李 錚，王順祥，2，方建華，谷科城，吳兆杰

（1.陸軍勤務(wù)學(xué)院，重慶 401331；2.中國地質(zhì)調(diào)查局 應(yīng)用地質(zhì)研究中心，四川 成都610036）

發(fā)光細(xì)菌是一種非致病性的兼性好氧生物，革蘭氏染色呈陰性，多分布于海水中，與海洋中發(fā)光蜉蝣生物相似，能夠引起海面的發(fā)光。目前，國內(nèi)外已經(jīng)命名的發(fā)光細(xì)菌屬[1]主要有：發(fā)光異短桿菌屬、發(fā)光桿菌屬、希瓦氏菌屬、弧菌屬。我國常用其中3 種發(fā)光細(xì)菌分別是發(fā)光桿菌屬中的明亮發(fā)光桿菌、弧菌屬中的青?；【唾M(fèi)氏弧菌，其中明亮發(fā)光桿菌和費(fèi)氏弧菌都為海洋細(xì)菌，而青?；【鸀榈?xì)菌。

發(fā)光細(xì)菌產(chǎn)生的可見熒光實際上是生物本身的一種代謝過程。在正常情況下，活菌體內(nèi)含有熒光酶、三磷酸腺苷（ATP）以及黃素單核苷酸等發(fā)光要素。發(fā)光細(xì)菌在進(jìn)行新陳代謝過程中，在有氧以及細(xì)胞內(nèi)熒光酶的催化條件下，能把還原態(tài)的黃素單核苷酸（FMNH2）和脂肪醛類物質(zhì)同時轉(zhuǎn)化為熒光素（FMN）和脂肪酸類物質(zhì)，同時釋放出可見藍(lán)綠色熒光。其反應(yīng)過程如下：

發(fā)光細(xì)菌在進(jìn)行發(fā)光過程中極易受到外界的干擾，特別是當(dāng)存在毒性物質(zhì)時，會直接抑制熒光酶的活性或者干擾發(fā)光細(xì)菌的代謝過程[2]，因此，在一定條件下，利用發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光程度可以檢測到物質(zhì)的毒性強(qiáng)弱。目前，國內(nèi)已經(jīng)將發(fā)光細(xì)菌法測急性毒性試驗廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥污染和水質(zhì)污染等各種環(huán)境檢測中[3,4]。

本文參照國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)以及標(biāo)準(zhǔn)[5-7]，利用發(fā)光細(xì)菌法對礦物基礎(chǔ)油的急性生態(tài)毒性大小作了評價。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

選用我國潤滑油生產(chǎn)過程中常用的12 種礦物基礎(chǔ)油為研究對象，進(jìn)行急性生態(tài)毒性評價。礦物基礎(chǔ)油有以下幾種：I 類礦物基礎(chǔ)油：150SN、400SN、600SN；II 類礦物基礎(chǔ)油：150N、400N、26 號中間基、680 號中間基、KN4006、KN4008、KN4010；III 類礦物基礎(chǔ)油：150N、400N，均由深圳市華美特潤滑科技有限公司提供。

NaCl、ZnSO·47H2O 均為分析純，成都市科龍試劑廠；發(fā)光菌凍干粉（Vibrio fischeri，NRRL B-11177，浙江托科司生物技術(shù)有限公司）。

微孔板型多功能檢測儀（Glomax Multi，Promega Co）；細(xì)胞培養(yǎng)板（96 孔，Corning/Costar Co）；85-2 型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）；BL22-500A 型超聲波清洗器（上海比郎儀器公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 費(fèi)氏弧菌的復(fù)蘇 稱取30g NaCl 倒入燒杯中，溶解后倒入1L 容量瓶中，然后加入超純水定容至1L，得3% NaCl 溶液，儲存?zhèn)溆茫环Q取20g NaCl倒入燒杯中，溶解后倒入1L 容量瓶中，然后加入超純水定容至1L，得2% NaCl 溶液，儲存在4℃冰箱備用。將保存在-20℃冰箱中的一支費(fèi)氏弧菌發(fā)光細(xì)菌凍干粉的安瓿瓶和冷的2% NaCl 溶液取出，放入含有冰塊的燒杯中，用注射器取1.0mL 的2% NaCl 溶液注入發(fā)光細(xì)菌安瓿瓶中，搖動安瓿瓶，確?；旌暇鶆?，復(fù)蘇等待10min 至發(fā)光穩(wěn)定，并且發(fā)光強(qiáng)度要達(dá)到100 萬光子數(shù)，此時表明菌液合格，否則重新更換復(fù)活菌液。

