劉可欣 李志堅 劉翔宇

Gasdermin是最近發(fā)現(xiàn)的一個具有成孔效應(yīng)的蛋白家族，其能造成細胞膜通透性改變與細胞焦亡[1-2]。目前該家族在人體中包含6個旁系同源基因：gasdermin A(GSDMA)、gasdermin B(GSDMB)、gasdermin C(GSDMC)、gasdermin D(GSDMD)、gasdermin E(GSDME)(也稱為DFNA5)和PJVK(也稱為DFNB59)。直到2015年，幾項獨立研究[1,3-4]揭示了gasdermin的功能機制，確定GSDMD是焦亡的最終執(zhí)行者。通過在人類基因組數(shù)據(jù)庫中搜索GSDMA的同源物，GSDMD(也稱為GSDMDC1、DFNA5L或FKSG10)首次被鑒定出來[5]，

其在不同的人類組織以及白細胞的不同亞群中廣泛表達[6-7]，GSDMD直系同源基因僅存在于哺乳動物基因組中。作為焦亡最終執(zhí)行蛋白，GSDMD是近幾年的研究熱點，對于其結(jié)構(gòu)、功能及抑制劑均有大量報道。但目前涉及GSDMD的眼部相關(guān)疾病的研究較少，對GSDMD以及其相關(guān)的眼科疾病的進一步研究可為眼科相關(guān)疾病診療提供新思路。

1 焦亡的發(fā)生發(fā)展及機制

1992年，Zychlinsky等[8]觀察到由弗氏志賀菌誘導(dǎo)宿主巨噬細胞發(fā)生的程序性細胞死亡，最初被認定為細胞凋亡。進一步研究表明，這是一種依賴caspase-1的新型細胞死亡形式，稱為焦亡[9]，與凋亡以形態(tài)上的不同進行區(qū)分。細胞焦亡是一種程序性細胞死亡，其主要特征為炎癥小體形成、促炎半胱氨酸蛋白酶和gasdermin激活、大量促炎因子和細胞內(nèi)含物釋放。其中，caspase-1和鼠源caspase-11(人源caspase-4/-5)可對GSDMD特異性切割，進而激活其成孔活性，導(dǎo)致細胞喪失質(zhì)膜完整性。焦亡細胞的細胞膜失去了調(diào)控物質(zhì)進出的能力并迅速膨脹，最終導(dǎo)致細胞發(fā)生滲透性崩解，同時釋放出大量細胞內(nèi)含物如炎癥細胞因子白細胞介素(IL)-1β、IL-18和高遷移率族蛋白 1(HMGB-1)到細胞外環(huán)境，引發(fā)炎癥反應(yīng)。

焦亡通路包括主要依賴caspase-1的經(jīng)典通路和主要依賴caspase-4/-5/-11的非經(jīng)典通路。在經(jīng)典焦亡通路中，細胞質(zhì)內(nèi)模式識別受體(PRRs)能識別病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)、內(nèi)源性危險相關(guān)分子模式(DAMPs)。當(dāng)PRRs產(chǎn)生信號后，炎癥小體復(fù)合物開始組裝，經(jīng)典炎癥小體由輔助蛋白和自身寡聚化支架蛋白組成，通常屬于核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(NLR)家族。被炎癥小體激活的caspase-1對GSDMD進行切割，并對IL-1β和IL-18等炎癥因子的前體進行加工修飾，促進炎癥因子成熟、分泌，誘導(dǎo)細胞焦亡。在非經(jīng)典焦亡通路中，胞內(nèi)脂多糖結(jié)合caspase-4/-5/-11并誘導(dǎo)這些caspase活化，使其切割GSDMD[10-11]。被切割的GSDMD在質(zhì)膜上形成孔隙，GSDMD孔引起鉀離子釋放導(dǎo)致NLRP3的活化和IL-1β、IL-18的成熟，而后成熟細胞因子經(jīng)GSDMD孔釋放。然而，Huang等[12]在近期一項研究中指出，脂多糖在內(nèi)皮細胞中并不引起細胞死亡，而是抑制細胞增生。但無論是哪種焦亡通路，GSDMD蛋白均為誘導(dǎo)細胞焦亡的最終執(zhí)行者[1,3,13]。

