溶血磷脂促進(jìn)奧沙利鉑誘發(fā)的急性周?chē)蕴弁?/h1>
2021-11-30 21:31RimolaV,HahnefeldL,ZhaoJL
中國(guó)疼痛醫(yī)學(xué)雜志 2021年2期
該研究的重要性聲明：一線細(xì)胞抑制劑奧沙利鉑可引起急性周?chē)蕴弁春吐陨窠?jīng)病理性疼痛。前者與慢性神經(jīng)病理性疼痛有因果關(guān)系，但對(duì)其機(jī)制了解甚少。對(duì)奧沙利鉑注射24 h 后，神經(jīng)組織中的細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子和約200 種脂質(zhì)進(jìn)行了無(wú)差別的廣泛分析，揭示了LPC 18:1、LPC 16:0 和9,10-EpOME 在奧沙利鉑引起的急性疼痛中的關(guān)鍵作用。本研究首次證明LPC 18:1 有助于激活感覺(jué)神經(jīng)元中離子通道TRPV1 和TRPM8，并在體外周注射后引起機(jī)械性超敏反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)表明，LPC 介導(dǎo)的脂質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)與奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性周?chē)蕴弁从嘘P(guān)。
1.背景介紹
化療后多發(fā)神經(jīng)病變 (CIPN) 是細(xì)胞抑制藥物高劑量所引發(fā)的不良反應(yīng)。奧沙利鉑是廣泛用于結(jié)直腸癌的一線治療藥物，可引起兩種不同類型的疼痛綜合征，即急性周?chē)蕴弁春吐陨窠?jīng)病理性疼痛。Argyriou 等開(kāi)展的一項(xiàng)大型臨床試驗(yàn)表明，高達(dá)89%的病人在奧沙利鉑治療后出現(xiàn)急性周?chē)蕴弁矗?0%患有周?chē)蕴弁吹牟∪嗽趭W沙利鉑治療后引發(fā)嚴(yán)重慢性神經(jīng)性病變的風(fēng)險(xiǎn)更高。
導(dǎo)致CIPN 產(chǎn)生的潛在分子機(jī)制仍知之甚少。Anand 等發(fā)現(xiàn)已知的配體門(mén)控離子通道：瞬時(shí)受體電位(TRP) 通道可能會(huì)促進(jìn)奧沙利鉑誘發(fā)的神經(jīng)性疼痛。TRP 通道可以被辣椒素 (TRPV1)、異硫氰酸烯丙酯(TRPA1) 和薄荷醇 (TRPM8)等化學(xué)物質(zhì)激活。Hohmann 等研究也證明，在病理生理?xiàng)l件下，由細(xì)胞因子、趨化因子和促炎性神經(jīng)肽以及內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì)等炎性介質(zhì)引起的TRP 通道敏化和激活可能導(dǎo)致神經(jīng)源性炎癥和外周感覺(jué)神經(jīng)元活性增加，并且可能誘發(fā)CIPN 出現(xiàn)機(jī)械性超敏反應(yīng)。有趣的是，之前研究已經(jīng)證明了幾類信號(hào)脂質(zhì)，如類二十烷酸、亞油酸代謝產(chǎn)物和鞘脂等可促進(jìn)疼痛超敏反應(yīng)。
在本研究中，本文作者假設(shè)奧沙利鉑治療后早期發(fā)生神經(jīng)元可塑性和感覺(jué)神經(jīng)元活性變化。而這些神經(jīng)元活動(dòng)的改變可能會(huì)導(dǎo)致奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性周?chē)蕴弁匆饳C(jī)械性超敏反應(yīng)，并有可能增加周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)后來(lái)發(fā)生慢性神經(jīng)性病變的幾率和嚴(yán)重性。
2. 結(jié)果
（1）奧沙利鉑誘發(fā)的急性疼痛后的機(jī)械閾值、細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子：為了研究奧沙利鉑的急性作用，本文作者在經(jīng)典的痛覺(jué)模型（3 mg/kg 腹腔注射）中通過(guò)動(dòng)態(tài)足底測(cè)試評(píng)估了分別用對(duì)照劑和奧沙利鉑處理的雄性和雌性小鼠的機(jī)械閾值。在腹腔注射奧沙利鉑和對(duì)照劑后2、4、6、24、26、48 和72 h 測(cè)定小鼠縮足反射潛伏期。與對(duì)照組小鼠相比，注射奧沙利鉑24 h 后雌雄小鼠發(fā)生機(jī)械痛敏反應(yīng)，可以維持至72 h。在機(jī)械痛閾值方面，不同性別小鼠間并未觀察到任何差異。同樣，奧沙利鉑注射后24 h 和72 h 之間也無(wú)差異。使用冷板實(shí)驗(yàn)和丙酮實(shí)驗(yàn)，研究了急性?shī)W沙利鉑治療后對(duì)于冷痛感的影響，但治療后未檢測(cè)到任何冷超敏性反應(yīng)。
