蒙秋霞，聶建軍，徐全飛，潘保華，趙悠悠，馮婉君，牛 宇**

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院省部共建有機(jī)旱作農(nóng)業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院，山西太原 030006；3.山西省侯馬市出入境檢驗(yàn)檢疫局，山西 侯馬 043000）

白靈菇學(xué)名為刺芹側(cè)耳托里亞種（Pleurotus tuoliensis 或 Pleurotus eryngii subsp.tuoliensis）[1]，過(guò)去也常被稱為阿魏蘑、阿魏側(cè)耳。其菇體形似靈芝、色澤潔白、營(yíng)養(yǎng)豐富、滋味鮮美，富含多糖、氨基酸、脂肪、粗纖維、維生素和礦物質(zhì)，具有鎮(zhèn)咳、消炎、消積、殺蟲、解毒、防治腫瘤、增強(qiáng)人體免疫力等功效，其多糖可增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，是一種食用價(jià)值和藥用價(jià)值都很高的珍稀食用菌[2-4]。

自由基是帶有未配對(duì)電子的基團(tuán)或原子，包括活性氧簇（ROS）、活性氮簇（RNS）、活性碳簇（RCS） 和活性硫簇（RSS）[5]。自由基是一把雙刃劍，低水平的ROS作為胞間信號(hào)通路的第二信使，通過(guò)激活核因子 кB（NF-кB） 和低氧誘導(dǎo)因子 1α（HIF），調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、基因表達(dá)，為維持細(xì)胞正常功能所必需[5]。ROS水平的適度提升可幫助機(jī)體抵御多種微生物引起的感染，并參與細(xì)胞凋亡過(guò)程，清除癌變細(xì)胞[6]；但若自由基水平超過(guò)一定量，多余的自由基會(huì)攻擊機(jī)體的DNA、脂類、蛋白質(zhì)等生物大分子，造成細(xì)胞死亡或功能異常，加速衰老進(jìn)程，引起多種疾病[5]。因此，清除多余的自由基有益于延緩衰老、預(yù)防和治療多種疾病?？寡趸瘎┛梢蕴峁湓踊螂娮?，使其與自由基中單獨(dú)的電子配對(duì)，使自由基消失。因此，開(kāi)發(fā)高效無(wú)毒、可清除自由基的天然抗氧化劑日益重要。

目前，研究食用菌的抗氧化活性及其提升方法成為功能性食用菌研究開(kāi)發(fā)的一個(gè)熱點(diǎn)，人們開(kāi)始探索利用中藥材、藥渣和微量元素研發(fā)復(fù)合培養(yǎng)基質(zhì)，通過(guò)科學(xué)方法和特殊工藝培育具有更高抗氧化功效的食（藥）用菌產(chǎn)品。研究表明，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加刺五加、何首烏等中藥材，可提高黑木耳、靈芝等食（藥）用菌體內(nèi)活性物質(zhì)的含量，并增強(qiáng)其抗氧化活性[7-8]。在研究中藥材對(duì)深層發(fā)酵白靈菇生長(zhǎng)情況和活性物質(zhì)含量的影響方面，孟麗等[9]考察了中藥阿魏、防風(fēng)、柴胡、前胡浸出液對(duì)白靈菇菌絲生長(zhǎng)發(fā)育的影響，張勁松等[10]測(cè)定了黃芪水提物對(duì)白靈菇等5種食用菌菌絲體生長(zhǎng)的影響，李赟等[11]測(cè)定了黨參提取液對(duì)深層發(fā)酵白靈菇多糖含量的影響。