近來研究表明，一直以來被認為是參與細胞凋亡的caspase-8亦可通過裂解GSDMD導(dǎo)致細胞焦亡，并伴有IL-1β釋放[14-17]。體外研究表明，GSDMD是非經(jīng)典炎癥通路下游細胞死亡的唯一執(zhí)行者。然而，值得注意的是，由于凋亡相關(guān)的斑點樣蛋白病灶或caspase-1更混雜的蛋白水解活性可能會刺激備用細胞死亡程序，因此在經(jīng)典炎癥小體激活后，GSDMD的缺失并不能完全阻止細胞死亡[1,3-4]。

2 GSDMD的活性孔隙形成及其與焦亡的關(guān)系

焦亡的特征在于gasdermin孔隙形成，進而導(dǎo)致細胞膜破裂。GSDMD的中央連接區(qū)(人源FLTD及鼠源LLSD)被caspase切割，產(chǎn)生具有成孔活性的相對分子質(zhì)量為31 000的N末端結(jié)構(gòu)域(GSDMD-NT)，以及對前者具有抑制作用的相對分子質(zhì)量為22 000的C末端結(jié)構(gòu)域(GSDMD-NT)兩個片段[1-4,14,18-19]。當(dāng)兩者之間的連接蛋白水解、GSDMD的分子內(nèi)抑制作用解除后，GSDMD-NT插入細胞膜形成寡聚孔，從而破壞細胞的離子穩(wěn)態(tài)并誘導(dǎo)細胞焦亡。

由于各gasdermin家族中各成員的N末端結(jié)構(gòu)域序列具有高度相似性，據(jù)此可以推測出大多數(shù)gasdermin的成孔機制相似。研究人員根據(jù)全長GSDMA3的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)和從重組脂質(zhì)體中提取的GSDMA3-NT孔洞的低溫電鏡結(jié)構(gòu)預(yù)測了GSDMD的結(jié)構(gòu)，揭示了上述的自抑制現(xiàn)象[2,20]。而后Liu等[21]首次報道了人源和鼠源GSDMD蛋白的全長晶體結(jié)構(gòu)，闡述了GSDMD-NT的抑制狀態(tài)以及gasdermin蛋白家族自抑制機制的異同，揭示了重疊界面參與GSDMD的自抑制、脂質(zhì)結(jié)合、寡聚以及其對誘導(dǎo)細胞焦亡的重要性。

Gasdermin的N末端在體外可以直接與膜脂相互作用。其中，GSDMD-NT優(yōu)先靶向酸性磷脂，例如磷酸肌醇和心磷脂，但也可與磷脂酸和磷脂酰絲氨酸弱結(jié)合[2,19]。磷酸肌醇僅存在于細胞膜的胞質(zhì)小葉中，所以GSDMD-NT只從胞質(zhì)面形成孔隙，在細胞外加入活化的GSDMD并不會造成細胞膜的裂解[2]，因此相鄰細胞可免受焦亡細胞中GSDMD的損傷[19]。心磷脂具有類似于磷酸肌醇帶負電荷的頭部結(jié)構(gòu)，其存在于真核生物線粒體內(nèi)膜和細菌膜中。已有研究表明，GSDMA3-NT和GSDMD-NT單獨或不受分子內(nèi)抑制時可以破壞線粒體[22-23]，并且當(dāng)細菌暴露于重組GSDMD-NT時，細菌的生成會受到抑制[19]，不過GSDMD-NT進入內(nèi)膜的機制還有待進一步研究。Gasdermin孔的直徑為10～15 nm[2,19,24]，可使IL-1β(4.5 nm)[2,19]和IL-18(5.0 nm)通過，直徑25～30 nm的核糖體和較大的細胞器則不會通過孔隙[25]。內(nèi)體分揀轉(zhuǎn)運復(fù)合體(ESCRT)系統(tǒng)在GSDMD引起焦亡過程中可發(fā)揮修復(fù)膜孔的作用，減少焦亡和IL-1β等細胞內(nèi)容物的釋放[26-27]。