（2）脂質(zhì)與奧沙利鉑引起的急性疼痛有關(guān)：趨化因子、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的篩選結(jié)果顯示，奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性周?chē)蕴弁磁c經(jīng)典的炎性疼痛在機(jī)理上有所不同。Piomelli 等研究證實(shí)內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì)會(huì)引起疼痛超敏反應(yīng)，為了可以同時(shí)檢測(cè)數(shù)百種不同的脂質(zhì)，接下來(lái)對(duì)注射奧沙利鉑和對(duì)照劑24 h 后小鼠DRG、坐骨神經(jīng)和脊髓進(jìn)行了廣泛無(wú)差別的LC-QTOFMS 篩選。分析表明，在注射奧沙利鉑的小鼠DRG 中，游離脂肪酸增加。接下來(lái)用LC-MS/MS 檢測(cè)了由多不飽和游離脂肪酸(20:4)合成的前列腺素的濃度。此外，已知這些脂質(zhì)會(huì)在炎癥過(guò)程中增加，并可能導(dǎo)致疼痛超敏反應(yīng)。與細(xì)胞因子和趨化因子類似，注射奧沙利鉑后前列腺素類沒(méi)有增加。相反，驚奇地觀察到在注射奧沙利鉑的雄性小鼠DRG 中前列腺素PGE2、PGD2 和血栓烷B2b (TXB2) 顯著降低。雌性小鼠在注射奧沙利鉑后24 h 后，前列腺素PGE2 和PGD2 均顯著降低，但TXB2 的濃度無(wú)顯著變化。
本研究觀察到在注射奧沙利鉑24 h 后，DRG中的游離脂肪酸亞油酸(18:2)含量大大增加。因此通過(guò)LC-MS/MS 檢測(cè)了雌雄小鼠注射奧沙利鉑24 h 后DRG 中的氧化亞油酸代謝物(OLAMs)的濃度。發(fā)現(xiàn)9,10-EpOME 均顯著增加，而其代謝物9,10-DiHOME 均顯著降低。
由于注射奧沙利鉑24 h 后脂質(zhì)濃度產(chǎn)生差異，接下來(lái)研究了注射奧沙利鉑小鼠DRG 中相關(guān)脂質(zhì)氧化酶 (COX-2，LOX，CYPs) mRNA 的表達(dá)。但是，在注射奧沙利鉑后未觀察到脂質(zhì)氧化酶表達(dá)發(fā)生差異。同樣，分析了可溶性環(huán)氧化物水解酶2 (sEH) 的mRNA 表達(dá)水平，該酶可以將環(huán)氧化物降解為二醇。mRNA 表達(dá)分析顯示，在注射奧沙利鉑的小鼠DRG中，sEH 轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)無(wú)差異。與LC-QTOFMS 檢測(cè)結(jié)果一致，這些結(jié)果表明注射奧沙利鉑后的小鼠DRG 中9,10-EpOME 濃度升高的原因可能是底物亞油酸的豐度和可用性增加，而不是脂質(zhì)加氧酶的表達(dá)和活性增加。
（3）溶血磷脂酰膽堿和游離脂肪酸代謝產(chǎn)物與奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性疼痛有關(guān)：溶血磷脂酰膽堿 (LPCs)的亞組是在溶血磷脂家族中檢測(cè)到最豐富的脂質(zhì)。本文作者分析了LPC 亞組的19 種不同脂質(zhì)。結(jié)果顯示在注射奧沙利鉑后坐骨神經(jīng)和DRG中的LPC 18:1 顯著增加。在脊髓中，LPC 16:0 顯著增加。
此外，檢測(cè)了注射奧沙利鉑24 h 后DRG 中可以從復(fù)雜脂質(zhì)中釋放的LPC (iPLA2) 或游離脂肪酸(cPLA2) 的磷脂酶的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)兩種磷脂酶在注射奧沙利鉑24 h 后在DRG 中表達(dá)均增加。該結(jié)果與LC-QTOFMS 以及LC-MS/MS 的檢測(cè)結(jié)果一致，在注射奧沙利鉑24 h 后，脂質(zhì)家族游離脂肪酸和溶血磷脂酰膽堿的水平增加，并且9,10-EpOME濃度升高。另外，9,10-EpOME 濃度的升高驗(yàn)證了脂質(zhì)釋放酶mRNA 表達(dá)水平的升高增強(qiáng)了亞油酸釋放量和豐度增加的假設(shè)。
（4）LPC 16:0 和LPC 18:1 導(dǎo)致初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元的鈣瞬變：由于注射奧沙利鉑后坐骨神經(jīng)和DRGs 中的LPC 18:1 和脊髓中LPC 16:0 顯著增加，表明9,10-EpOME 對(duì)TRPV1 有敏化作用，使用Ca2+成像來(lái)分析LPC 16:0 和LPC 18:1 在感覺(jué)神經(jīng)元中的作用。用LPC 16:0 和LPC 18:1 短時(shí) (45 s) 刺激感覺(jué)神經(jīng)元，與對(duì)照組相比，可以觀察到所有測(cè)試濃度發(fā)生鈣瞬變圖。只有10 μM 的LPC 16:0 刺激能夠顯著增加響應(yīng)的感覺(jué)神經(jīng)元的數(shù)量。重復(fù)使用LPC 18:1 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)到大約6%的感覺(jué)神經(jīng)元在5 μM LPC 18:1 刺激后產(chǎn)生響應(yīng)。即使用1 μM和10 μM LPC 18:1 刺激后，感覺(jué)神經(jīng)元也顯示出反應(yīng)。但在這些測(cè)試濃度下與對(duì)照組相比無(wú)差異。以上結(jié)果顯示，LPC 16:0 和LPC 18:1 都可能引起感覺(jué)神經(jīng)元的瞬時(shí)Ca2+內(nèi)流。