黃芪為豆科植物蒙古黃芪 [Astragalus membranaceus Bge.var.mongholicus(Fisch.)Hsiao]和膜莢黃芪 [Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge]的干燥根[12]。黃芪最早記錄于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有益氣、排毒、利尿、消腫等功效，目前已被記錄以黃芪為原料的藥有兩百多種[13]，因此黃芪被譽(yù)為“補(bǔ)藥之長(zhǎng)”，為歷代中醫(yī)常用中藥之一。我國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（2002） 51號(hào)文件中明確列出了114種可用于保健品的中藥，其中就包括黃芪。研究顯示，黃芪中的藥效成分有黃酮、皂苷和多糖等[14]。黃酮類成分具有抗心肌缺血、保護(hù)肝臟、消炎、預(yù)防突變、預(yù)防腫瘤等功效[15]；皂苷可抗炎抑炎、調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)神經(jīng)、預(yù)防多發(fā)性硬化[16]；多糖具有抗腫瘤、降血糖、降血脂、保護(hù)心血管、清除多種自由基及延緩衰老等多種藥理作用[17-18]。目前，黃芪對(duì)深層發(fā)酵白靈菇活性物質(zhì)含量及抗氧化能力的影響尚無(wú)報(bào)道。

通過(guò)深層發(fā)酵，探索黃芪水提物對(duì)白靈菇菌絲生長(zhǎng)、活性物質(zhì)含量的影響，并從DPPH·清除能力、羥基自由基（·OH） 清除能力、還原力和亞鐵離子螯合能力，測(cè)定黃芪水提物對(duì)白靈菇菌絲體抗氧化活性的影響，為新型功能性食用菌產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

黃芪原藥材，山西省渾源縣；白靈菇菌株天山2號(hào)，北京吉蕈園科技有限公司。

1.2 供試培養(yǎng)基

PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、蛋白胨0.3%、硫酸鎂0.2%、磷酸氫二鉀0.2%、瓊脂2%。

液體種子培養(yǎng)基：黃豆芽汁20%、葡萄糖2%、磷酸二氫鉀0.2%、酵母膏0.5%、硫酸鎂0.1%、VB10.01%，pH自然。

1.3 其他試劑

二苯代苦味酰基自由基（DPPH·） 試劑盒、羥基自由基測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；亞硝酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、酵母浸膏、水楊酸，天津市大茂化學(xué)試劑廠；無(wú)水乙醇、硝酸鋁、硫酸鎂、磷酸二氫鉀，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；黃芪甲苷、槲皮素，北京北方偉業(yè)化工技術(shù)研究院；沒(méi)食子酸，成都市科龍化工試劑廠；葡萄糖，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；香草醛、四氯苯醌、苯酚、氯化鐵，南京化學(xué)試劑股份有限公司；福林酚試劑，北京索萊寶科技有限公司；硫酸亞鐵，無(wú)錫市晶科化工有限公司；過(guò)氧化氫，天津市東方廣誠(chéng)醫(yī)藥化工有限公司；三氯乙酸，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；鐵氰化鉀，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水氯化亞鐵，上海依赫生物科技有限公司；氫氧化鈉，天津市大陸化學(xué)試劑廠；亞鐵嗪、硼氫化鈉，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；蛋白胨、瓊脂粉，北京奧博星生物技術(shù)有限公司；VB1，天津力生制藥股份有限公司。所用試劑均為分析純。

1.4 試驗(yàn)儀器

ME204電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SW-GJ-1FD系列超凈工作臺(tái)，上海博訊實(shí)驗(yàn)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BS-S恒溫振蕩培養(yǎng)箱，國(guó)華電器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；Christ ALPHA 2-4 LD plus真空冷凍干燥機(jī)、HG-9040S電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，寧波東南儀器有限公司。

1.5 黃芪水提物的制備

黃芪原藥材切片、干燥、粉碎，過(guò)60目篩后，加入其重量10倍量的蒸餾水，攪拌，沸煮1 h。冷卻后用4層紗布過(guò)濾，收集濾液，重復(fù)沸煮過(guò)濾2次，合并濾液，減壓濃縮。分裝后置于-20℃冰箱過(guò)夜，于冷凍干燥機(jī)內(nèi)凍干，研末過(guò)篩，得黃芪水提物干粉，置于-20℃冰箱備用。

1.6 白靈菇菌種的制備

配置PDA固體培養(yǎng)基，滅菌鍋滅菌90 min后趁熱倒平板，冷卻，待水汽徹底消失后接種白靈菇菌種。培養(yǎng)一段時(shí)間，待其生長(zhǎng)良好時(shí)，收集以供后續(xù)試驗(yàn)使用。