3 GSDMD眼部相關(guān)疾病的研究

自從焦亡領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注后，眾多學(xué)者針對眼科疾病中NLRP3、caspase-1/-4/-5/-11、IL-1β、IL-18等成分的表達作出了大量研究，從而證明焦亡與多種眼科疾病發(fā)病機制相關(guān)，為靶向眼科疾病治療提供了思路。然而，因GSDMD被發(fā)現(xiàn)較晚，與其相關(guān)的眼科疾病研究還處于起步階段，接下來對近幾年與GSDMD相關(guān)的眼科疾病研究進行介紹。

3.1 干眼癥干眼癥是一種常見的多因素誘導(dǎo)的自身免疫性眼表疾病。Chen等[28]研究證實了GSDMD依賴性焦亡在干燥應(yīng)力和高滲透壓等環(huán)境因素影響下誘發(fā)干眼癥中的關(guān)鍵作用。NLRP12和NLRC4炎癥小體由Toll樣受體4誘導(dǎo)的caspase-8激活，誘導(dǎo)GSDMD裂解和IL-33成熟，協(xié)同啟動干眼癥發(fā)展過程中黏膜上皮細胞的焦亡。這種信號可以通過IL-33放大，從而觸發(fā)干眼癥的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，而IL-33的加工和炎癥級聯(lián)反應(yīng)需要GSDMD的參與。抑制NLRP12或NLRC4、GSDMD基因缺失以及中和成熟IL-33的作用可以顯著減輕干燥應(yīng)力引起的角膜上皮損傷，這表明上述成分是治療干眼癥的潛在靶點。

3.2 角膜病Niu等[29]探討了NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的焦亡在PM2.5相關(guān)角膜毒性中的作用。研究結(jié)果顯示，在PM2.5處理的細胞中，角膜上皮細胞活性呈劑量依賴性下降。其中，由NLRP3炎癥小體介導(dǎo)、涉及NLRP3、凋亡相關(guān)的斑點樣蛋白、GSDMD、caspase-1、IL-1β和IL-18的焦亡通路被激活，并且上述物質(zhì)及活性氧(ROS)在實驗組小鼠角膜上皮細胞中的表達與對照組相比均顯著增加。進一步的體內(nèi)研究證實了該通路在暴露于PM2.5的小鼠角膜中被激活。

3.3 白內(nèi)障白內(nèi)障是最常見的致盲性眼科疾病。已知基因CRTAC1異常表達通過影響細胞凋亡參與白內(nèi)障的形成，Sun等[30]對CRTAC1在焦亡過程中的調(diào)節(jié)作用以及其在紫外線(UVB)誘導(dǎo)的細胞損傷模型中的潛在作用機制進行了研究。結(jié)果表明，焦亡標(biāo)志物(NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1、GSDMD-NT、IL-1β和IL-18)水平在白內(nèi)障患者晶狀體囊膜組織或細胞中均顯著增高。UVB照射可明顯誘導(dǎo)上述焦亡標(biāo)志物在人晶狀體上皮細胞(HLECs)中的表達，而CRTAC1下調(diào)可減少UVB誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS含量和焦亡，這提示CRTAC1可能介導(dǎo)白內(nèi)障形成中的細胞焦亡。ROS抑制劑N-acetyl-L-cysteine可阻斷CRTAC1過度表達引起的焦亡作用，這提示CRTAC1介導(dǎo)的、UVB誘導(dǎo)的HLECs焦亡可通過ROS/NLRP3/caspase-1信號通路發(fā)生，證實了其在白內(nèi)障形成中的作用。

Wang等[31]對短波長藍光暴露后白內(nèi)障的發(fā)病機制進行了研究。結(jié)果證明，經(jīng)短波長藍光照射后的SD大鼠晶狀體的透明度變差，且晶狀體上皮細胞中caspase-1、caspase-11和GSDMD的表達水平顯著高于對照組。在HLECs中，短波長藍光照射組的細胞與對照組相比數(shù)目減少，形態(tài)上出現(xiàn)腫脹，且經(jīng)流式細胞術(shù)檢測后發(fā)現(xiàn)短波長藍光照射組的碘化丙啶和Annexin V染色雙陽性HLECs比例與加入caspase-1抑制劑組相比顯著增加。說明細胞焦亡在短波長藍光誘導(dǎo)的大鼠白內(nèi)障的形成中起關(guān)鍵作用。