接下來(lái)，本文作者開(kāi)始確定對(duì)LPC 18:1 產(chǎn)生反應(yīng)的感覺(jué)神經(jīng)元亞群。用5 μM LPC 18:1 短時(shí)間 (45 s) 刺激神經(jīng)元后，用TRPA1 激動(dòng)劑AITC（異硫氰酸烯丙酯，100 μM; 40 s）和TRPV1 激動(dòng)劑辣椒素 (100 nM; 20 s) 共同刺激神經(jīng)元。如先前所示，在5 μM LPC 18:1 刺激后，對(duì)50 mM KCl 產(chǎn)生反應(yīng)的所有神經(jīng)元中，約7%出現(xiàn)瞬時(shí)Ca2+內(nèi)流。另外，共同刺激結(jié)果顯示在LPC 18:1 上發(fā)生反應(yīng)的神經(jīng)元也對(duì)選擇性TRPV1 激動(dòng)劑辣椒素產(chǎn)生明顯反應(yīng)。接下來(lái)用30 μM LPC 18:1 刺激轉(zhuǎn)染TRP 通道的HEK293 細(xì)胞60 s，與對(duì)照組相比，可以觀察到TRPV1 和TRPM8 陽(yáng)性轉(zhuǎn)染的HEK293 細(xì)胞中瞬時(shí)Ca2+內(nèi)流顯著升高。在TRPA1 通道陽(yáng)性轉(zhuǎn)染的HEK293 細(xì)胞中，與對(duì)照組和LPC 18:1 相比，Ca2+內(nèi)流未發(fā)生顯著變化。相反，與LPC 18:1 相比，對(duì)照組引起顯著的Ca2+內(nèi)流。TRP 通道陽(yáng)性轉(zhuǎn)染的HEK293 細(xì)胞由特異性TRP 通道激動(dòng)劑反應(yīng)檢測(cè)。用TRP 通道轉(zhuǎn)染的HEK293 細(xì)胞進(jìn)行體外Ca2+成像分析證實(shí)了先前在原代感覺(jué)神經(jīng)元中的檢測(cè)結(jié)果，LPC 18:1 可以作為T(mén)RPV1 通道激活劑。另外，可以將TRPM8 通道作為可以由LPC 18:1 激活的第二個(gè)TRP 通道。
（5）LPC 18:1 在感覺(jué)神經(jīng)元中引起TRPV1 和TRPM8 依賴性鈣瞬變：為了進(jìn)一步確定LPC18:1的作用，本文作者將感覺(jué)神經(jīng)元與TRPA1 (HC 030031) 和TRPV1 (AMG 9810) 以及TRPM8 (AMTB鹽酸鹽) 的選擇性抑制劑一起孵育。研究發(fā)現(xiàn)用TRPA1 抑制劑孵育感覺(jué)神經(jīng)元時(shí)，用LPC 18:1 對(duì)Ca2+內(nèi)流沒(méi)有影響。但孵育TRPV1 和TRPM8 的抑制劑后由LPC 介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流顯著減少。以上結(jié)果顯示LPC 18:1 在通過(guò)激活TRPV1-和TRPM8 陽(yáng)性神經(jīng)元的傷害性傳遞中起著重要作用。
為了驗(yàn)證LPC 18:1 是否可以有效激活TRPV1和TRPM8 通道，接下來(lái)，分別用特異性抑制劑分別抑制TRPV1 和TRPM8。首先用LPC 18:1 刺激感覺(jué)神經(jīng)元。然后，再次刺激前使用TRPV1 和TRPM8 抑制劑孵育神經(jīng)元。抑制TRPV1 或TRPM8可以部分阻斷由LPC 18:1 引起的Ca2+內(nèi)流。使用TRPV1 和 TRPM8 抑制劑后，可以響應(yīng)LPC 18:1 的神經(jīng)元數(shù)量降低約50%。這再次表明，LPC 18:1 可能會(huì)激活表達(dá)TRPV1 和TRPM8 神經(jīng)元亞群。為了檢測(cè)TRPV1 和TRPM8 是否受LPC 18:1 影響，接下來(lái)使用了兩種抑制劑的組合。抑制TRPV1 和TRPM8 后，由LPC 18:1 介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流可以被完全阻斷。此外，檢測(cè)了TRPV1 和TRPM8 缺陷型小鼠中LPC 誘導(dǎo)的鈣反應(yīng)。在TRPV1 缺陷型小鼠中，觀察到對(duì)LPC 18:1反應(yīng)的神經(jīng)元數(shù)量顯著減少。在TRPM8 缺陷型小鼠中，發(fā)現(xiàn)了對(duì)LPC 18:1 反應(yīng)的神經(jīng)元數(shù)量也有減少的趨勢(shì)。
（6）LPC 18:1 在體內(nèi)引起機(jī)械性超敏反應(yīng)：為了探究LPC 18:1 在體內(nèi)是否有效，在野生型小鼠的左后足皮下分別注射了10 μM 和50 μM 的LPC 18:1和對(duì)照劑，并檢測(cè)了注射后0.5、1、2、3、4 和6 h小鼠的縮足反射潛伏期。檢測(cè)機(jī)械閾值后發(fā)現(xiàn)小鼠注射LPC 18:1 后0.5 h 出現(xiàn)機(jī)械超敏反應(yīng)，并可以持續(xù)2 h。
3. 討論
本研究觀察到注射奧沙利鉑后神經(jīng)組織中各種脂質(zhì)的合成發(fā)生了顯著變化。LC-MS/MS 檢測(cè)結(jié)果顯示DRG 中前列腺素濃度顯著降低，而9,10-EpOME濃度升高。后者已被Sisignano 等證明可以引發(fā)感覺(jué)神經(jīng)元的TRPV1 通道敏化并在體內(nèi)引起機(jī)械和熱超敏反應(yīng)。此外，非靶向性脂質(zhì)組學(xué)分析顯示在注射奧沙利鉑小鼠的DRGs 和坐骨神經(jīng)中，溶血磷脂酰膽堿信號(hào)增強(qiáng)，特別是LPC 18:1。通過(guò)對(duì)LPC 18:1 的研究，觀察到在TRPV1 和TRPM8 陽(yáng)性感覺(jué)神經(jīng)元中，脂質(zhì)可以引起Ca2+的瞬變。