白靈菇深層發(fā)酵母液的制備：配制液體種子培養(yǎng)基，接入活化的白靈菇菌種，28℃下以轉(zhuǎn)速100 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)7 d，得白靈菇深層發(fā)酵母液。

1.7 黃芪水提物對(duì)平板培養(yǎng)白靈菇菌絲體生長(zhǎng)的影響

1.7.1 平板培養(yǎng)

用雙蒸水配制0.2 g·mL-1的黃芪水提物母液備用。在50 mL錐形瓶中分別添加黃芪水提物母液0、0.3 mL、0.6 mL、1.2 mL、1.8 mL、2.4 mL、3.6 mL，再向錐形瓶中加入熱的PDA培養(yǎng)基至24 mL，震蕩搖勻，制成黃芪水提物濃度分別為0、2.5 mg·mL-1、5.0 mg·mL-1、10.0 mg·mL-1、15.0 mg·mL-1、20.0 mg·mL-1、30.0 mg·mL-1的培養(yǎng)基。高壓蒸汽滅菌1.5h，趁熱倒平板，每個(gè)濃度3次重復(fù)。待培養(yǎng)基徹底冷卻，用打孔器取直徑6 mm、活化好的白靈菇菌種，接種于平板。連續(xù)培養(yǎng)6 d后，十字交叉法測(cè)量菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速率。菌絲生長(zhǎng)速率（V，mm·d-1）計(jì)算公式為：

式中：L1為菌落直徑（mm）；L2為接種菌餅直徑（mm）；D為培養(yǎng)天數(shù)（d）。

1.7.2 不同濃度黃芪水體物深層培養(yǎng)白靈菇

錐形瓶中分別加入黃芪水提物濃度為0、2.5 mg·mL-1、5.0 mg·mL-1、10.0 mg·mL-1、15.0 mg·mL-1、20.0 mg·mL-1、30.0 mg·mL-1的液體種子培養(yǎng)基 45 mL，再加入5 mL培養(yǎng)好的白靈菇液體深層發(fā)酵母液，每個(gè)濃度3次重復(fù)。28℃、100 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)7 d后，以3 500 r·min-1轉(zhuǎn)速離心20 min，棄上清。洗瓶搖洗、離心2次，收集沉淀，60℃下干燥至恒重，稱重并計(jì)算菌絲體干重。

1.8 添加黃芪水提物深層培養(yǎng)白靈菇菌絲體的制備

1.8.1 母液制備

按照1.6的方法制備白靈菇深層發(fā)酵母液。

1.8.2 添加黃芪水提物的深層發(fā)酵

精密稱取黃芪水提物干粉，溶解于液體種子培養(yǎng)基中制成50 mg·mL-1的黃芪水提物母液。取4個(gè)錐形瓶，瓶中各裝入80 mL液體種子培養(yǎng)基，2個(gè)作為處理組，2個(gè)作為對(duì)照組。處理組加入10 mL黃芪水提物母液使其濃度達(dá)到5.0 mg·mL-1，對(duì)照組加入10 mL液體種子培養(yǎng)基。蒸汽滅菌，冷卻后每個(gè)錐形瓶中加入10 mL培養(yǎng)好的白靈菇深層發(fā)酵母液，28℃下轉(zhuǎn)速100 r·min-1恒溫振蕩培養(yǎng)7 d。

1.8.3 菌絲體干粉及待測(cè)菌絲體溶液的制備

將1.8.2中培養(yǎng)好的深層發(fā)酵液于3 500 r·min-1離心20 min，棄上清液，洗瓶搖洗、離心2次，將沉淀于60℃干燥至恒重，研末稱重，密封保存于-20℃冰箱。活性成分含量測(cè)定時(shí)，將菌絲體干粉從冰箱取出靜置至室溫后進(jìn)行?？寡趸钚詼y(cè)定前，精密稱取菌絲體干粉1 g，用50%甲醇溶液20 mL浸提1 h，離心收集上清液，制成50.0 mg·mL-1菌絲體初始溶液，再用雙蒸水稀釋成2.5 mg·mL-1、5.0 mg·mL-1、7.5 mg·mL-1、 10.0 mg·mL-1、15.0 mg·mL-1、20.0 mg·mL-1、25.0 mg·mL-1的菌絲體溶液。