1.2.2 樣品前處理方法 為了模擬自然生態(tài)環(huán)境中油品對水域的典型污染狀況，通過制備基礎(chǔ)油的水融合部分WAF 來測定急性毒性，以采用半數(shù)效應(yīng)載荷率（Effect Load 50, 簡稱EL50）作為急性生態(tài)毒性的評定參數(shù)[8]。其中EL50指的是能引起一半響應(yīng)生物的某種效應(yīng)發(fā)生變化的溶液中試驗材料的負(fù)載率（加入的難溶物質(zhì)質(zhì)量與溶液介質(zhì)體積之比）。該前處理方法獲得的測試數(shù)據(jù)可作為多組分供試物的整體毒性數(shù)據(jù)來使用[9]，有學(xué)者已經(jīng)將此法用于魚類和藻類等水生生物的生態(tài)毒性試驗[10]。

本文選用費(fèi)氏弧菌作為受試生物。費(fèi)氏弧菌是海洋細(xì)菌，研究表明，在土壤石油污染及其毒性評價中，費(fèi)氏弧菌對比明亮發(fā)光桿菌和青?；【瑥?fù)活能力更好，發(fā)光性能更穩(wěn)定、且污染響應(yīng)值更寬。由于費(fèi)氏弧菌屬于海洋發(fā)光細(xì)菌，因此，本文制備WAF溶液均采用含有3% NaCl 的超純水作為其水溶液。制備WAF 過程中，攪拌的細(xì)節(jié)等對溶液的影響很大。首先，攪拌的速度需控制好，保證溶液旋渦深度為試液高度的10%~30%，因此，數(shù)顯恒溫加熱磁力攪拌器設(shè)置攪拌速度在800~1200r·min-1范圍內(nèi)，此時旋渦深度合適；其次，為了保證油品和NaCl 溶液充分混合并且保證有足夠的接觸時間，需要確定適當(dāng)?shù)臄嚢钑r間，隨著攪拌時間加長，溶液中油品含量增加，但是增量會漸漸平緩達(dá)到飽和。根據(jù)Girling,A E 等人對于石油產(chǎn)品水生生物毒性測試的一些建議和實際經(jīng)驗表明[11]，通常攪拌24h，靜置沉淀1h，就可以實現(xiàn)這一目標(biāo)。綜合以上因素，本文WAF 制備條件設(shè)置為：溫度25℃，攪拌速度設(shè)置為900r·min-1，攪拌時間24h，然后靜置沉淀1h。

1.2.3 試驗操作步驟

1.2.3.1 制備WAF 溶液 將1L 3%的NaCl 溶液倒入2.5L 龍頭瓶中，再從溶液頂部緩慢倒入待測油品；然后在容器上蓋上箔紙或非反應(yīng)的覆蓋物，在攪拌速度為900r·min-1條件下開始攪拌24h，充分混合使待測物質(zhì)在溶液中盡量溶解或者均勻分散，旋渦深度為試液高度的10%~30%，目的是防止乳化；攪拌完成后靜置1h；靜置結(jié)束后，將溶液從容器底部倒出，從底部倒出的前10mL 溶液棄用，取接下來的100mL 溶液即得到一定載荷率的WAF 溶液，毒性測定在取得WAF 溶液后6h 內(nèi)進(jìn)行。

1.2.3.2 發(fā)光度的測定 本文測試發(fā)光細(xì)菌發(fā)光度采用的是Glomax Multi 型微孔板型多功能檢測儀，該儀器適用于多樣品同時全自動檢測，檢測速度快，節(jié)省試劑，檢測功能多。在使用儀器前，先進(jìn)行儀器預(yù)熱：打開儀器電源，預(yù)熱大約15min，保持室內(nèi)溫度25℃。取復(fù)蘇后的發(fā)光菌液1mL，用2% NaCl 溶液稀釋到40mL，備用。