在本研究中未觀察到脊髓背角趨化因子、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子水平以及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化程度的變化，這表明經(jīng)典的炎癥過(guò)程和相關(guān)介質(zhì)似乎對(duì)奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性疼痛影響不大。用qPCR 分析檢測(cè)到注射奧沙利鉑的小鼠DRG 中ROS 產(chǎn)生酶的mRNA 表達(dá)未發(fā)生顯著增加。Doyle 等研究中發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞激活以及促炎性細(xì)胞因子和ROS 水平升高可能會(huì)促進(jìn)CINP。但主要研究了CIPN 的后續(xù)時(shí)間點(diǎn)（注射后的幾天或幾周）。本研究結(jié)果表明，經(jīng)典炎癥通路和相關(guān)介質(zhì)在奧沙利鉑誘發(fā)的疼痛中的作用不像在其他慢性疼痛中那么重要，因此可能是在奧沙利鉑誘發(fā)神經(jīng)性病變后期開(kāi)始的繼發(fā)性反應(yīng)。此外，盡管可以觀察到雌雄小鼠之間脂質(zhì)濃度的差異，但奧沙利鉑誘發(fā)的機(jī)械性超敏反應(yīng)的程度在雌雄小鼠中相似，表明這些濃度差異對(duì)不同性別的奧沙利鉑誘發(fā)的機(jī)械性超敏反應(yīng)沒(méi)有直接影響。
非靶向性脂質(zhì)組學(xué)檢測(cè)顯示注射奧沙利鉑后的小鼠坐骨神經(jīng)和DRG 中的LPC 18:1 以及脊髓中的LPC 16:0 顯著升高。據(jù)Abeele 等的研究報(bào)道，不同的LPC 種類可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)染后的HEK-293 細(xì)胞中TRPM8 通道的開(kāi)放概率。Andersson 等在TRPM8轉(zhuǎn)染的CHO 細(xì)胞中用LPC 16:0 處理后觀察到相同的效果。本研究的結(jié)果與這兩項(xiàng)研究一致，但在此基礎(chǔ)增加了重要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即LPC 18:1 和LPC 16:0對(duì)DRG 神經(jīng)元的TRPM8 和TRPV1 通道均起作用。而Nieto-Posadas 和Canul-Sánchez 等與本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反，通過(guò)內(nèi)面向外式膜片鉗和單通道電流無(wú)法檢測(cè)到由LPC 引起的HEK-293 細(xì)胞中的TRPV1激活，這表明在異源表達(dá)系統(tǒng)中觀察到的鈣瞬變是由LPC 18:1 間接激活TRPV1 引起的。
在體數(shù)據(jù)顯示LPC 18:1 可引起機(jī)械性超敏反應(yīng)。因此，坐骨神經(jīng)和DRGs 中LPC 18:1 水平升高可能直接導(dǎo)致奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性周?chē)蕴弁?。并且發(fā)現(xiàn)在注射奧沙利鉑24 h 后的小鼠DRG 中亞油酸衍生的代謝物9,10-EpOME 顯著增加。Sisignano等的研究表明，由CYP2J6 合成的9,10-EpOME 不僅對(duì)TRPV1 通道具有直接的致敏作用，而且還可以在體內(nèi)引起機(jī)械性超敏反應(yīng)和熱痛。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LPC 和游離脂肪酸水平顯著增加，同樣本文作者也證明了cPLA2-和iPLA2-途徑在奧沙利鉑治療動(dòng)物的DRGs 中可能被激活。Dennis 等證明磷脂酶可以從膜磷脂中釋放游離脂肪酸 (cPLA2) 和溶血磷脂 (iPLA2)。一項(xiàng)針對(duì)于iPLA2 途徑的研究顯示，由冷和TRPM8 激動(dòng)劑icilin 激活的TRPM8 可被選擇性iPLA2 抑制劑溴烯醇內(nèi)酯 (BEL) 所阻斷。而用BEL處理的在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明由LPC 16:0 引起的冷痛敏不能被iPLA2 的抑制劑所阻斷。并且iPLA2 參與了前列腺素的生產(chǎn)過(guò)程，通過(guò)BEL 抑制iPLA2可以導(dǎo)致前列腺素濃度降低。本研究表明了靶向iPLA2 途徑并通過(guò)抑制CYP2J6 減少9,10-EpOME合成可減輕奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性疼痛。但目前尚沒(méi)有可以用作臨床候選藥物的選擇性iPLA2 拮抗劑，需要進(jìn)行更多研究來(lái)探索iPLA2 的潛在生理作用，這可能給治療的病人帶來(lái)不良反應(yīng)。
除脂質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)途徑外，本研究結(jié)果表明靶向TRP 通道可能有利于阻斷奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性周?chē)蕴弁?。Chukyo 等研究表明，在奧沙利鉑治療后，DRG 中TRPM8 和TRPV1 轉(zhuǎn)錄本在后續(xù)時(shí)間點(diǎn)增加，并可能導(dǎo)致冷痛敏。此外，Wong＆Gavva 等報(bào)道稱辣椒堿通過(guò)抑制TRPV1-和TRPM8 通道降低奧沙利鉑誘導(dǎo)的體內(nèi)冷性異常性疼痛，而不僅僅是5′-碘樹(shù)脂毒素抑制TRPV1-通道。但目前尚無(wú)可用于臨床的TRP 通道拮抗劑。先前的TRPV1 拮抗劑早期臨床試驗(yàn)由于導(dǎo)致病人體溫過(guò)高而失敗，這表明TRPV1 在維持體溫方面起著重要作用，并阻礙了安全的TRPV1 拮抗劑的臨床開(kāi)發(fā)。
綜上所述，本研究突出了奧沙利鉑治療后神經(jīng)元脂質(zhì)合成和代謝早期變化的重要性，并確定了LPC-EpOME-TRPV1-TRPM8 信號(hào)通路脂質(zhì)在奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性疼痛中的關(guān)鍵作用。