1.9 活性成分含量測(cè)定

菌絲體中總皂苷測(cè)定采用濃硫酸-香草醛法[19]，標(biāo)準(zhǔn)品為黃芪甲苷；總黃酮測(cè)定采用硼氫化鈉-四氯苯醌法[20]，標(biāo)準(zhǔn)品為槲皮素；總酚酸測(cè)定采用福林酚法[21]，標(biāo)準(zhǔn)品為沒(méi)食子酸；總多糖測(cè)定采用硫酸-苯酚法[22]，標(biāo)準(zhǔn)品為葡萄糖。

1.10 黃芪水提物對(duì)白靈菇液體發(fā)酵產(chǎn)物抗氧化活性的測(cè)定

1.10.1 DPPH·清除能力的測(cè)定

配制所需濃度的菌絲體待測(cè)溶液。配制25.0 mg·L-1的DPPH溶液。按說(shuō)明書指示添加試劑，搖勻，避光靜置1.5 h，在517 nm處測(cè)定吸光度。DPPH·清除率（E1，%）計(jì)算公式為：

式中：As為加樣品的吸光度值；Ar為未加DPPH溶液的吸光度值；A0為未加樣品的吸光度值。

1.10.2 ·OH清除能力的測(cè)定

配制所需濃度的菌絲體待測(cè)溶液。配制9 mmol·L-1的 FeSO4溶液、9 mmol·L-1的水楊酸-乙醇溶液和 8.8 mmol·L-1的 H2O2（3%） 溶液。取 16支10 mL EP管，先在各管中加入1mL的FeSO4溶液和2 mL水楊酸-乙醇溶液，然后加入樣品2 mL（以雙蒸水作空白對(duì)照），混勻，再加入H2O2溶液2 mL，室溫反應(yīng)1 h，在510 nm處測(cè)其吸光度值?！H清除率（E2，%） 計(jì)算公式為：

式中：A0為空白對(duì)照的吸光度值；As為待測(cè)樣品的吸光度值。

1.10.3 還原力的測(cè)定

配制所需濃度的菌絲體待測(cè)溶液。配制0.2 mol·L-1磷酸緩沖液（pH 6.6）、1%鐵氰化鉀、10%三氯乙酸和0.1%氯化鐵溶液。取21支2.5 mL EP管，在各管中加入0.2 mL菌絲體溶液（以雙蒸水為空白對(duì)照），0.5 mL磷酸緩沖液和0.5 mL鐵氰化鉀溶液，50℃水浴20 min，加0.5 mL三氯乙酸溶液，靜置反應(yīng)20 min，再加入0.5 mL氯化鐵溶液，靜置10 min，測(cè)定在700 nm處吸光值。1.10.4 亞鐵離子螯合能力的測(cè)定

配制所需濃度的菌絲體待測(cè)溶液。配制2 mmol·L-1的 FeCl2溶液和 5 mmol·L-1的亞鐵嗪溶液。先在各管中加入0.5 mL樣品（以雙蒸水作空白對(duì)照） 和0.1 mL FeCl2溶液，混勻后反應(yīng)5 min，然后再加入0.1 mL亞鐵嗪溶液，靜置10 min，測(cè)定562 nm處吸光度值。亞鐵離子螯合率（E3，%）計(jì)算公式為：

式中：A0為空白對(duì)照的吸光度值；As為待測(cè)樣品的吸光度值。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；用SPSS Statistics 20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan’s多重比較檢驗(yàn)各個(gè)處理數(shù)據(jù)間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芪水提物對(duì)白靈菇菌絲生長(zhǎng)的影響

平板培養(yǎng)6 d或深層培養(yǎng)7 d后，黃芪水提物對(duì)白靈菇菌絲的生長(zhǎng)產(chǎn)生不同程度的影響，見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 不同黃芪水提物濃度下白靈菇菌落生長(zhǎng)狀況Fig.1 Growth of Pleurotus tuoliensis mycelia colony cultivated with different concentrations of Astragalus membranaceus extract