對潤滑油組分等難溶性混合物，其在溶液中溶解以及分散程度有限，隨著溶液載荷率增大到一定值時，會達(dá)到飽和態(tài)，不同種類油品載荷率達(dá)到飽和態(tài)時是不同的，為了使各種油品的WAF 溶液均能達(dá)到飽和態(tài)，在對基礎(chǔ)油或添加劑進(jìn)行前處理時，最高載荷率定為10000mg·L-1。首先，進(jìn)行預(yù)實驗，配制1、10、100、1000、10000mg·L-1的樣品 WAF 溶液，每個樣品設(shè)置三個平行，同時設(shè)置96 孔板第一行設(shè)置為陰性質(zhì)控，第二行為陽性質(zhì)控。各孔中加入樣品液180μL 和菌液 20μL，總體積為 200μL。放入儀器進(jìn)行測試，以此為樣品初始發(fā)光強(qiáng)度記做S0；記錄陰性質(zhì)控（2% NaCl） 初始發(fā)光強(qiáng)度為C0；陽性質(zhì)控（10mg·L-1ZnSO4）當(dāng)做樣品處理。設(shè)置 15min 的反應(yīng)時間，然后，使用微孔板型多功能檢測儀測定受試樣品中發(fā)光菌的發(fā)光強(qiáng)度，記錄15min 時間，陰性質(zhì)控初始發(fā)光強(qiáng)度為Ct；樣品發(fā)光強(qiáng)度記做St；陽性質(zhì)控當(dāng)做樣品處理，初始發(fā)光強(qiáng)度記做Pt。如果樣品溶液載荷率在達(dá)到10000mg·L-1時，發(fā)光抑制率小于50%，基本上就不會出現(xiàn)EL50，判斷樣品為無毒；如果樣品溶液載荷率在10000mg·L-1時發(fā)光抑制率大于50%，選擇抑制率合適的濃度范圍設(shè)計成為6 個濃度梯度，再參照預(yù)實驗流程進(jìn)行測試，用Origin 擬合曲線計算出EL50值。

1.2.3.3 數(shù)據(jù)處理

（1）校正系數(shù)（Cf值） Cf值是指陰性樣品在測試時間段內(nèi)（15min），菌液相對發(fā)光強(qiáng)度的變化，即表明菌液的穩(wěn)定性，計算方法如下：

（2）有效性實驗結(jié)果須滿足以下有效性參數(shù)：

①樣品測試15min，Cf值需在0.6~1.8 區(qū)間（含0.6 和 1.8）；

②測試時，陰性質(zhì)控中菌液的最終濃度需不小于106光子數(shù)；

③樣品平行測試時，變異系數(shù)（標(biāo)準(zhǔn)偏差與平均值之比）CV%≤3%；

④陽性質(zhì)控測試15min 后，發(fā)光抑制率應(yīng)達(dá)到50%左右。

（3）抑制率計算 抑制率又可以稱為光損失率（IR），計算公式如下：

1.2.4 急性生態(tài)毒性分級方法 根據(jù)Bulich（發(fā)光細(xì)菌測試儀發(fā)明者）的生物發(fā)光毒性檢測效應(yīng)分級標(biāo)準(zhǔn)、中科院南京土壤研究所提出的百分?jǐn)?shù)急性生態(tài)毒性分級標(biāo)準(zhǔn)以及一些潤滑油急性毒性評定的相關(guān)數(shù)據(jù)，以半效應(yīng)載荷EL50值為指標(biāo)，確定本文中礦物基礎(chǔ)油和潤滑添加劑的急性生態(tài)毒性分級方法，見表 1[11]。

表1 急性生態(tài)毒性分級方法Tab.1 Acute eco-toxicity grading method

1.2.5 試驗方法的穩(wěn)定性分析

采用上述方法對I 類 150SN、II 類 400N 以及KN4006 基礎(chǔ)油進(jìn)行急性毒性評價，考察該方法的穩(wěn)定性。分別進(jìn)行3 組平行試驗（編號1,2,3），結(jié)果見表2。

表2 發(fā)光細(xì)菌法測定急性毒性結(jié)果Tab.2 Determination results of Luminescent bacteria test