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該研究的重要性聲明：一線細(xì)胞抑制劑奧沙利鉑可引起急性周?chē)蕴弁春吐陨窠?jīng)病理性疼痛。前者與慢性神經(jīng)病理性疼痛有因果關(guān)系，但對(duì)其機(jī)制了解甚少。對(duì)奧沙利鉑注射24 h 后，神經(jīng)組織中的細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子和約200 種脂質(zhì)進(jìn)行了無(wú)差別的廣泛分析，揭示了LPC 18:1、LPC 16:0 和9,10-EpOME 在奧沙利鉑引起的急性疼痛中的關(guān)鍵作用。本研究首次證明LPC 18:1 有助于激活感覺(jué)神經(jīng)元中離子通道TRPV1 和TRPM8，并在體外周注射后引起機(jī)械性超敏反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)表明，LPC 介導(dǎo)的脂質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)與奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性周?chē)蕴弁从嘘P(guān)。
1.背景介紹
化療后多發(fā)神經(jīng)病變 (CIPN) 是細(xì)胞抑制藥物高劑量所引發(fā)的不良反應(yīng)。奧沙利鉑是廣泛用于結(jié)直腸癌的一線治療藥物，可引起兩種不同類型的疼痛綜合征，即急性周?chē)蕴弁春吐陨窠?jīng)病理性疼痛。Argyriou 等開(kāi)展的一項(xiàng)大型臨床試驗(yàn)表明，高達(dá)89%的病人在奧沙利鉑治療后出現(xiàn)急性周?chē)蕴弁矗?0%患有周?chē)蕴弁吹牟∪嗽趭W沙利鉑治療后引發(fā)嚴(yán)重慢性神經(jīng)性病變的風(fēng)險(xiǎn)更高。
導(dǎo)致CIPN 產(chǎn)生的潛在分子機(jī)制仍知之甚少。Anand 等發(fā)現(xiàn)已知的配體門(mén)控離子通道：瞬時(shí)受體電位(TRP) 通道可能會(huì)促進(jìn)奧沙利鉑誘發(fā)的神經(jīng)性疼痛。TRP 通道可以被辣椒素 (TRPV1)、異硫氰酸烯丙酯(TRPA1) 和薄荷醇 (TRPM8)等化學(xué)物質(zhì)激活。Hohmann 等研究也證明，在病理生理?xiàng)l件下，由細(xì)胞因子、趨化因子和促炎性神經(jīng)肽以及內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì)等炎性介質(zhì)引起的TRP 通道敏化和激活可能導(dǎo)致神經(jīng)源性炎癥和外周感覺(jué)神經(jīng)元活性增加，并且可能誘發(fā)CIPN 出現(xiàn)機(jī)械性超敏反應(yīng)。有趣的是，之前研究已經(jīng)證明了幾類信號(hào)脂質(zhì)，如類二十烷酸、亞油酸代謝產(chǎn)物和鞘脂等可促進(jìn)疼痛超敏反應(yīng)。
在本研究中，本文作者假設(shè)奧沙利鉑治療后早期發(fā)生神經(jīng)元可塑性和感覺(jué)神經(jīng)元活性變化。而這些神經(jīng)元活動(dòng)的改變可能會(huì)導(dǎo)致奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性周?chē)蕴弁匆饳C(jī)械性超敏反應(yīng)，并有可能增加周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)后來(lái)發(fā)生慢性神經(jīng)性病變的幾率和嚴(yán)重性。
2. 結(jié)果
（1）奧沙利鉑誘發(fā)的急性疼痛后的機(jī)械閾值、細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子：為了研究奧沙利鉑的急性作用，本文作者在經(jīng)典的痛覺(jué)模型（3 mg/kg 腹腔注射）中通過(guò)動(dòng)態(tài)足底測(cè)試評(píng)估了分別用對(duì)照劑和奧沙利鉑處理的雄性和雌性小鼠的機(jī)械閾值。在腹腔注射奧沙利鉑和對(duì)照劑后2、4、6、24、26、48 和72 h 測(cè)定小鼠縮足反射潛伏期。與對(duì)照組小鼠相比，注射奧沙利鉑24 h 后雌雄小鼠發(fā)生機(jī)械痛敏反應(yīng)，可以維持至72 h。在機(jī)械痛閾值方面，不同性別小鼠間并未觀察到任何差異。同樣，奧沙利鉑注射后24 h 和72 h 之間也無(wú)差異。使用冷板實(shí)驗(yàn)和丙酮實(shí)驗(yàn)，研究了急性?shī)W沙利鉑治療后對(duì)于冷痛感的影響，但治療后未檢測(cè)到任何冷超敏性反應(yīng)。
