邢軍超 張一南 石 焱 李金鑫 李 敏 申宛娜 王 黎 趙嘉平

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所 北京 100091； 2.國家林業(yè)和草原局管理干部學(xué)院 北京 102600；3.中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 北京 100091)

全球氣候變暖變化背景下，干旱、高溫以及輻射等非生物脅迫對樹木生長產(chǎn)生影響(Bernaletal.， 2015； Ruehretal.， 2016； Saikietal.， 2017)，而目前與氣候相關(guān)的林木病原菌、害蟲以及其他森林有害生物對樹木影響的研究相對匱乏。楊樹(Populus)腐爛病和潰瘍病是分別由弱寄生性菌污黑腐皮殼菌(Valsasordida)和葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)引起的枝干真菌病害，這2種林木病害對于我國的楊樹人工林造成了嚴(yán)重的破壞(呂全等， 2003； 梁軍等， 2003)。楊樹腐爛病和潰瘍病的病原物生物學(xué)特性、病害的侵染流行與監(jiān)測、寄主植物與病菌互作的分子機(jī)制等已有大量研究(呂全等， 2003； 梁軍等， 2003)，而對病害發(fā)生的病理生理學(xué)機(jī)制研究較少。

光合作用是植物最重要的生理過程之一，干旱、高溫、鹽以及病害等逆境脅迫下植物光合作用會顯著降低、生長放緩甚至出現(xiàn)植物死亡現(xiàn)象(Reddyetal.， 2004； Moradietal., 2007； Clemenzetal.， 2008； Mathuretal.， 2014)。樹木潰瘍類病害雖然主要發(fā)生于枝干韌皮部并最終在侵染點周圍形成壞死性病斑，但同時潰瘍類病害也通常會造成林木冠層枝枯、枯萎以及死亡(呂全等， 2003； 梁軍等， 2003)。枝干潰瘍類病害顯著改變寄主植物的光合特征(Rohrs-Richeyetal.， 2011； Cerqueiraetal.， 2017)，枝干潰瘍病菌(Quambalariacoyrecup)侵染美葉桉(Corymbiacalophylla)后期(110～140 天)，葉片凈光合速率與氣孔導(dǎo)度均顯著降低(Hossainetal.， 2019)。筆者課題組前期研究表明潰瘍病菌、腐爛病菌侵染中后期(20、25、30 天)，新疆楊葉片凈光合速率和氣孔導(dǎo)度顯著下降(Lietal., 2019)。但也有研究表明，在黑腐皮殼屬真菌(V.melanodiscus)菌株侵染早期(2周前)，寄主植株阿拉斯加矮榿木(Alnusfruticosa)出現(xiàn)光合速率上調(diào)的現(xiàn)象(Rohrs-Richeyetal.， 2011)。因此，深入研究樹木枝干潰瘍類病菌與寄主植物的光合及氣體交換特征的關(guān)系仍然具有重要的病理生理學(xué)意義。

新疆楊(Populusalbavar.pyramidalis)屬白楊派，為我國西北地區(qū)優(yōu)良的綠化和防護(hù)林樹種，并作為防護(hù)林首選樹種廣泛栽培于我國西北干旱地區(qū)。林間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，楊樹枝干病害尤其是新疆楊、胡楊(Populuseuphratica)等楊樹的腐爛病害在我國內(nèi)蒙古、寧夏、新疆等省區(qū)以及東北地區(qū)普遍發(fā)生且危害嚴(yán)重。本研究采用楊樹腐爛病、楊樹潰瘍病試驗體系，通過對病菌侵染早期新疆楊光合作用及氣體交換特征、葉綠素?zé)晒獾忍卣鞯姆治觯瑪M闡明基于光合作用的楊樹腐爛病、楊樹潰瘍病的病理生理學(xué)機(jī)制，并揭示2種病害病理生理學(xué)機(jī)制的差別。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1年生新疆楊扦插苗于中國林業(yè)科學(xué)研究院科研溫室栽培生長30天，轉(zhuǎn)移至含有混合基質(zhì)(草炭土∶ 珍珠巖=6∶1)的塑料花盆(上徑19 cm ×下徑17 cm ×高21 cm)中，培養(yǎng)于中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所植物生理研究室試驗地。 腐爛病菌V.sordida菌株CZC(NCBI登錄號： rRNA-ITs序列，MK994101； EF1α基因，MN025273)和潰瘍病菌B.dothidea菌株CZA(NCBI 登錄號: rRNA-ITs序列，MK990559； EF1α 基因，MN025271)(Lietal.， 2019)保存于中國林科院林業(yè)新技術(shù)研究所植物生理實驗室。菌株活化后于PDA培養(yǎng)基(pH6.0)、25 ℃黑暗培養(yǎng)7天后接種新疆楊。