由表2 可知，平行試驗最大偏差在130mg·L-1之內(nèi),I 類150SN 和II 類400N 急性毒性結(jié)果均為微毒，KN4006 基礎(chǔ)油均為低毒，試驗結(jié)果的相對誤差均在2%以內(nèi)，急性中毒過程是一個很復(fù)雜的生化反應(yīng)，需要采用有效且適合的方法才能夠客觀評價出來，從以上分析結(jié)果看出，該試驗方法得出的結(jié)果具有良好的穩(wěn)定性，可用于難溶油品的急性毒性評價。

2 結(jié)果與討論

2.1 I 類礦物基礎(chǔ)油的急性生態(tài)毒性結(jié)果與分析

3 種I 類礦物基礎(chǔ)油在載荷率為10000mg·L-1時，150SN、400SN 和 600SN 的發(fā)光抑制率分別為66.5%、78.6%、78.5%，均大于50%，分別配制載荷率為 1000、2000、4000、6000、8000、10000mg·L-1的 WAF溶液進(jìn)行發(fā)光度測試得到發(fā)光抑制率大小隨WAF溶液載荷率的變化曲線，見圖1。

圖1 I 類礦物基礎(chǔ)油發(fā)光抑制率結(jié)果Fig.1 Luminous inhibition rate of type I mineral base oils

由圖1 可知，隨著溶液載荷率的增大，對發(fā)光度抑制率在增加，表明毒性就越大。數(shù)據(jù)經(jīng)過Origin 處理，得出擬合曲線公式如下：其中Y 為抑制率，%；X為 WAF 載荷率，mg·L-1，相關(guān)系數(shù) R2均達(dá)到 0.99 以上：

（1）150SN 發(fā)光抑制率變化公式：

（2）400SN 發(fā)光抑制率變化公式：

（3）600SN 發(fā)光抑制率變化公式：

經(jīng)擬合曲線公式計算得出，3 種礦物基礎(chǔ)油的EL50值分別為 5758.9、4729.7、2903.1mg·L-1。因此，150SN 的急性生態(tài)毒性等級為微毒，400SN 和600SN 為低毒。3 種I 類礦物基礎(chǔ)油的急性生態(tài)毒性不大，毒性從小到大排序為150SN<400SN<600SN。

2.2 II 類礦物基礎(chǔ)油的急性生態(tài)毒性結(jié)果與分析

當(dāng)載荷率為 10000mg·L-1時，II 類 150N、II 類400N、26 號 白 油 、680 號 白 油 、KN4006、KN4008、KN4010 的發(fā)光抑制率分別為60.5%、73.4%、42.5%、88%、72.3%、85.2%、91.7%。分別配制載荷率為1000、2000、4000、6000、8000、10000mg·L-1的 WAF 溶液進(jìn)行發(fā)光度測試得到發(fā)光抑制率大小隨WAF 溶液載荷率的變化曲線，見圖2。

圖2 II 類礦物基礎(chǔ)油發(fā)光抑制率結(jié)果Fig.2 Luminous inhibition rate of type II mineral base oils

由圖2 可知，其中26#白油在最高載荷率時抑制率為42.5 %，小于50 %，且隨著載荷率的增加，抑制率基本上趨于一個常數(shù)，可以判定其急性生態(tài)毒性不會出現(xiàn)EL50值。其它6 種II 類基礎(chǔ)油隨著溶液載荷率的增大，對發(fā)光度抑制率在增大。數(shù)據(jù)經(jīng)過Origin 處理，得出擬合曲線公式如下，其中Y 為抑制率，%；X 為 WAF 載荷率，mg·L-1，相關(guān)系數(shù) R2均達(dá)到0.99 以上：

（1）II 類150N 發(fā)光抑制率變化公式：

（2）II 類400N 發(fā)光抑制率變化公式：

（3）680 號白油發(fā)光抑制率變化公式：

（4）KN4006 發(fā)光抑制率變化公式：

（5）KN4008 發(fā)光抑制率變化公式：

（6）KN4010 發(fā)光抑制率變化公式：

經(jīng)擬合曲線公式計算得出，II 類150N、II 類400N、680 號 白 油 、KN4006、KN4008、KN4010 的EL50值分別為 7081.1、5540.5、2090、4270.3、3387.4、2010.1mg·L-1。根據(jù)急性生態(tài)毒性分級方法，II 類150N 和II 類400N 毒性等級屬于微毒，680#白油、KN4006、KN4008 和 KN4010 屬于低毒，26#白油屬于無毒?？傮w看來，這7 種II 類礦物基礎(chǔ)油毒性不大，對生態(tài)環(huán)境急性毒性危害較小。