圖1中同一列平板表示同一濃度的3次重復(fù)，各處理白靈菇菌落近圓形，菌絲為白色絲狀，添加黃芪水提物對(duì)菌絲顏色無(wú)影響。黃芪水提物濃度為2.5 mg·mL-1?5.0 mg·mL-1時(shí)，菌落直徑和生長(zhǎng)速率隨濃度的升高而增大，濃度為10.0 mg·mL-1?30.0 mg·mL-1時(shí)，菌落直徑和生長(zhǎng)速率隨濃度的升高而減小。黃芪水提物的添加提高了菌絲致密度，并呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。

圖2 不同黃芪水提物濃度下白靈菇菌絲體生長(zhǎng)狀況Fig.2 Growth of Pleurotus tuoliensis mycelia cultivated with different concentrations of Astragalus membranaceus extract

由圖2可見(jiàn)，深層培養(yǎng)7 d后黃芪水提物濃度在 2.5 mg·mL-1?10.0 mg·mL-1范圍內(nèi)能顯著促進(jìn)白靈菇菌絲體生長(zhǎng)，菌絲體干重與對(duì)照差異顯著（P<0.01），在濃度為 15.0 mg·mL-1?20.0 mg·mL-1時(shí)菌絲體干重與對(duì)照差異不顯著（P>0.01），在濃度為30.0 mg·mL-1抑制了菌絲體生長(zhǎng)，菌絲體干重顯著低于對(duì)照（P<0.01）。白靈菇菌絲體干重在黃芪水提物添加量為5.0 mg·mL-1時(shí)最大，在添加量為10.0 mg·mL-1時(shí)次之。由此可見(jiàn)，黃芪水提物在低濃度水平促進(jìn)白靈菇菌絲體生長(zhǎng)，在高濃度水平則會(huì)抑制其生長(zhǎng)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，在黃芪水提物添加濃度為5.0 mg·mL-1時(shí)，白靈菇生長(zhǎng)速率和菌絲體干重最大，因此本研究采用5.0 mg·mL-1作為后續(xù)白靈菇液體發(fā)酵基質(zhì)中黃芪水提物的添加濃度。

2.2 白靈菇菌絲體的活性成分含量變化

添加黃芪水提物對(duì)白靈菇深層發(fā)酵菌絲體活性成分含量的影響見(jiàn)表1。

表1 白靈菇深層發(fā)酵菌絲體活性成分含量Tab.1 Contents of active compounds of Pleurotus tuoliensis mycelia in submerged fermentation

由表1可見(jiàn)，添加黃芪水提物深層發(fā)酵后，白靈菇菌絲體內(nèi)各活性成分含量均有不同程度的提高。其中，總皂苷的增加最為明顯，其次為總黃酮和胞外多糖，說(shuō)明黃芪水提物對(duì)這些成分的影響較大。相比之下，添加黃芪水提物深層發(fā)酵后白靈菇胞內(nèi)多糖和總酚酸的增加量較小。

2.3 黃芪水提物對(duì)深層培養(yǎng)白靈菇菌絲體的抗氧化活性的影響

黃芪水提物對(duì)深層培養(yǎng)白靈菇菌絲體DPPH·清除能力的影響見(jiàn)圖3。

如圖3所示，白靈菇菌絲體對(duì)DPPH·的清除率表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。常規(guī)深層發(fā)酵白靈菇菌絲體（B0）與添加黃芪水提物深層發(fā)酵的白靈菇菌絲體（B1），清除DPPH·的50%效應(yīng)濃度（EC50）分別為 17.45 mg·mL-1和 14.69 mg·mL-1。在菌絲體濃度為 2.5 mg·mL-1?7.5 mg·mL-1時(shí)，B1 與B0 的 DPPH·清除率無(wú)顯著差異（P>0.05），在菌絲體濃度為12.5 mg·mL-1?25.0 mg·mL-1時(shí)，二者DPPH·的清除率出現(xiàn)顯著差異（P<0.05），其中在菌絲體濃度為25 mg·mL-1時(shí)差異最大，B1是對(duì)照B0的1.19倍，表明培養(yǎng)基中添加黃芪水提物發(fā)酵可顯著促進(jìn)白靈菇菌絲體DPPH·的清除能力。

