毛天皓 劉天旭 魯鳳民

乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染是我國慢性病毒性肝炎、肝硬化及相關(guān)肝癌的主要致病因素，我國77%的肝硬化和84%的肝細胞癌 (HCC)與之有關(guān)[1]?？共《局委熆擅黠@減緩慢性乙型肝炎(CHB)的疾病進展，使我國近年來HBV相關(guān)肝硬化和肝纖維化的死亡率有所下降，但HBV相關(guān)肝癌的死亡率并未有明顯改變[2]。已有足夠的證據(jù)表明，慢性乙型肝炎的臨床治愈可以進一步減少肝癌的發(fā)生。因此，慢性乙型肝炎患者的臨床治愈已成為醫(yī)生和患者的共同訴求。

一、共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)清除是乙型肝炎治愈的關(guān)鍵

感染肝細胞核內(nèi)以微小染色體的形式存在的cccDNA是HBV復制的模板，平均每個細胞內(nèi)的cccDNA拷貝數(shù)在5～50[3]。其來源有從頭感染(de novo infection)和內(nèi)補充(intracellular recycling)兩個途徑。新感染的病毒顆粒核衣殼內(nèi)部分雙鏈松弛環(huán)狀DNA(rcDNA)進入細胞核，經(jīng)宿主DNA修復系統(tǒng)轉(zhuǎn)換為cccDNA；而在已建立感染的肝細胞，cccDNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的前基因組RNA(pgRNA)在核衣殼內(nèi)經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成出rcDNA，這些新合成的rcDNA除了能夠以Dane顆粒的形式釋放去感染新的肝細胞外，也可以返回核內(nèi)補充cccDNA池[4]。由于以微小染色體形式存在的cccDNA缺乏著絲粒，在炎癥或免疫調(diào)節(jié)治療過程中，感染肝細胞的死亡和殘存感染肝細胞的代償性增殖均會導致cccDNA池因丟失而被稀釋[5]。

現(xiàn)階段的藥物包括長效干擾素-α(IFN-α)和核苷(酸)類似物(NAs)兩種，都不能直接靶向cccDNA。前者具有免疫調(diào)節(jié)作用，而NAs則通過與天然核苷酸dNTP競爭，摻入病毒DNA新鏈并不可逆地終止其延伸，使產(chǎn)生的缺陷型病毒顆粒失去感染性[6]。孫劍等[7]通過抗病毒治療過程中血清HBV RNA耐藥突變準種的動態(tài)變化，推測cccDNA的半衰期約6個月。這為我們通過影響從頭感染和內(nèi)補充兩條途徑以耗竭cccDNA提供了可能，但這往往需要長時間的抗病毒治療。因此，了解HBV cccDNA的形成過程以及宿主細胞影響cccDNA合成的分子機制，對于研發(fā)新藥、治愈乙型肝炎至關(guān)重要。

二、HBV通過從頭感染使其基因組rcDNA入核轉(zhuǎn)換為cccDNA

在感染過程中，病毒包膜蛋白乙型肝炎表面抗原(HBsAg)與硫酸肝素乙酰蛋白多糖(HSPGs)以低親和力結(jié)合于肝細胞膜上[8]，進而與肝細胞基底外側(cè)膜上的鈉離子-牛磺膽酸共轉(zhuǎn)運多肽(NTCP)結(jié)合[9]，使病毒被內(nèi)吞進入細胞并被包入內(nèi)體。病毒包膜隨即與內(nèi)體膜融合釋放出核衣殼。后者被運輸至核孔復合體中并發(fā)生解體，其中的rcDNA與部分核心蛋白(core protein, HBc)進入胞核[10]。