1.2 試驗設(shè)計

筆者前期實驗證明，表皮環(huán)割對照與未處理對照對新疆楊光合及氣體交換特征、葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)以及非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量等特征沒有影響，為簡化試驗體系，本研究設(shè)置2個不同處理，分別為表皮環(huán)割接種V.sordida(Vso)、表皮環(huán)割接種B.dothidea(Bdo)，并以表皮環(huán)割接種PDA(Ctrl)作為對照。20株1年生新疆楊健康植株隨機(jī)分為2組，測定各組植株的初始光合指標(biāo)，于第2天上午9：00開始接種處理。接種時，預(yù)先用75%酒精對接種點進(jìn)行滅菌處理，然后用鋒利刀片沿新疆楊植株莖干距基部30 cm處輕輕切掉一層外表皮，使其露出淺綠色的韌皮部。再將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的病原菌菌絲體切成1 cm寬的菌塊，菌絲體面向韌皮部，沿植株切口環(huán)繞一周，去除多余菌塊，最后用封口膜纏繞使其固定。本試驗采用空白PDA培養(yǎng)基接種作為對照，其余均與接種處理相同。選取每株幼苗自頂部向下第4～6片健康成熟葉，測定接種后0、3、5、7和9天的氣體交換指標(biāo)和葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)。試驗期間每天18:00—19:00灌水，保證所有植株充分灌水。

1.3 測定指標(biāo)

1.3.1 光合指標(biāo)測定 選擇晴朗無云的天氣，采用Li-6400XT便攜式光合測定系統(tǒng)分析儀(LI-COR，Lincoln，USA)測定苗木在不同處理下的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)等光合特性指標(biāo)。測定時采用LED紅藍(lán)光源，光合有效輻射(PAR)設(shè)定為1 500 μmol·m-2s-1，環(huán)境CO2濃度為400 μmol·mol-1左右，氣體流速設(shè)定為500 μmol·s-1。測定時間為上午9:00—11:00，處理及對照均為7個生物學(xué)重復(fù)。

根據(jù)測定結(jié)果，計算水分利用效率(WUE)和氣孔限制值(Ls)。具體計算公式如下：

水分利用效率： WUE=Pn/Tr；

氣孔限制值：Ls=1-Ci/Ca。

式中，Ca為空氣中CO2濃度。

電子傳遞速率： ETR=ΦPSⅡ×0.5×0.84；

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用R3.5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計以及數(shù)據(jù)可視化分析，處理與對照之間的差異采用獨立樣本T檢驗，顯著差異檢驗水平為P<0.05，極顯著差異檢驗水平為P<0.01，各項統(tǒng)計數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。本研究對Gs、Ci與Pn作相關(guān)性分析，Pn與Gs相關(guān)性分析采用非線性回歸擬合(Lpezetal.， 2015)，其他參數(shù)之間的相關(guān)性采用線性回歸擬合，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 光合作用與氣體交換指標(biāo)

腐爛病菌接種后3～9天，新疆楊葉部凈光合速率(Pn)和氣孔導(dǎo)度(Gs)(3～9天)顯著降低，造成胞間CO2濃度(Ci)的顯著升高(接種后3～7天)； 除第9天外，腐爛病菌接種顯著降低氣孔限制值(Ls)(P<0.05)(圖1)，說明腐爛病菌主要以非氣孔限制方式抑制新疆楊光合速率。潰瘍病菌接種處理顯著降低新疆楊葉片Pn和Gs(接種3～9天)，Ci(接種5～7天)，但顯著升高Ls(接種3～9天)(P<0.05)(圖2)，該結(jié)果說明氣孔因素是潰瘍病菌脅迫下新疆楊Pn降低的主要原因。