圖3 添加黃芪水提物深層發(fā)酵后白靈菇菌絲體對(duì)DPPH·自由基的清除率Fig.3 DPPH·scavenging activity of Pleurotu stuoliensis mycelia cultivated with Astragalus membranaceus extract

黃芪水提物對(duì)深層培養(yǎng)白靈菇菌絲體·OH清除能力的影響見(jiàn)圖4。

如圖4所示，常規(guī)深層發(fā)酵白靈菇菌絲體（B0）和添加黃芪水提物深層發(fā)酵白靈菇子實(shí)體（B1） 均對(duì)·OH有一定的清除能力，其清除率隨著濃度的增加而變大。B0和B1清除·OH的EC50值分別為9.27 mg·mL-1和 7.33 mg·mL-1。在菌絲體濃度為 10.0 mg·mL-1?25.0 mg·mL-1時(shí)，B1對(duì)·OH的清除率與對(duì)照B0相比顯著提高（P<0.05），在菌絲體濃度為12.5 mg·mL-1時(shí)差異最大，B1達(dá)到B0的1.26倍，說(shuō)明黃芪提取物的添加可顯著提高深層發(fā)酵白靈菇菌絲體對(duì)·OH的清除能力。

圖4 添加黃芪水提物深層發(fā)酵后白靈菇菌絲體對(duì)·OH的清除率Fig.4 OH·scavenging activity of Pleurotu stuoliensis mycelia cultivated with Astragalus membranaceus extract

黃芪水提物對(duì)深層培養(yǎng)白靈菇菌絲體還原力的影響見(jiàn)圖5。

從圖5可見(jiàn)，隨著菌絲體濃度的增加，還原反應(yīng)體系吸光度值逐漸增加，呈一定的量效關(guān)系。吸光度值為0.5時(shí)，常規(guī)深層發(fā)酵白靈菇菌絲體（B0）和添加黃芪水提物深層發(fā)酵白靈菇子實(shí)體（B1） 的濃度分別為8.30 mg·mL-1和 6.24 mg·mL-1。在菌絲體濃度為 2.5 mg·mL-1?15.0 mg·mL-1時(shí)，B1 與 B0 的還原力出現(xiàn)顯著差異（P<0.05），其中在濃度為15.0 mg·mL-1時(shí)差異最大，B1的還原力達(dá)到B0的1.23倍。可見(jiàn)，黃芪提取物深層發(fā)酵可顯著提高白靈菇菌絲體的還原力。

圖5 添加黃芪水提物深層發(fā)酵后白靈菇菌絲體的還原力Fig.5 Deoxiding activity of Pleurotu stuoliensis mycelia cultivated with Astragalus membranaceus extract

黃芪水提物對(duì)深層培養(yǎng)白靈菇菌絲體亞鐵離子螯合能力的影響見(jiàn)圖6。

如圖6所示，常規(guī)深層發(fā)酵白靈菇菌絲體（B0）和添加黃芪水提物深層發(fā)酵白靈菇子實(shí)體（B1）均具有較強(qiáng)的亞鐵離子螯合能力，并表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。B0和B1的Fe2+螯合EC50值分別為4.84 mg·mL-1和3.13 mg·mL-1。試驗(yàn)菌絲體濃度范圍內(nèi)，黃芪提取物可顯著提高白靈菇的亞鐵離子螯合能力（P<0.05），其中在濃度為12.5 mg·mL-1時(shí)差異最大，B1達(dá)到B0的1.15倍，說(shuō)明添加黃芪水提物可顯著提高深層發(fā)酵白靈菇菌絲體亞鐵離子的螯合能力。

圖6 添加黃芪水提物深層發(fā)酵后白靈菇菌絲體的亞鐵離子螯合率Fig.6 Ferrochelatation activity of Pleurotu stuoliensis mycelia cultivated with Astragalus membranaceus extract