進入細胞核內(nèi)的rcDNA轉(zhuǎn)化為cccDNA的過程主要包括正鏈5′末端RNA引物的去除、正鏈的補全、負鏈5′末端P蛋白(polymerase)和冗余片段“r序列”的去除。最終，正負鏈末端分別連接形成cccDNA，并隨即發(fā)生染色質(zhì)化成游離的微小染色體結(jié)構(gòu)[11]。在這一過程中，正鏈5′末端加帽的18個核苷酸(nucleotide，nt)的RNA寡聚引物和負鏈5′末端約10 nt的冗余片段“r序列”所形成的襟翼結(jié)構(gòu)主要由片段結(jié)構(gòu)特異內(nèi)切核酸酶1(FEN-1)等宿主因子移除[4]。而不完整的HBV DNA正鏈則可能被P蛋白和宿主細胞DNA聚合酶κ(POLK)、L(POLL)和H(POLH)延伸補齊[12]。

近期，魏磊等[13]利用酵母和人肝癌細胞提取物的生化合成體系，證明DNA滯后鏈(正鏈)合成和cccDNA形成的5種最基本蛋白質(zhì)原件：增殖細胞核抗原(PCNA)、復制因子C(RFC)、DNA聚合酶δ(POL δ)、FEN-1和DNA連接酶1(LIG1)。但肝細胞內(nèi)的cccDNA合成機制可能更為復雜，需要細胞DNA拓撲異構(gòu)酶(TOP)[14]、DNA損傷反應系統(tǒng)ATR-CHK1途徑[15]的參與等。

三、rcDNA的形成與cccDNA的內(nèi)補充

作為病毒RNA生成的模板，cccDNA可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生3.5、2.4、2.1和0.7 kb的HBV RNA。其中3.5 kb的前基因組RNA(pgRNA)既是翻譯成核心蛋白和P蛋白的mRNA，其本身也是病毒逆轉(zhuǎn)錄復制合成rcDNA負鏈的模板[4]。以pgRNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成rcDNA的過程需要經(jīng)過三次模板跳轉(zhuǎn)。

起初，P蛋白識別pgRNA 5′末端附近的epsilon(ε)莖環(huán)，形成P-ε核糖核蛋白(RNP)復合物，被核心蛋白二聚體識別和包裝，形成核心顆粒并在其中啟動逆轉(zhuǎn)錄[16]。在伴侶蛋白的幫助下，P蛋白末端蛋白(TP)結(jié)構(gòu)域中的酪氨酸從pgRNA近5′末端ε莖環(huán)的凸起區(qū)起始，以堿基配對的原則共價連接3～4 個核苷酸[(T)GAA]，并作為第一個模板引物從pgRNA 近5′末端ε莖環(huán)跳轉(zhuǎn)至近3′末端的11 nt直接重復序列1(DR1)處[4]。接著，在P蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進行逆轉(zhuǎn)錄，將DNA負鏈延伸至pgRNA的5′末端，并使負鏈DNA 3′末端形成冗余片段。與此同時，P蛋白的RNase H結(jié)構(gòu)域也同步介導了pgRNA的降解，而pgRNA 5′末端加帽且包含上游DR1的部分序列在DNA負鏈合成終止時得到保留[17]。這段未降解的序列從新合成DNA負鏈近3′末端的DR1跳轉(zhuǎn)到負鏈近5′末端的DR2，作為第二個模板引物引導DNA正鏈合成[18]。在第二次跳轉(zhuǎn)成功的基礎(chǔ)上，DNA正鏈延伸至DNA負鏈的5′末端，新合成DNA正鏈的3′游離末端從負鏈的5′末端通過同源互補跳轉(zhuǎn)至負鏈的3′末端，繼續(xù)正鏈DNA的合成并形成rcDNA[19]。目前，我們實驗室正在對這些精確跳轉(zhuǎn)的分子機制進行探究。含有rcDNA的核衣殼(nucleocapsid)被病毒包膜糖蛋白包裹形成子代病毒，部分核衣殼也可穿梭回細胞核并繼續(xù)轉(zhuǎn)化為cccDNA，保持cccDNA池的相對穩(wěn)定，此即為cccDNA的內(nèi)補充機制。若第二次跳轉(zhuǎn)失敗，則在負鏈的3′端原位合成正鏈DNA，形成雙鏈線性DNA(double-strand linear DNA, dslDNA)。dslDNA的發(fā)生頻率約為rcDNA的5%～20%，主要整合到宿主基因組并能夠轉(zhuǎn)錄表達HBsAg[4]。