（2）脂質(zhì)與奧沙利鉑引起的急性疼痛有關(guān)：趨化因子、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子的篩選結(jié)果顯示，奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性周?chē)蕴弁磁c經(jīng)典的炎性疼痛在機(jī)理上有所不同。Piomelli 等研究證實(shí)內(nèi)源性脂質(zhì)介質(zhì)會(huì)引起疼痛超敏反應(yīng)，為了可以同時(shí)檢測(cè)數(shù)百種不同的脂質(zhì)，接下來(lái)對(duì)注射奧沙利鉑和對(duì)照劑24 h 后小鼠DRG、坐骨神經(jīng)和脊髓進(jìn)行了廣泛無(wú)差別的LC-QTOFMS 篩選。分析表明，在注射奧沙利鉑的小鼠DRG 中，游離脂肪酸增加。接下來(lái)用LC-MS/MS 檢測(cè)了由多不飽和游離脂肪酸(20:4)合成的前列腺素的濃度。此外，已知這些脂質(zhì)會(huì)在炎癥過(guò)程中增加，并可能導(dǎo)致疼痛超敏反應(yīng)。與細(xì)胞因子和趨化因子類似，注射奧沙利鉑后前列腺素類沒(méi)有增加。相反，驚奇地觀察到在注射奧沙利鉑的雄性小鼠DRG 中前列腺素PGE2、PGD2 和血栓烷B2b (TXB2) 顯著降低。雌性小鼠在注射奧沙利鉑后24 h 后，前列腺素PGE2 和PGD2 均顯著降低，但TXB2 的濃度無(wú)顯著變化。
本研究觀察到在注射奧沙利鉑24 h 后，DRG中的游離脂肪酸亞油酸(18:2)含量大大增加。因此通過(guò)LC-MS/MS 檢測(cè)了雌雄小鼠注射奧沙利鉑24 h 后DRG 中的氧化亞油酸代謝物(OLAMs)的濃度。發(fā)現(xiàn)9,10-EpOME 均顯著增加，而其代謝物9,10-DiHOME 均顯著降低。
由于注射奧沙利鉑24 h 后脂質(zhì)濃度產(chǎn)生差異，接下來(lái)研究了注射奧沙利鉑小鼠DRG 中相關(guān)脂質(zhì)氧化酶 (COX-2，LOX，CYPs) mRNA 的表達(dá)。但是，在注射奧沙利鉑后未觀察到脂質(zhì)氧化酶表達(dá)發(fā)生差異。同樣，分析了可溶性環(huán)氧化物水解酶2 (sEH) 的mRNA 表達(dá)水平，該酶可以將環(huán)氧化物降解為二醇。mRNA 表達(dá)分析顯示，在注射奧沙利鉑的小鼠DRG中，sEH 轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)無(wú)差異。與LC-QTOFMS 檢測(cè)結(jié)果一致，這些結(jié)果表明注射奧沙利鉑后的小鼠DRG 中9,10-EpOME 濃度升高的原因可能是底物亞油酸的豐度和可用性增加，而不是脂質(zhì)加氧酶的表達(dá)和活性增加。
（3）溶血磷脂酰膽堿和游離脂肪酸代謝產(chǎn)物與奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性疼痛有關(guān)：溶血磷脂酰膽堿 (LPCs)的亞組是在溶血磷脂家族中檢測(cè)到最豐富的脂質(zhì)。本文作者分析了LPC 亞組的19 種不同脂質(zhì)。結(jié)果顯示在注射奧沙利鉑后坐骨神經(jīng)和DRG中的LPC 18:1 顯著增加。在脊髓中，LPC 16:0 顯著增加。
此外，檢測(cè)了注射奧沙利鉑24 h 后DRG 中可以從復(fù)雜脂質(zhì)中釋放的LPC (iPLA2) 或游離脂肪酸(cPLA2) 的磷脂酶的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)兩種磷脂酶在注射奧沙利鉑24 h 后在DRG 中表達(dá)均增加。該結(jié)果與LC-QTOFMS 以及LC-MS/MS 的檢測(cè)結(jié)果一致，在注射奧沙利鉑24 h 后，脂質(zhì)家族游離脂肪酸和溶血磷脂酰膽堿的水平增加，并且9,10-EpOME濃度升高。另外，9,10-EpOME 濃度的升高驗(yàn)證了脂質(zhì)釋放酶mRNA 表達(dá)水平的升高增強(qiáng)了亞油酸釋放量和豐度增加的假設(shè)。
（4）LPC 16:0 和LPC 18:1 導(dǎo)致初級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元的鈣瞬變：由于注射奧沙利鉑后坐骨神經(jīng)和DRGs 中的LPC 18:1 和脊髓中LPC 16:0 顯著增加，表明9,10-EpOME 對(duì)TRPV1 有敏化作用，使用Ca2+成像來(lái)分析LPC 16:0 和LPC 18:1 在感覺(jué)神經(jīng)元中的作用。用LPC 16:0 和LPC 18:1 短時(shí) (45 s) 刺激感覺(jué)神經(jīng)元，與對(duì)照組相比，可以觀察到所有測(cè)試濃度發(fā)生鈣瞬變圖。只有10 μM 的LPC 16:0 刺激能夠顯著增加響應(yīng)的感覺(jué)神經(jīng)元的數(shù)量。重復(fù)使用LPC 18:1 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)到大約6%的感覺(jué)神經(jīng)元在5 μM LPC 18:1 刺激后產(chǎn)生響應(yīng)。即使用1 μM和10 μM LPC 18:1 刺激后，感覺(jué)神經(jīng)元也顯示出反應(yīng)。但在這些測(cè)試濃度下與對(duì)照組相比無(wú)差異。以上結(jié)果顯示，LPC 16:0 和LPC 18:1 都可能引起感覺(jué)神經(jīng)元的瞬時(shí)Ca2+內(nèi)流。