圖1 腐爛病菌脅迫對新疆楊光合特征的影響Fig.1 The photosynthetic characteristics of P. alba var. pyramidalis infected by pathogen V. sordida(Vso)A： 凈光合速率(Pn)； B： 氣孔導(dǎo)度(Gs)； C： 胞間CO2濃度(Ci)； D： 氣孔限制值(Ls)。A: Net photosynthetic rate(Pn); B: Stomatal conductance(Gs); C: Intercellular CO2 concentration(Ci); D: Limiting value of stomata(Ls).

圖2 潰瘍病菌脅迫對新疆楊光合特征的影響Fig.2 The photosynthetic characteristics of P. alba var. pyramidalis infected by pathogen B. dothidea(Bdo)

2.2 蒸騰速率和水分利用效率

腐爛病菌接種顯著降低新疆楊葉片的蒸騰速率(Tr)(接種后5～7天)和水分利用效率(WUE)(接種3～7天)(P<0.05)。潰瘍病菌脅迫下新疆楊Tr顯著下降(P<0.05)，但其降幅(40%～57%)遠(yuǎn)小于腐爛病菌對新疆楊Tr的抑制作用(71%～82%)； 并且潰瘍病菌侵染對新疆楊WUE沒有影響(接種后3～9天)(P>0.05)(圖3)，說明潰瘍病菌侵染并未對新疆楊水分利用效率造成不利影響。

圖3 病菌脅迫對新疆楊蒸騰速率和水分利用效率的影響Fig.3 The effects of pathogen inoculations on transpiration rate and water use efficiency of P. alba var. pyramidalisA和C表示腐爛病菌脅迫下的蒸騰速率(Tr)及水分利用效率(WUE)； B和D表示潰瘍病菌脅迫下的蒸騰速率(Tr)及水分利用效率(WUE)。 A and C respectively represent transpiration rate(Tr) and water use efficiency(WUE) under the stress of V. sordida(Vso).Band D respectively represent Tr and WUE under the stress of B. dothidea (Bdo).

2.3 葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)

腐爛病菌侵染下，新疆楊葉片最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)顯著降低19.5%～41.2%(P<0.01)，葉片PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率(ΦPSⅡ)下降22.0%～62.5%(P<0.001)，電子傳遞速率(ETR)下降50.4%～63.4%(P<0.001)(圖4)，這表明腐爛病菌可能通過對光合鏈電子傳遞進(jìn)程的抑制改變光合作用速率。此外，腐爛病菌侵染下，植株光化學(xué)淬滅系數(shù)(qp)下降21.2%～56.0%(P<0.001)，說明脅迫條件下新疆楊葉片天線色素捕獲的光能用于光合碳同化的份額減少。

圖4 腐爛病菌脅迫對新疆楊葉綠素?zé)晒馓卣鞯挠绊慒ig.4 The chlorophyll fluorescence characteristics of P. alba var. pyramidalis infected by pathogen V. sordidaA： 最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)； B： 實際光化學(xué)效率(ΦPSⅡ)； C： 電子傳遞速率(ETR)； D： 光化學(xué)淬滅系數(shù)(qp)。數(shù)據(jù)為7次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，P值表示顯著性差異水平。下同。A: The maximum photochemical efficiency(Fv/Fm); B:Actual photochemical efficiency(ΦPSⅡ); C: Electron transport rate(ETR); D:Photochemical quenching coefficient(qp).Data are the mean± standard error of 7 replicates.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.The P-value represents the level of significant differences.The same below.