3.4 青光眼/高眼壓癥青光眼是一種多因素視神經(jīng)病變，其特征在于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞(RGCs)的結(jié)構(gòu)改變和不可逆的視力喪失，高眼壓(OHT)是青光眼的高風(fēng)險因素。在急性O(shè)HT損傷后，RGCs的凋亡、自噬和壞死已經(jīng)得到了深入研究，焦亡卻很少有相關(guān)報道。

Chen等[32]利用小鼠視網(wǎng)膜缺血-再灌注(RIR)模型和體外糖氧剝奪/復(fù)氧(OGDR)模型，探討急性青光眼的發(fā)病機制。研究結(jié)果揭示了一個與青光眼視力喪失相關(guān)的小膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)、焦亡介導(dǎo)的RGCs死亡的新機制。GSDMD基因缺失可顯著改善急性青光眼患者RGCs死亡和視網(wǎng)膜組織損傷。此外，小膠質(zhì)細胞的GSDMD裂解依賴于caspase-8-缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。NLRP12、NLRP3、NLRC4在caspase-8-HIF-1α軸下游協(xié)同作用，通過caspase-1激活來誘發(fā)焦亡和IL-1β成熟，而IL-1β的加工反過來又放大了caspase-8-HIF-1α-NLRP12/NLRP3/NLRC4焦亡通路，從而加速炎癥級聯(lián)反應(yīng)。

Pronin等[33]在OHT損傷的RGCs、視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細胞以及放射狀膠質(zhì)細胞(Müller細胞)中檢測到包含NLRP1、NLRP3和黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)炎癥小體復(fù)合物的急性激活，并檢測到了caspase-1的活化和成熟IL-1β的釋放，這與RGCs層和內(nèi)核層的神經(jīng)元以及膠質(zhì)細胞中GSDMD的表現(xiàn)一致。在 caspase-1/-4/-11基因缺失、Panx1基因缺失的視網(wǎng)膜中，以及用Panx1抑制劑丙磺舒處理的野生型小鼠中，OHT誘導(dǎo)的細胞因子釋放和RGCs死亡均顯著降低。這些結(jié)果表明GSDMD依賴的焦亡通路對OHT損傷細胞的病理生理學(xué)有重要作用。

3.5 年齡相關(guān)性黃斑變性年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是一種破壞性眼病，且治療方法有限。視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細胞是受AMD影響的主要細胞類型，其在疾病晚期會經(jīng)歷程序性細胞死亡。

Gao等[34]對炎癥小體活性與大鼠內(nèi)RPE細胞死亡機制的相關(guān)性進行了研究。Long-Evans大鼠接受玻璃體內(nèi)注射β淀粉樣蛋白(Aβ)。處死大鼠后收集玻璃體標(biāo)本并檢測其細胞因子分泌水平，結(jié)果顯示caspase-1免疫反應(yīng)性、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)核移位、IL-1β及IL-18蛋白水平明顯增加。在RPE-脈絡(luò)膜組織中，caspase-3和GSDMD的蛋白水解水平升高。形態(tài)學(xué)分析顯示包括RPE細胞腫脹在內(nèi)的焦亡特征。上述結(jié)果提示RPE細胞經(jīng)過Aβ誘導(dǎo)的長時間炎癥激活后，焦亡和凋亡這兩種細胞死亡途徑均被激活。

