab和N編碼序列，同一份標本中ORF1ab和N編碼序列同時陽性可即可確診，若單個靶標陽性，則需重新采樣檢測。判別陽性標準：Ct值＜37；陰性標準：無Ct值或Ct值＞40；可疑：Ct值37～40，建議重復實驗，若重做結果Ct值＜40，擴增曲線有明顯起峰，亦判斷為陽性，否則為陰性。

熒光RT-PCR技術檢測存在假陽性和假陰性問題[12]。假陽性緣于標本間交叉污染或實驗室擴增產(chǎn)物的遺留污染，在目前嚴格執(zhí)行“三個陰性樣本隨機放在臨床樣本中間同時參與檢測全過程”的質控策略下，可有效解決。但是，RT-PCR核酸檢測陰性不能完全排除病毒感染的可能性。在此次疫情救治過程中出現(xiàn)不少假陰性病例，即出現(xiàn)臨床表現(xiàn)和CT影像提示為COVID-19，病情也在不斷發(fā)展，但核酸檢測結果為陰性，后續(xù)檢測又為陽性。假陰性原因主要涉及樣本采集的部位、時機、方法以及體外診斷試劑盒等因素。

采集的部位與方法對檢測結果存在影響。上呼吸道是病毒樣本采集最常用的部位，包括鼻咽拭子、口咽拭子和鼻咽灌洗。Lieberman等[13]比較3種方法在診斷呼吸道流感病毒、冠狀病毒和鼻病毒監(jiān)測中的敏感度，發(fā)現(xiàn)鼻咽拭子取材檢測敏感度高于口咽拭子，鼻咽灌洗取材敏感度最高；劉焱斌等[14]在對100例COVID-19患者研究中發(fā)現(xiàn)鼻拭子比口咽拭子有更高的檢測陽性率；delaTabla等[15]研究提示鼻咽-口咽拭子聯(lián)合取材對甲型流感的檢測準確性優(yōu)于鼻咽灌洗取材，可提高PCR核酸檢測的陽性率。痰液和其他下呼吸道分泌物可能具有更高的病毒載荷，病例報道研究顯示3%高滲鹽霧化誘導排痰成功診斷咽拭子、鼻拭子多次采樣檢測陰性患者[16]；組織活檢和尸體解剖結果均顯示患者的SARS-Co V-2主要感染部位在人體下呼吸道及肺部[17-18]。

采集時機對PCR核酸陽性檢出率有影響。Thevarajan等[19]報道1例普通型COVID-19患者出現(xiàn)癥狀后4d鼻咽拭子PCR檢測病毒陽性，而發(fā)病后7dPCR病毒檢測為陰性；Young等[20]研究顯示在病情發(fā)展過程中存在鼻咽拭子PCR核酸檢測陽性和陰性交替現(xiàn)象，可能原因為SARSCo V-2感染上氣道細胞后，在機體免疫的作用下取材部位病毒載荷存在波動；Pan等[21]報道，患者在出現(xiàn)癥狀后約4～6d，咽拭子和痰液樣本中的病毒載量達到峰值，后3～4d持續(xù)轉陰，而部分患者痰液樣本中病毒載量3～5d達到峰值，之后出現(xiàn)病毒載量明顯波動，檢測陽性與陰性交替現(xiàn)象，亦提示間歇排毒現(xiàn)象和病毒載量在不同采樣時機的個體差異。

因此，當核酸檢測陰性，但臨床高度懷疑為感染患者時，應通過多次與多部位采樣以降低假陰性率[22]，此外，因疫情需要，已有大量核酸檢測試劑盒投入市場，但質量參差不齊，對于懷疑假陰性的患者可合并采用2種及以上不同廠家的試劑進行檢測和驗證，以提高診斷準確性。同時樣本的采集、保存、運輸、處理過程需嚴格遵守我國《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南》。最后，對于PCR多次檢測陰性的高度疑似患者亦可進行病毒基因測序和病毒抗體檢測，以提高檢測的陽性率。

