胡曉強(qiáng)，李 峰，趙建選，靳榮線，馬瑋超

（河南省新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453000）

平菇[Pleurotus ostreatus（Fr.）Kummer]適應(yīng)性強(qiáng)、生長旺盛，栽培、管理相對(duì)容易，出菇快、產(chǎn)量高、營養(yǎng)價(jià)值高，是世界上主要栽培食用菌之一，也是我國各地廣泛栽培的菌類之一。據(jù)中國食用菌協(xié)會(huì)統(tǒng)計(jì)（2017年），國內(nèi)平菇2016年總產(chǎn)量約600萬噸，在全國各地均有栽培，河南省是全國平菇重點(diǎn)產(chǎn)區(qū)，年產(chǎn)量約100萬噸，栽培面積分布全省[1]。不同地區(qū)氣候環(huán)境和栽培工藝的不同，同一品種會(huì)有不同的出菇表現(xiàn)，因此在規(guī)模化生產(chǎn)前應(yīng)做適應(yīng)性馴化。楚曉真等[2]對(duì)河南地區(qū)的12個(gè)平菇菌株進(jìn)行了比較試驗(yàn)，篩選出2個(gè)在產(chǎn)量、抗病性、菇色、菇形等方面表現(xiàn)良好的菌株。劉芹等[3]在河南23個(gè)常規(guī)栽培品種中，篩選出7個(gè)品質(zhì)優(yōu)良的品種。河南平菇栽培面積大，主要分為熟料、發(fā)酵半熟料、發(fā)酵料3種栽培模式，為篩選適宜本地發(fā)酵料模式生產(chǎn)使用的平菇菌株，對(duì)收集、引進(jìn)的29個(gè)平菇菌株進(jìn)行了品種比較分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

供試平菇菌株共29個(gè)，菌株信息詳見表1。

表1 供試平菇菌株Tab.1 The tested strains of Pleurotus ostreatus

1.1.2 供試培養(yǎng)基

CPDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂 20 g、KH2PO42 g、MgSO40.5 g，水 1 000 mL，pH自然。

液體培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、KH2PO42 g、MgSO40.5 g，水1 000 mL，pH自然。

原種培養(yǎng)基：麥粒78%、棉籽殼20%、石膏2%。

栽培種培養(yǎng)基：棉籽殼70%、玉米芯28%、石灰2%，含水量65%。

發(fā)酵料培養(yǎng)基：玉米芯92.5%、尿素1.5%、磷肥3%、石灰3%，含水量65%～70%。

1.1.3 主要試劑與儀器

三羥甲基甲烷 （C4H11NO3，Tris）、N，N，N’，N’-乙二胺（C6H16N2，TEMED）、丙烯酰胺 （C3H5NO，Acr）、甲叉雙丙烯酰胺（C7H10N2O2，Bis）、甘氨酸（C2H5NO2）、過硫酸銨、核黃素、甘氨酸（C2H5NO2）、乙酸-1-萘酯（C12H10O2）、乙酸-2-萘酯（C12H10O2）、固藍(lán)RR鹽（C15H14ClN3O3，1/2 ZnCl2）等，均為分析純，阿拉丁試劑（上海）有限公司。

DYCZ-24B型電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酯酶同工酶法鑒定菌株

同工酶是蛋白質(zhì)的一種特殊類型，是指來源相同，催化性質(zhì)相同而酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)不同，分別由不同等位基因或不同基因位點(diǎn)編碼的蛋白質(zhì)，具有組織、發(fā)育階段及物種的特異性。作為一種遺傳標(biāo)記，同工酶已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物的遺傳分析、生理生化研究，并且作為分類的重要指標(biāo)廣泛應(yīng)用于真菌的分類鑒定中。參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1097-2006食用菌菌種真實(shí)性鑒定 酯酶同工酶電泳法[4]的方法進(jìn)行試驗(yàn)。供試菌株經(jīng)試管活化后，接種于液體培養(yǎng)基，25℃恒溫靜止培養(yǎng)7 d。用濾紙過濾菌絲體，放入預(yù)冷的研缽中，冰浴條件下研磨至粉末狀，然后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入Tris-HCl提取液，混勻，于4℃、10 000 r·min-1條件下離心10 min。取上清液，與40%蔗糖溶液和溴酚藍(lán)指示劑以5∶1∶1的比例混合，即為電泳樣品。

采用垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度7%，濃縮膠濃度2.5%，上樣量20 μL，在室溫條件下穩(wěn)流電泳。采用固藍(lán)RR鹽、乙酸-ɑ萘酯、乙酸-β萘酯染色過夜，7%醋酸溶液漂洗、固定凝膠，膠片成像儀下拍照。

1.2.2 栽培試驗(yàn)

按照技術(shù)規(guī)程，依次制備原種、栽培種，采用玉米芯發(fā)酵料栽培方式[5]栽培，發(fā)酵料培養(yǎng)基按照配方堆置，料溫達(dá)到60℃以后每2天翻堆1次，發(fā)酵10 d。采用26 cm×55 cm×0.015 cm規(guī)格塑料袋制袋，每袋平均裝干料1.5 kg。播種時(shí)共播4層菌種，每層使用菌種量15%，室溫發(fā)菌，適時(shí)采收。每個(gè)菌株栽培15袋，按照每個(gè)菌株出菇比例達(dá)到60%時(shí)統(tǒng)計(jì)子實(shí)體菌蓋顏色、菌柄質(zhì)地、菌褶顏色、菌褶密度，記錄各菌株滿袋時(shí)間、產(chǎn)量等指標(biāo)。