接下來(lái)，本文作者開(kāi)始確定對(duì)LPC 18:1 產(chǎn)生反應(yīng)的感覺(jué)神經(jīng)元亞群。用5 μM LPC 18:1 短時(shí)間 (45 s) 刺激神經(jīng)元后，用TRPA1 激動(dòng)劑AITC（異硫氰酸烯丙酯，100 μM; 40 s）和TRPV1 激動(dòng)劑辣椒素 (100 nM; 20 s) 共同刺激神經(jīng)元。如先前所示，在5 μM LPC 18:1 刺激后，對(duì)50 mM KCl 產(chǎn)生反應(yīng)的所有神經(jīng)元中，約7%出現(xiàn)瞬時(shí)Ca2+內(nèi)流。另外，共同刺激結(jié)果顯示在LPC 18:1 上發(fā)生反應(yīng)的神經(jīng)元也對(duì)選擇性TRPV1 激動(dòng)劑辣椒素產(chǎn)生明顯反應(yīng)。接下來(lái)用30 μM LPC 18:1 刺激轉(zhuǎn)染TRP 通道的HEK293 細(xì)胞60 s，與對(duì)照組相比，可以觀察到TRPV1 和TRPM8 陽(yáng)性轉(zhuǎn)染的HEK293 細(xì)胞中瞬時(shí)Ca2+內(nèi)流顯著升高。在TRPA1 通道陽(yáng)性轉(zhuǎn)染的HEK293 細(xì)胞中，與對(duì)照組和LPC 18:1 相比，Ca2+內(nèi)流未發(fā)生顯著變化。相反，與LPC 18:1 相比，對(duì)照組引起顯著的Ca2+內(nèi)流。TRP 通道陽(yáng)性轉(zhuǎn)染的HEK293 細(xì)胞由特異性TRP 通道激動(dòng)劑反應(yīng)檢測(cè)。用TRP 通道轉(zhuǎn)染的HEK293 細(xì)胞進(jìn)行體外Ca2+成像分析證實(shí)了先前在原代感覺(jué)神經(jīng)元中的檢測(cè)結(jié)果，LPC 18:1 可以作為T(mén)RPV1 通道激活劑。另外，可以將TRPM8 通道作為可以由LPC 18:1 激活的第二個(gè)TRP 通道。
（5）LPC 18:1 在感覺(jué)神經(jīng)元中引起TRPV1 和TRPM8 依賴性鈣瞬變：為了進(jìn)一步確定LPC18:1的作用，本文作者將感覺(jué)神經(jīng)元與TRPA1 (HC 030031) 和TRPV1 (AMG 9810) 以及TRPM8 (AMTB鹽酸鹽) 的選擇性抑制劑一起孵育。研究發(fā)現(xiàn)用TRPA1 抑制劑孵育感覺(jué)神經(jīng)元時(shí)，用LPC 18:1 對(duì)Ca2+內(nèi)流沒(méi)有影響。但孵育TRPV1 和TRPM8 的抑制劑后由LPC 介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流顯著減少。以上結(jié)果顯示LPC 18:1 在通過(guò)激活TRPV1-和TRPM8 陽(yáng)性神經(jīng)元的傷害性傳遞中起著重要作用。
為了驗(yàn)證LPC 18:1 是否可以有效激活TRPV1和TRPM8 通道，接下來(lái)，分別用特異性抑制劑分別抑制TRPV1 和TRPM8。首先用LPC 18:1 刺激感覺(jué)神經(jīng)元。然后，再次刺激前使用TRPV1 和TRPM8 抑制劑孵育神經(jīng)元。抑制TRPV1 或TRPM8可以部分阻斷由LPC 18:1 引起的Ca2+內(nèi)流。使用TRPV1 和 TRPM8 抑制劑后，可以響應(yīng)LPC 18:1 的神經(jīng)元數(shù)量降低約50%。這再次表明，LPC 18:1 可能會(huì)激活表達(dá)TRPV1 和TRPM8 神經(jīng)元亞群。為了檢測(cè)TRPV1 和TRPM8 是否受LPC 18:1 影響，接下來(lái)使用了兩種抑制劑的組合。抑制TRPV1 和TRPM8 后，由LPC 18:1 介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流可以被完全阻斷。此外，檢測(cè)了TRPV1 和TRPM8 缺陷型小鼠中LPC 誘導(dǎo)的鈣反應(yīng)。在TRPV1 缺陷型小鼠中，觀察到對(duì)LPC 18:1反應(yīng)的神經(jīng)元數(shù)量顯著減少。在TRPM8 缺陷型小鼠中，發(fā)現(xiàn)了對(duì)LPC 18:1 反應(yīng)的神經(jīng)元數(shù)量也有減少的趨勢(shì)。
（6）LPC 18:1 在體內(nèi)引起機(jī)械性超敏反應(yīng)：為了探究LPC 18:1 在體內(nèi)是否有效，在野生型小鼠的左后足皮下分別注射了10 μM 和50 μM 的LPC 18:1和對(duì)照劑，并檢測(cè)了注射后0.5、1、2、3、4 和6 h小鼠的縮足反射潛伏期。檢測(cè)機(jī)械閾值后發(fā)現(xiàn)小鼠注射LPC 18:1 后0.5 h 出現(xiàn)機(jī)械超敏反應(yīng)，并可以持續(xù)2 h。
3. 討論
本研究觀察到注射奧沙利鉑后神經(jīng)組織中各種脂質(zhì)的合成發(fā)生了顯著變化。LC-MS/MS 檢測(cè)結(jié)果顯示DRG 中前列腺素濃度顯著降低，而9,10-EpOME濃度升高。后者已被Sisignano 等證明可以引發(fā)感覺(jué)神經(jīng)元的TRPV1 通道敏化并在體內(nèi)引起機(jī)械和熱超敏反應(yīng)。此外，非靶向性脂質(zhì)組學(xué)分析顯示在注射奧沙利鉑小鼠的DRGs 和坐骨神經(jīng)中，溶血磷脂酰膽堿信號(hào)增強(qiáng)，特別是LPC 18:1。通過(guò)對(duì)LPC 18:1 的研究，觀察到在TRPV1 和TRPM8 陽(yáng)性感覺(jué)神經(jīng)元中，脂質(zhì)可以引起Ca2+的瞬變。