圖5 潰瘍病菌脅迫對新疆楊葉綠素?zé)晒馓卣鞯挠绊慒ig.5 The chlorophyll fluorescence characteristics of P. alba var. pyramidalis infected by pathogen B. dothidea

潰瘍病菌接種造成新疆楊葉片F(xiàn)v/Fm、ΦPSⅡ、ETR和qp顯著降低(接種后3～9天)(P<0.01)(圖5)。然而，與對照相比，F(xiàn)v/Fm降幅很小(約為1%)，且始終維持在Bj?rkman等(1987)提出的健康植株的閾值范圍內(nèi)(0.75～0.85)。此外，潰瘍病菌降低新疆楊葉片PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率(ΦPSⅡ)12.5%～29.4%，降低電子傳遞速率(ETR)16.2%～29.5%，降低光化學(xué)淬滅系數(shù)9.7%～22.0%，但其降幅均小于腐爛病菌的抑制作用，表明腐爛病菌對新疆楊葉片光合機(jī)構(gòu)的損傷更為嚴(yán)重。

2.4 病原真菌脅迫下新疆楊光合指標(biāo)之間的相關(guān)性

腐爛病菌和潰瘍病菌脅迫下新疆楊葉片Pn與Gs均呈顯著非線性正相關(guān)(圖6A、B)。潰瘍病菌脅迫下Ci與Pn表現(xiàn)為線性正相關(guān)(圖6D)； 然而，腐爛病菌處理下Pn與Ci不具線性相關(guān)(圖6C)。回歸分析顯示，潰瘍病菌處理植株、2個對照組植株的Gs與Ci指標(biāo)呈線性正相關(guān)，其回歸曲線的斜率幾乎相同(0.002和0.003)，顯示潰瘍病菌侵染不改變感病新疆楊植株的Gs-Ci關(guān)系，因此，Ci隨Gs的降低而降低。腐爛病菌處理植株的Gs水平極低(0.02～0.09 mmolH2O·m-2s-1)，但Ci水平異常增加(350～420 μmolCO2·mol-1)并顯著超過未受脅迫植株，回歸分析表明Ci與Gs無關(guān)(圖7)，即腐爛病菌顯著改變了感病新疆楊植株的Gs-Ci關(guān)系。

圖6 葉片氣孔導(dǎo)度和胞間CO2濃度與凈光合速率的相關(guān)性Fig.6 Correlations between leaf stomatal conductance, intercellular CO2 concentration and net photosynthetic rateA和C表示腐爛病菌脅迫下凈光合速率與氣孔導(dǎo)度以及胞間CO2的相關(guān)性； B和D表示潰瘍病菌脅迫下凈光合速率與氣孔導(dǎo)度以及胞間CO2的相關(guān)性。A and C respectively represent the correlations between leaf stomatal conductance(Gs), intercellular CO2 concentration(Ci) and net photosynthetic rate (Pn)under the stress of V. sordida. B and D respectively represent the correlations between leaf stomatal conductance(Gs), intercellular CO2 concentration(Ci) and net photosynthetic rate(Pn) under the stress of B. dothidea.

圖7 葉片胞間CO2濃度與氣孔導(dǎo)度之間的相關(guān)性Fig.7 Correlations between leaf intercellular CO2concentration and stomatal conductance

3 討論

光合作用是植物最為重要的生理進(jìn)程之一，其速率、強(qiáng)度受到內(nèi)外環(huán)境因素的精密調(diào)控。氣孔是植物葉部組織表面的氣體和水分交換的通道，氣孔開度直接影響CO2的攝入，進(jìn)而影響胞內(nèi)組織的CO2濃度以及光合作用速率(Lawsonetal., 2019)。除此之外，植物光系統(tǒng)的生化活性(Niuetal.， 2014)、葉片葉肉導(dǎo)度(Flexasetal.， 2004； Galleetal.， 2009； Nogueira Júnioretal.， 2017)等均會影響光合反應(yīng)底物的濃度并進(jìn)而改變光合作用速率，因此，植物光合作用速率受到氣孔及非氣孔2種因素的制約(Stewartetal.，1995)。進(jìn)一步研究表明，逆境脅迫(如干旱、鹽脅迫)對植物光合作用的抑制存在由氣孔限制向非氣孔限制類型轉(zhuǎn)換的現(xiàn)象(惠紅霞等， 2004； 付士磊等， 2006)。光合速率受氣孔限制還是非氣孔限制，取決于胞間CO2濃度(Ci)和氣孔限制值(Ls)變化的方向，并且主要依賴于Ci的變化方向(Farquharetal., 1982)。本研究中，潰瘍病菌處理引起Pn、Gs、Ci下降，而Ls上升(圖2)，因此，氣孔因素可能是潰瘍病菌脅迫下新疆楊光合速率降低的主要原因。在腐爛病菌中，Pn、Gs下降的同時，由于Ci增加，Ls下降(圖1)，因此，腐爛病菌脅迫下新疆楊葉片光合速率降低的主要原因為非氣孔因素。