Yang等[35]用體外AMD模型研究了Aβ1-40是否會引起ARPE-19細胞焦亡，并評價了枸杞多糖對Aβ1-40寡聚體誘導(dǎo)的ARPE-19損傷的影響。結(jié)果顯示，Aβ1-40寡聚體顯著降低了ARPE-19細胞的活力，細胞在形態(tài)上有明顯的腫脹、細胞膜破裂等焦亡改變，且伴有IL-1β和IL-18表達增加。此外，Aβ1-40寡聚物能夠上調(diào)包括NLRP3、caspase-1和GSDMD-NT在內(nèi)的焦亡標(biāo)志物的細胞免疫反應(yīng)性。枸杞多糖則可以改善ARPE-19細胞活性及形態(tài)，并且破壞Aβ1-40寡聚。

Kerur等[36]發(fā)現(xiàn)在人類細胞培養(yǎng)和小鼠模型中，RPE細胞變性由caspase-4/-11和caspase-1介導(dǎo)的非經(jīng)典焦亡通路所驅(qū)動，并且需要環(huán)狀GMP-AMP合成酶依賴的干擾素-β的產(chǎn)生和GSDMD依賴的IL-18的分泌，AMD晚期患者的RPE細胞中可見caspase-4、GSDMD、干擾素-β和環(huán)狀GMP-AMP合成酶水平升高。

3.6 糖尿病視網(wǎng)膜病變糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病的標(biāo)志性并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致成人視力下降的主要原因。視網(wǎng)膜周細胞死亡是DR發(fā)病的一個顯著特征。

Gan等[37]首次揭示了高糖通過NLRP3-caspase-1-GSDMD介導(dǎo)焦亡誘導(dǎo)視網(wǎng)膜周細胞損傷。高糖誘導(dǎo)NLRP3-caspase-1-GSDMD通路激活和孔隙形成，呈劑量和時間依賴性，并且導(dǎo)致人視網(wǎng)膜周細胞中IL-1β、IL-18和乳酸脫氫酶的釋放。GSDMD的過度表達促進高糖誘導(dǎo)的焦亡。GSDMD基因沉寂以及應(yīng)用caspase-1抑制劑Z-YVAD-FMK后，焦亡效應(yīng)被減弱。

高糖可通過引起氧化應(yīng)激從而誘導(dǎo)RPE細胞死亡。Xi等[38]用不同濃度的葡萄糖處理ARPE-19細胞，發(fā)現(xiàn)高糖(50 mmol·L-1)可抑制細胞增殖，促進細胞凋亡和ROS的產(chǎn)生，且ARPE-19細胞中caspase-1、GSDMD、NLRP3、IL-1β和IL-18的表達水平均升高，提示高糖可導(dǎo)致細胞焦亡。應(yīng)用ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)和焦亡抑制劑Necrosulfonamide(NSA)使高糖(50 mmol·L-1)對ARPE-19細胞增殖、凋亡和焦亡的影響發(fā)生逆轉(zhuǎn)，這些研究結(jié)果為DR的發(fā)病機制的研究提供了新思路。

3.7 視網(wǎng)膜脫離Li等[39]對GSDMD在大鼠視網(wǎng)膜脫離(RD)所致光感受器細胞焦亡中的作用進行了研究。結(jié)果表明，大鼠RD后第1天，GSDMD裂解達到高峰。raav2/8-GSDMD-C干預(yù)后，大鼠RD后光感受器細胞內(nèi)IL-1、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)的表達降低，焦亡和凋亡程度減輕，視網(wǎng)膜內(nèi)的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、F4/80和離子鈣接頭蛋白分子-1(IBA-1)的激活減緩，視網(wǎng)膜功能得到保護。由此可見，GSDMD參與大鼠RD后光感受器細胞的焦亡，GSDMD-C過度表達可阻斷GSDMD的裂解，抑制光感受器細胞變性。

4 展望

焦亡作為近年來的研究熱點受到廣泛關(guān)注，對于GSDMD的眼科疾病發(fā)病機制以及抑制劑的相關(guān)研究為許多病因不明的眼科疾病診治提供了新的研究思路。盡管GSDMD在眼科疾病研究中仍處于起步階段，在疾病進程中焦亡通路與其他通路之間是否存在協(xié)同、交叉等作用尚未完全清楚，但GSDMD作為一個新興的治療靶點，具有極大的研究潛力，其在眼科疾病研究中的前景值得期待。