1.1.2 病毒基因測序 基于二代測序技術的病原體宏基因組測序是目前臨床上最常用的測序方法，通過對臨床樣本中直接提取的DNA和/或RNA進行高通量測序，再經(jīng)過數(shù)據(jù)庫比對與生物信息學分析，可一次性完成細菌、真菌、病毒和寄生蟲等多種病原體檢測，并提供進一步病毒演變分析數(shù)據(jù)支持，能夠鑒別包括SARS-Co V-2在內的冠狀病毒和其他呼吸道病原體感染，實現(xiàn)病毒序列快速檢測[23-24]。本次COVID-19疫情爆發(fā)之初，我國研究團隊通過二代測序技術迅速對SARS-Co V-2基因組進行鑒定分析，為疾病的診斷與疫情防控贏得寶貴時間[25]。測序技術亦可用于包括SARS-Co V-2在內的多種呼吸道病毒的鑒別診斷和檢測病毒突變[26-27]。與熒光RT-PCR檢測技術比較，二代測序技術檢測操作復雜，檢測周期長，模型構建數(shù)據(jù)分析難度大及經(jīng)濟成本較高等問題限制了其在疫情防控中的廣泛使用[28-29]；但二代測序策略在追蹤傳染源和了解傳染源的演變，調查疫情的傳播和傳播鏈，促進有效和快速的分子診斷技術的研發(fā)，尋找有效治療手段和疫苗開發(fā)中具有獨特優(yōu)勢[30]；此外，對于RT-PCR核酸檢測假陰性患者，利用測序技術可進一步確認，以有效提高檢測結果的可靠性，并獲得是否有其他病原體感染的信息，有助于鑒別診斷[23]。

1.2 抗體檢測 據(jù)以往有關SARS-Co V的研究報道，患者血清Ig M抗體在感染急性期出現(xiàn)(感染后7d左右)，IgG抗體在感染中晚期出現(xiàn)，滴度有一個持續(xù)增高的過程，在血液循環(huán)中保持較長時間[31-32]。對SARS-Co V-2研究顯示，COVID-19患者發(fā)病第8天Ig M陽性率達100%，IgG出現(xiàn)相對較晚，發(fā)病兩周之后陽性率達88.4%[33]?？贵w檢測能簡單、快速、安全地實現(xiàn)對COVID-19患者血清、血漿和全血中的Ig M和IgG體外檢測。

SARS-Co V-2抗體檢測方法主要包括膠體金免疫層析和ELISA方法。(1)膠體金免疫層析技術肉眼可直接觀察到檢測結果，相比較現(xiàn)有的核酸檢測平臺，對技術和人員要求均較低，加樣后15min即可觀察到結果，實現(xiàn)對疑似患者進行現(xiàn)場檢測與篩查，尤其適合于現(xiàn)場快速檢測，但特異度、敏感度相對于核酸檢測較弱[34-35]。(2)ELISA抗體檢測適用于對疑似患者或者密切接觸人群進行快速批量檢測，以及抗體滴度測定。但此方法檢測速度慢，步驟繁瑣，限制了其在COVID-19爆發(fā)流行時的應用。

SARS-Co V-2抗體檢測可與核酸檢測實現(xiàn)互補。徐萬洲等[36]對205例COVID-19確診患者和79例非COVID-19人群進行血清SARS-Co V-2抗體檢測的研究發(fā)現(xiàn)，血清Ig M和IgG對COVID-19診斷的敏感度分別為70.24%(144/205)和96.10%(197/205)，臨床特異度分別為96.20%(76/79)和92.41%(73/79)；與核酸檢測相比，抗體檢測具有較低的陽性預測值(95.63%比100%)，但具有較高的陰性預測值(91.03%比80.61%)；研究亦發(fā)現(xiàn)抗體檢測能將94.74%(18/19)的核酸假陰性的COVID-19患者確診。因此，對于核酸檢測假陰性的患者，病毒核酸檢測聯(lián)合血清抗體檢測有助于提高檢測的準確性。