在本研究中未觀察到脊髓背角趨化因子、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子水平以及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化程度的變化，這表明經(jīng)典的炎癥過(guò)程和相關(guān)介質(zhì)似乎對(duì)奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性疼痛影響不大。用qPCR 分析檢測(cè)到注射奧沙利鉑的小鼠DRG 中ROS 產(chǎn)生酶的mRNA 表達(dá)未發(fā)生顯著增加。Doyle 等研究中發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞激活以及促炎性細(xì)胞因子和ROS 水平升高可能會(huì)促進(jìn)CINP。但主要研究了CIPN 的后續(xù)時(shí)間點(diǎn)（注射后的幾天或幾周）。本研究結(jié)果表明，經(jīng)典炎癥通路和相關(guān)介質(zhì)在奧沙利鉑誘發(fā)的疼痛中的作用不像在其他慢性疼痛中那么重要，因此可能是在奧沙利鉑誘發(fā)神經(jīng)性病變后期開(kāi)始的繼發(fā)性反應(yīng)。此外，盡管可以觀察到雌雄小鼠之間脂質(zhì)濃度的差異，但奧沙利鉑誘發(fā)的機(jī)械性超敏反應(yīng)的程度在雌雄小鼠中相似，表明這些濃度差異對(duì)不同性別的奧沙利鉑誘發(fā)的機(jī)械性超敏反應(yīng)沒(méi)有直接影響。
非靶向性脂質(zhì)組學(xué)檢測(cè)顯示注射奧沙利鉑后的小鼠坐骨神經(jīng)和DRG 中的LPC 18:1 以及脊髓中的LPC 16:0 顯著升高。據(jù)Abeele 等的研究報(bào)道，不同的LPC 種類可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)染后的HEK-293 細(xì)胞中TRPM8 通道的開(kāi)放概率。Andersson 等在TRPM8轉(zhuǎn)染的CHO 細(xì)胞中用LPC 16:0 處理后觀察到相同的效果。本研究的結(jié)果與這兩項(xiàng)研究一致，但在此基礎(chǔ)增加了重要的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，即LPC 18:1 和LPC 16:0對(duì)DRG 神經(jīng)元的TRPM8 和TRPV1 通道均起作用。而Nieto-Posadas 和Canul-Sánchez 等與本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反，通過(guò)內(nèi)面向外式膜片鉗和單通道電流無(wú)法檢測(cè)到由LPC 引起的HEK-293 細(xì)胞中的TRPV1激活，這表明在異源表達(dá)系統(tǒng)中觀察到的鈣瞬變是由LPC 18:1 間接激活TRPV1 引起的。
在體數(shù)據(jù)顯示LPC 18:1 可引起機(jī)械性超敏反應(yīng)。因此，坐骨神經(jīng)和DRGs 中LPC 18:1 水平升高可能直接導(dǎo)致奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性周?chē)蕴弁?。并且發(fā)現(xiàn)在注射奧沙利鉑24 h 后的小鼠DRG 中亞油酸衍生的代謝物9,10-EpOME 顯著增加。Sisignano等的研究表明，由CYP2J6 合成的9,10-EpOME 不僅對(duì)TRPV1 通道具有直接的致敏作用，而且還可以在體內(nèi)引起機(jī)械性超敏反應(yīng)和熱痛。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示LPC 和游離脂肪酸水平顯著增加，同樣本文作者也證明了cPLA2-和iPLA2-途徑在奧沙利鉑治療動(dòng)物的DRGs 中可能被激活。Dennis 等證明磷脂酶可以從膜磷脂中釋放游離脂肪酸 (cPLA2) 和溶血磷脂 (iPLA2)。一項(xiàng)針對(duì)于iPLA2 途徑的研究顯示，由冷和TRPM8 激動(dòng)劑icilin 激活的TRPM8 可被選擇性iPLA2 抑制劑溴烯醇內(nèi)酯 (BEL) 所阻斷。而用BEL處理的在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明由LPC 16:0 引起的冷痛敏不能被iPLA2 的抑制劑所阻斷。并且iPLA2 參與了前列腺素的生產(chǎn)過(guò)程，通過(guò)BEL 抑制iPLA2可以導(dǎo)致前列腺素濃度降低。本研究表明了靶向iPLA2 途徑并通過(guò)抑制CYP2J6 減少9,10-EpOME合成可減輕奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性疼痛。但目前尚沒(méi)有可以用作臨床候選藥物的選擇性iPLA2 拮抗劑，需要進(jìn)行更多研究來(lái)探索iPLA2 的潛在生理作用，這可能給治療的病人帶來(lái)不良反應(yīng)。
除脂質(zhì)信號(hào)傳導(dǎo)途徑外，本研究結(jié)果表明靶向TRP 通道可能有利于阻斷奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性周?chē)蕴弁?。Chukyo 等研究表明，在奧沙利鉑治療后，DRG 中TRPM8 和TRPV1 轉(zhuǎn)錄本在后續(xù)時(shí)間點(diǎn)增加，并可能導(dǎo)致冷痛敏。此外，Wong＆Gavva 等報(bào)道稱辣椒堿通過(guò)抑制TRPV1-和TRPM8 通道降低奧沙利鉑誘導(dǎo)的體內(nèi)冷性異常性疼痛，而不僅僅是5′-碘樹(shù)脂毒素抑制TRPV1-通道。但目前尚無(wú)可用于臨床的TRP 通道拮抗劑。先前的TRPV1 拮抗劑早期臨床試驗(yàn)由于導(dǎo)致病人體溫過(guò)高而失敗，這表明TRPV1 在維持體溫方面起著重要作用，并阻礙了安全的TRPV1 拮抗劑的臨床開(kāi)發(fā)。
綜上所述，本研究突出了奧沙利鉑治療后神經(jīng)元脂質(zhì)合成和代謝早期變化的重要性，并確定了LPC-EpOME-TRPV1-TRPM8 信號(hào)通路脂質(zhì)在奧沙利鉑誘導(dǎo)的急性疼痛中的關(guān)鍵作用。
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