2.3 III 類礦物基礎(chǔ)油的急性生態(tài)毒性結(jié)果與分析

當(dāng)載荷率為 10000mg·L-1時，III 類 150N 和400N 的發(fā)光抑制率分別為38.6%、64%。分別配制載荷率為 1000、2000、4000、6000、8000、10000mg·L-1的WAF 溶液進(jìn)行發(fā)光度測試得到發(fā)光抑制率大小隨WAF 溶液載荷率的變化曲線，見圖3。

圖3 III 類礦物基礎(chǔ)油發(fā)光抑制率結(jié)果Fig.3 Luminous inhibition rate of type III mineral base oils

由圖3 可知，其中III 類150N 在最高載荷率時抑制率為38.6%，小于50%，且隨著載荷率的增加，抑制率基本上趨于一個常數(shù)，可以判定其急性生態(tài)毒性不會出現(xiàn)EL50值。III 類400N 隨著溶液載荷率的增大，對發(fā)光度抑制率在增大，數(shù)據(jù)經(jīng)過Origin 處理，得出擬合曲線公式如下，其中Y 為抑制率，%；X為 WAF 載荷率，mg·L-1，相關(guān)系數(shù) R2達(dá)到 0.99 以上：

Ⅲ類400N 發(fā)光抑制率變化公式：

經(jīng)擬合曲線公式計算得出，III 類400N 的EL50值為6459.5mg·L-1。根據(jù)急性生態(tài)毒性分級方法，III類150N 毒性等級屬于無毒，III 類400N 毒性等級屬于微毒。

3 機(jī)理探討

通過對12 種礦物基礎(chǔ)油急性生態(tài)毒性分析，結(jié)果見表3。

表3 發(fā)光細(xì)菌法檢測礦物基礎(chǔ)油的急性毒性結(jié)果Tab.3 Acute toxicity of mineral base oils detected by luminescent bacteria method

由表3 可知，12 種礦物基礎(chǔ)油急性毒性均較低。其毒性機(jī)理可能有以下兩個方面：（1）物理隔離，由于WAF 溶液中可能含有細(xì)小油滴，直接與費(fèi)氏弧菌接觸后隔離氧分子，阻止了代謝過程，造成發(fā)光度降低；（2）礦物油自身毒性，有毒物質(zhì)通過細(xì)胞膜交換后進(jìn)入細(xì)胞，對細(xì)胞造成破壞或降低熒光酶活性，從而影響發(fā)光度。雖然礦物基礎(chǔ)油急性毒性較低，但有研究表明，需要特別注意其生物蓄積性，比如有的礦物油在大鼠身體中積累可形成微小肉芽腫，有的含芳烴類礦物油具有致畸致癌性[12]。

4 結(jié)論

參照國內(nèi)外文獻(xiàn)及標(biāo)準(zhǔn)，利用發(fā)光細(xì)菌法測定礦物基礎(chǔ)油的急性生態(tài)毒性。該方法選用費(fèi)氏弧菌為受試生物，通過制備水融合部分（WAF）方法對樣品進(jìn)行前處理，以半數(shù)效應(yīng)載荷率（EL50）作為急性毒性評定參數(shù)，這對于油品等難溶性物質(zhì)的毒性判斷更科學(xué)易行。結(jié)果表明，該方法相比于魚類、海藻和水蚤等急性毒性試驗，大大縮短了試驗周期，并且具有穩(wěn)定性良好、簡便、快速、成本低等特點，測試結(jié)果可為油品污染的監(jiān)測以及環(huán)境可接受潤滑油的研究提供一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

利用該方法檢測出了12 種常用的礦物基礎(chǔ)油的急性生態(tài)毒性大小，并進(jìn)行了毒性分級。常用的12 種礦物基礎(chǔ)油的急性毒性都較低。試驗結(jié)果用Origin 統(tǒng)計繪圖，發(fā)現(xiàn)通常情況下礦物基礎(chǔ)油的WAF 溶液載荷率與其發(fā)光抑制率呈現(xiàn)出指數(shù)遞增關(guān)系，可用以下公式表示，其相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.99 以上：

式中 Y：抑制率，%；X：WAF 載荷率，mg·L-1；A、t、Y0：常數(shù)。