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪水提物的添加可影響深層發(fā)酵白靈菇菌絲體的生長(zhǎng)。在濃度為2.5 mg·mL-1?15.0 mg·mL-1時(shí)，黃芪水提物對(duì)白靈菇菌絲體的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用；在濃度升至30 mg·mL-1時(shí)，黃芪水提物對(duì)其菌絲體的生長(zhǎng)有抑制作用?；谄桨迮囵B(yǎng)和深層發(fā)酵結(jié)果，黃芪水提物濃度為5 mg·mL-1時(shí)對(duì)白靈菇菌絲體的生長(zhǎng)促進(jìn)作用最強(qiáng)，這與張勁松等的結(jié)論一致[10]。孟麗等[9]的研究結(jié)果表明阿魏、防風(fēng)、柴胡、前胡浸出液都能促進(jìn)白靈菇菌絲的生長(zhǎng)發(fā)育，并且中藥浸出液的濃度不同，對(duì)菌絲生長(zhǎng)發(fā)育的影響也不同，在低濃度時(shí)促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)，本試驗(yàn)也得出類似結(jié)果。孟麗等[9]還發(fā)現(xiàn)，盡管隨著濃度增加，中藥浸出液對(duì)白靈菇菌絲生長(zhǎng)的促進(jìn)作用隨之減弱，但未出現(xiàn)抑制作用。而本試驗(yàn)中，在濃度升至30.0 mg·mL-1時(shí)，黃芪水提物對(duì)白靈菇菌絲體的生長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著的抑制作用，表現(xiàn)為菌落直徑和菌絲體干重的減小。這種差異可能是由于試驗(yàn)采用的中藥材種類和提取物制備方法的不同造成，也可能與白靈菇品種的不同有關(guān)。不同中藥材在不同濃度對(duì)白靈菇菌絲生長(zhǎng)發(fā)育的影響及其機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。

目前中藥材對(duì)白靈菇深層發(fā)酵活性物質(zhì)含量影響的報(bào)道較少，僅李赟等[11]研究了黨參提取液對(duì)深層發(fā)酵白靈菇多糖含量的影響，結(jié)果表明黨參水提取液的添加對(duì)白靈菇生物量及胞外多糖、胞內(nèi)多糖含量均有促進(jìn)作用，以黨參水提取液濃度為50.0 mg·mL-1效果最顯著。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，深層發(fā)酵培養(yǎng)基中黃芪水提物濃度為5.0 mg·mL-1時(shí)，白靈菇菌絲體中的活性成分含量顯著增加，其胞外多糖、胞內(nèi)多糖、總酚酸、總黃酮和總皂苷含量分別為對(duì)照的1.82倍、1.53倍、1.46倍、2.27倍和3.15倍。這些結(jié)果表明培養(yǎng)基質(zhì)中添加中藥材對(duì)深層發(fā)酵白靈菇活性物質(zhì)的含量具有提升效果。

近年來(lái)對(duì)深層發(fā)酵冬生多孔菌、海鮮菇、香菇、茶樹(shù)菇等食藥用菌的抗氧化活性的研究方興未艾[23-24]，也有學(xué)者研究了白靈菇多糖和子實(shí)體的抗氧化作用[11，25]，但中藥材尤其是黃芪對(duì)深層發(fā)酵白靈菇菌絲抗氧化活性的影響目前未見(jiàn)報(bào)道。本研究中試驗(yàn)結(jié)果表明添加5 mg·mL-1黃芪水提物進(jìn)行深層發(fā)酵后，白靈菇菌絲體的DPPH·清除率、·OH清除率、還原力和亞鐵離子螯合率最高分別達(dá)到對(duì)照菌絲體的1.47倍、1.26倍、1.67倍和1.42倍，說(shuō)明黃芪水提物的添加可顯著提升白靈菇深層發(fā)酵菌絲體的抗氧化活性。

通過(guò)研究添加中藥材黃芪對(duì)白靈菇深層發(fā)酵菌絲體生長(zhǎng)的促進(jìn)作用，以及對(duì)活性成分含量和抗氧化活性的提升效果，可推動(dòng)白靈菇這一食藥兩用珍稀真菌的研究和新產(chǎn)品研發(fā)。