四、cccDNA微小染色體與宿主的相互作用

cccDNA形成后發(fā)生超螺旋，并被宿主蛋白(如組蛋白H3和H4)以及病毒蛋白(HBx和HBc)修飾，形成串珠樣核小體結(jié)構(gòu)，以游離的微小染色體形式存在。這一結(jié)構(gòu)與宿主正常染色質(zhì)存在著一定的相似性，具有逃避免疫系統(tǒng)攻擊的潛力。但cccDNA微小染色體的核小體間隔(重復長度)為180 bp，與真核細胞染色體200 bp的核小體間隔不同[20]。此外，cccDNA無法進行半保留復制，因此在細胞周期過程中的表現(xiàn)與宿主DNA不同。

cccDNA微小染色體受到多種宿主轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、共刺激因子和病毒蛋白等單獨或聯(lián)合的調(diào)控，展現(xiàn)出與宿主相互作用的廣闊圖景。肝細胞核因子1/3/4(hepatocyte nuclear factors 1/3/4, HNF 1/3/4)、CCAAT增強子結(jié)合蛋白(C/EBP)等宿主因子可能促進cccDNA轉(zhuǎn)錄活性；染色體結(jié)構(gòu)維持復合物5/6(SMC 5/6)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)[21]等被發(fā)現(xiàn)可以抑制cccDNA活性。HBx蛋白可以調(diào)節(jié)多種限制性因子，減弱其抑制作用[22]。我們曾發(fā)現(xiàn)HBx可與陰陽1(YY1)蛋白協(xié)同介導cccDNA與宿主染色質(zhì)19p13.11增強子的空間互作，激活HBV轉(zhuǎn)錄[23]。HBV包膜蛋白也被證明能夠調(diào)節(jié)cccDNA的形成[24]。cccDNA微小染色體同樣可以發(fā)生DNA甲基化和組蛋白修飾等表觀遺傳修飾，以調(diào)節(jié)病毒基因表達和病毒復制[25]。cccDNA包含3個可能被甲基化的CpG島，在慢性HBV感染患者體內(nèi)存在不同程度的甲基化[26-27]。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)介導了病毒基因組的甲基化，可在體外抑制cccDNA轉(zhuǎn)錄及HBV復制[28]。此外，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶及去甲基化酶、組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶及去乙?；妇鶇⑴c了對cccDNA微小染色體的組蛋白修飾[25]。黃愛龍等[29]研究表明，組蛋白去乙?；窼IRT3可結(jié)合至cccDNA微小染色體并協(xié)同組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制病毒復制。Yang等[30]對感染HBV的HepG2-NTCP細胞進行3C高通量全基因組易位測序(3C-HTGTS)，發(fā)現(xiàn)cccDNA更傾向存在于宿主基因組中富含H3K4me3、H3K9ac、H3K4me1和H3K27ac等組蛋白修飾的活躍增強子和啟動子區(qū)域。

近年來，對cccDNA的研究日漸深入，但仍然存在許多未知。cccDNA微小染色體的形成過程與宿主細胞分子機制息息相關(guān)，體現(xiàn)出病毒感染的復雜性。通過染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)等技術(shù)，可以對cccDNA結(jié)合蛋白進行精細的分析，為靜默或清除cccDNA提供思路。CRISPR/Cas9等基因編輯工具已被證明可以靶向編輯和降解HBV cccDNA[31]。硫酸葡聚糖鈉(dextran sodium sulfate, DSS)等小分子也或許可以阻止rcDNA轉(zhuǎn)化為cccDNA[32]。隨著有效治療方法的介入，結(jié)合cccDNA較短的半衰期，有望在未來實現(xiàn)cccDNA的靜默和清除，實現(xiàn)慢性乙型肝炎的臨床治愈。