植物病害中，病原真菌等通過分泌毒素或者次生代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)氣孔開度(Heiseretal.，1998)，然而病菌影響胞間CO2濃度的報道較少。病原真菌通常表現(xiàn)為氣孔關(guān)閉活性(Hossainetal.， 2019； Wilmer， 1996)。作為CO2攝入的通道，氣孔關(guān)閉導(dǎo)致胞間CO2濃度的降低(Pradhanetal.， 2015)，但也有研究表明病菌侵染增加Ci(Nogueira Júnioretal.， 2017； Zhaoetal.， 2011)，或者不影響寄主植物葉片的Ci(Yinetal., 2018)。在干旱脅迫下，隨著Gs的降低，葉片Ci顯著降低； 當(dāng)Gs達(dá)到極低水平時，最大光化學(xué)效率Fv/Fm快速降低，顯示葉部光合作用受到強(qiáng)烈的非氣孔限制，最終Ci隨著Gs接近最小值而增加，這可能是不可逆光抑制的開始(Brodribb,1996)。有研究表明，病原真菌會破壞或者抑制Rubsico酶活性，降低Pn并同時造成胞間CO2的積累(Muthuchelianetal.， 2005)。本研究中，腐爛病菌侵染植株的Gs處于極低水平，顯示氣孔接近完全關(guān)閉； 與此同時，F(xiàn)m/Fv和ΦPSⅡ顯示葉肉組織光合活性受到顯著抑制(圖4)，因此，腐爛病菌對光系統(tǒng)Ⅱ的不可逆抑制以及對Rubsico酶活性的抑制可能是導(dǎo)致胞間CO2增加的主要原因。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)是評價植物葉片光合機(jī)構(gòu)是否受損的重要指標(biāo)。相比光合指標(biāo)，葉綠素?zé)晒庵笜?biāo)可以更靈敏地反映光合機(jī)構(gòu)的健康狀況(Bj?rkmanetal., 1987； Krauseetal., 1991)。有研究認(rèn)為最大光化學(xué)效率Fv/Fm為0.75～0.85可以作為植物健康或者未受到生物脅迫的標(biāo)志(Bj?rkmanetal., 1987)。本研究中，腐爛病菌侵染顯著降低新疆楊Fv/Fm(圖4A)，說明新疆楊受到腐爛病菌脅迫。潰瘍病菌脅迫下，雖然Pn、Gs、Tr、Ci以及ETR、ΦPSⅡ、qp等指標(biāo)的顯著下調(diào)(圖2； 圖4)表明新疆楊正在遭受潰瘍病菌脅迫，但Fv/Fm降幅極小(約為1%)，仍然處于未接種健康植株的Fv/Fm值區(qū)間。本研究結(jié)果表明，最大光化學(xué)效率Fv/Fm為0.75～0.85并不能作為植物未受到環(huán)境脅迫的確切標(biāo)準(zhǔn)，或者至少不能作為判斷氣孔限制類型病害或者處于氣孔限制階段的植物病害發(fā)生的確切標(biāo)準(zhǔn)。

4 結(jié)論

最大光化學(xué)效率Fv/Fm并不能準(zhǔn)確反映植物遭受的所有生物脅迫，F(xiàn)v/Fm為0.75～0.85不能作為植物未受到環(huán)境脅迫的確切標(biāo)準(zhǔn)。楊樹腐爛病、潰瘍病發(fā)生早期，新疆楊氣體交換及葉綠素?zé)晒鈪?shù)特征具有顯著差別。相比較于潰瘍病菌，腐爛病菌脅迫對新疆楊光合作用具有更大的抑制作用，腐爛病菌顯著降低而潰瘍病菌脅迫不改變新疆楊葉片水分利用效率，這可能是腐爛病害比潰瘍病害更易于在干旱地區(qū)發(fā)生以及在該地區(qū)腐爛病害危害更為嚴(yán)重的重要生理原因。