菌褶密度（D）計(jì)算公式為：

式中：X表示統(tǒng)計(jì)的菌褶數(shù)（條）；C表示統(tǒng)計(jì)的菌褶長度（cm）。

生物學(xué)效率（E，%）計(jì)算公式為：

式中：M表示子實(shí)體鮮重（kg）；m表示培養(yǎng)料干重（kg）。

2 結(jié)果與分析

2.1 平菇不同菌株間酯酶同工酶分析

不同平菇菌株酯酶同工酶酶譜見圖1。

圖1 部分平菇菌株酯酶同工酶圖譜Fig.1 Esterase isozyme zymogram for a parts of Pleurotus ostreatus

如圖1所示，平菇的酶帶較多，數(shù)量在3條～9條不等，共檢測(cè)到13條遷移速度不同的酶帶，根據(jù)酯酶同工酶條帶的有無，按照有條帶記為1，無條帶記為0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用相似系數(shù)法進(jìn)行聚類分析，得到樹狀圖，見圖2。

圖2 供試平菇菌株酯酶同工酶聚類分析樹狀圖Fig.2 Dendrogram of esterase isozyme cluster analysis for Pleurotus ostreatus strains

由圖2可以看出，當(dāng)相似系數(shù)為0.65時(shí)，可以把29個(gè)平菇菌株分為4個(gè)類群。第一類群包括：野生1、野生4、PH5、PH2、豫三05、106-2共6個(gè)菌株；第二類群包括：野生2、野生3共2個(gè)菌株；第三類群包括：PH4、PH8、PH14、新科108、Pl46、650、8129、18003、新科 106、107-2、17004、615、8105、Pl54、黑平 2號(hào)、新831、雪F2、2106、99共19個(gè)菌株；第四類群包括：新科102、原生2號(hào)共2個(gè)菌株。其中第一類群、第二類群與第三類群、第四類群相似系數(shù)為0.51，第一類群與第二類群相似系數(shù)為0.53，第三類群與第四類群相似系數(shù)為0.61，29個(gè)平菇菌株的酯酶多態(tài)性較高，種質(zhì)資源較為豐富。

2.2 栽培試驗(yàn)

不同平菇菌株栽培試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 供試平菇菌株農(nóng)藝性狀比較Tab.2 Comparison of the agronomic characters of Pleurotus ostreatus strains

如表 2所示，菌株2106、650、180-2、8105、PH2、PH4、PH8、新科102這8個(gè)菌株菌絲生長速度最快，均為25 d滿袋，野生4、PH5、豫三05這三個(gè)菌株菌絲生長速度較慢，大多數(shù)菌株菌絲滿袋時(shí)間為26 d～30 d之間；供試菌株的子實(shí)體菌蓋顏色分為灰白色、灰色、灰黑色至黑色；菌柄質(zhì)地分為硬、中等程度硬和軟；菌褶為白色和灰白色；菌褶密度差異較大，菌褶密度為13～21不等；前三茬生物學(xué)效率最高的菌株為2106，達(dá)82.9%，其次為新科108、650。通過對(duì)菌株滿袋時(shí)間、子實(shí)體農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量等一系列性狀的比較，2106、新科108、650菌株綜合性狀較好，可作為本地秋冬季生產(chǎn)的優(yōu)良平菇菌株。

3 討論與結(jié)論

酯酶同工酶是從蛋白質(zhì)水平反應(yīng)生物的遺傳變異，是一種主要的生化標(biāo)記技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于食用菌的分類鑒定及種質(zhì)資源評(píng)價(jià)等研究[6-9]。本研究對(duì)收集和保藏的29個(gè)主要平菇栽培菌株進(jìn)行了酯酶同工酶分析，得到了29個(gè)平菇供試菌株的遺傳相似系數(shù)和聚類分析樹狀圖，初步鑒定了29個(gè)供試菌株之間的親緣關(guān)系。結(jié)果表明，29個(gè)平菇菌株的酯酶多態(tài)性較高，種質(zhì)資源較為豐富，可作為遺傳育種的備選材料。

豫北地區(qū)秋冬季發(fā)酵料栽培平菇，主要選用菌絲生長速度快、子實(shí)體菌蓋顏色深、商品性狀優(yōu)的菌株作為生產(chǎn)用菌株。發(fā)酵料培養(yǎng)基為非純培養(yǎng)培養(yǎng)基，菌絲生長速度快，生長優(yōu)勢(shì)強(qiáng)，一般抗雜性和栽培成功率較高；本地市場(chǎng)對(duì)菌蓋顏色深、菌褶顏色白的菌株較為喜愛；菌褶密度與平菇商品的運(yùn)輸影響較大，一般認(rèn)為菌褶密度較稀的菌株，在采摘及運(yùn)輸過程中，由于機(jī)械碰觸，易造成菌褶破裂，影響商品性，菌褶密度大的菌株成為人為選擇馴化的一個(gè)指標(biāo)。綜合29個(gè)平菇商品性狀及產(chǎn)量，2106、新科108、650可作為本地秋冬季發(fā)酵料生產(chǎn)用的優(yōu)良平菇菌株。