SARS-Co V-2抗體檢測在疫情防控中具有重要意義。IgG出現(xiàn)較晚，但可在康復患者中持續(xù)存在，因此可用以回顧性分析特定人群的COVID-19的流行病學情況。IgG亦是病毒重要的特異性保護性抗體，其滴度高低與康復患者抗病毒能力相關，高滴度人群可從事病毒防疫工作或者貢獻康復期血漿[37]。同時需注意，抗體檢測易受血液標本中一些干擾物質(如類風濕因子、非特異Ig M、溶血所致的高濃度血紅蛋白等)的影響而出現(xiàn)假陽性結果。此外，在抗體產(chǎn)生的窗口期可出現(xiàn)假陰性的結果。

2 新技術在病毒核酸檢測中的應用

近年來，各種新技術用于病毒核酸檢測，如巢式PCR、納米孔測序、基因芯片技術、恒溫逆轉錄、熒光納米探針等，提高檢測效率，簡化檢測步驟。微流控技術被稱為芯片上實驗室，是將包括上述檢測技術在內的多種技術靈活組合和規(guī)模集成在微小而可控的平臺上，最大限度把實驗室的功能轉移到便攜的、方寸大小芯片上，具有高通量、即時性、集成化、自動化、低成本便于攜帶的特點，1h內即可完成現(xiàn)場檢測[38]。有助于在疫情爆發(fā)期進行批量、快速和現(xiàn)場檢測，促進SARS-Co V-2感染患者的快速篩選、確診和分流，避免集中檢測造成的醫(yī)療資源嚴重透支。

微流控檢測技術有望實現(xiàn)SARS-Co V-2核酸快速擴增檢測和病毒的鑒別診斷。將核酸快速提取、恒溫逆轉錄擴增、便攜式實時熒光檢測和比色檢測3個關鍵技術，整合于微流控芯片系統(tǒng)，一套系統(tǒng)可實現(xiàn)多人份樣本平行檢測(近3000人份/d)，極大提高檢測效率[39]。呼吸道病原體超20種，傳統(tǒng)的PCR技術僅能對樣本病原體進行逐一擴增，微流控芯片內部集成的高通量恒溫核酸擴增模塊分析系統(tǒng)具有大規(guī)模并行式微反應元件，可一次對同一樣本進行多病毒檢測[40]。目前，相應的微流控檢測統(tǒng)已成功研發(fā)，能夠在1h內鑒定出多種病原體，包括季節(jié)性流感病毒、禽流感、合胞病毒、SARS-Co V、MERS-Co V和SARSCo V-2，但其檢測的準確性和穩(wěn)定性仍需進一步評估。

空氣傳播是COVID-19最主要的傳播途徑，對空氣病毒載荷檢測有助于疫情防控。目前傳統(tǒng)的空氣微生物檢測技術(落板培養(yǎng)法和安德森采樣器法)敏感度較低且花費時間長，無法滿足實時快速的應急處置需求。Jiang等[41]和Jing等[42]利用微流控技術將空氣中病原體的捕獲、富集、檢測、鑒定整合在同一檢測系統(tǒng)，實現(xiàn)3h內對公共場所空氣中多種病原體的檢測。顯然基于同樣原理，包括COVID-19在內呼吸道多種病毒的高通量、全自動實時監(jiān)測的分析系統(tǒng)的研發(fā)將有助于重點公共區(qū)域空氣衛(wèi)生防疫工作的有效實施。

3 小結與展望

SARS-Co V-2作為一種新型高傳染性病毒，實驗室檢測能力能否滿足疫情需求成為極大的挑戰(zhàn)，病毒核酸檢測廣泛應用，操作相對復雜，需在P2級實驗室進行；抗體檢測操作簡單易于推廣，可與核酸檢測實現(xiàn)互補，提高診斷陽性率，但不利于早期診斷。高通量、高自動化、高集成的技術開發(fā)和應用對此次和未來疫情防控意義重大。相對于傳統(tǒng)檢測技術，將SARS-Co V-2核酸檢測方法與微流控技術結合，有望實現(xiàn)病毒的快速高通量診斷與鑒別診斷，值得推廣。

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