劉冬巧，王天齊，段小妮，顏 艷，張淋坤，張春香

1.鄭州市口腔醫(yī)院正畸科（鄭州450000）；2.南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)系口腔正畸學(xué)（天津300071）3.天津市口腔醫(yī)院正畸科，天津市口腔功能重建重點實驗室（天津300041）；4.天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)系口腔正畸學(xué)（天津300070）；5.天津市口腔醫(yī)院中心實驗室（天津 300041）

牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）是從牙周韌帶中分離出來的一種新的間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs），在維持牙周組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)、牙周組織再生和正畸治療等方面發(fā)揮著重要作用。由于人PDLSCs有可能在體內(nèi)形成牙骨質(zhì)/牙周韌帶（periodontal ligament，PDL）樣結(jié)構(gòu)，為牙周炎、牙合創(chuàng)傷或正畸矯治力損傷的牙周組織的重建和再生提供了新方法[1]。最近，有研究證明Wnt信號通路在骨再生過程中起著重要的作用[2-4]。目前已鑒定的Wnt家族蛋白有19種，根據(jù)其穩(wěn)定細胞內(nèi)β-catenin 的作用，分為兩類：經(jīng)典和非經(jīng)典。經(jīng)典Wnt 信號傳導(dǎo)通路是通過β-catenin 介導(dǎo)的，它在經(jīng)典Wnt 信號傳導(dǎo)通路中起著關(guān)鍵作用。而非經(jīng)典Wnt/Ca2+信號傳導(dǎo)途徑可激活Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II（CaMKII）[5]，其信號傳導(dǎo)不依賴于β-catenin。Wnt 分子是一個分泌蛋白家族，一些Wnt蛋白，例如Wnt1、3a、4、5、10b和13，在成骨細胞形成中起著重要作用[6]。在缺少Wnt 蛋白的情況下，β-catenin 與含有腺瘤性息肉病大腸桿菌（adenoma?tous polyposis coli，APC）、糖原合成酶激酶-3β（glyco?gen synthase kinase-3 beta，GSK-3β）、Axin 蛋白和酪蛋白激酶1（casein kinase 1）形成復(fù)合物。在這個復(fù)合體中，GSK-3β組成性磷酸化β-catenin，導(dǎo)致其泛素化，并被26S蛋白酶體降解。在Wnt刺激下，Wnt蛋白與卷曲（Fz）受體和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（lowdensitylipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6）共受體的相互作用導(dǎo)致Axin/APC/GSK-3β活性的抑制[7]。這種復(fù)合體的破壞導(dǎo)致活性去磷酸化β-catenin 的穩(wěn)定和核移位，進而激活淋巴增強因子-1（lymphoid enhancer-binding factor-1，LEF-1）/T細胞因子（T lymphocyte factor，TCF）轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，參與細胞周期進程和分化的調(diào)節(jié)[8]。

有研究表明Wnt/β-catenin 信號通路控制著干細胞向成骨細胞的分化[9-10]。已有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路通過直接刺激Runx2 基因表達促進成骨作用，這一功能在成骨細胞形成中起重要作用。同樣，小鼠體內(nèi)Wnt10b的過度表達可以抑制骨喪失，并通過誘導(dǎo)Runx2使骨髓MSCs向成骨細胞系轉(zhuǎn)移。LiCl刺激MSCs 作為Wnt 信號通路的激活劑，可以誘導(dǎo)骨髓MSCs分化為成骨細胞[11]。與之相反，Wnt通路抑制因子（dickkopfs1，DKK1）則可以與LRP5 結(jié)合并阻斷Wnt/β-catenin信號通路，從而減少骨形成[12]。遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin 信號通路在間充質(zhì)組織發(fā)育過程中起重要作用，其中包括骨骼成熟和牙齒形成[13-14]。然而，經(jīng)典Wnt/β-catenin 信號通路對骨髓MSCs 成骨分化的影響仍存在爭議[10，15]。經(jīng)典Wnt/β-catenin 信號通路與人PDLSCs 成骨分化的潛在關(guān)系尚不清楚。在本項研究中，我們試圖研究經(jīng)典Wnt/β-catenin信號對人PDLSCs成骨分化的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

根據(jù)以往方法分離和培養(yǎng)人PDLSCs[16]。人PDLSCs取自12～16歲因正畸減數(shù)拔牙受試者的前磨牙，要求前磨牙沒有齲壞以及其他癥狀，并且患者知情同意。第2～4 代的PDLSCs 通過CD146 免疫磁珠試劑盒（Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germa?ny）進行PDSLCs 的免疫磁珠分離。使用STRO-1，CD146，CD271 和Scleraxis 抗體，通過免疫細胞化學(xué)染色將分選的CD146+細胞鑒定為人PDLSCs[16]。為了研究PDLSCs的多向分化能力，對分離的細胞進行成骨和成脂分化能力的檢測[16]。將人PDLSCs傳代3～4代后用于后續(xù)實驗研究。細胞在含有5%胎牛血清、10 nM 地塞米松、10 mM β-甘油磷酸酯和50 μg/mL L-抗壞血酸的成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)基分為添加和不添加氯化鋰（GSK3β抑制劑）或豆蔻素（Wnt/β-catenin 抑制劑）。人PDLSCs 的收集和培養(yǎng)得到了南開大學(xué)天津市口腔醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)（2009026）。

1.2 細胞活力測定

將人PDLSCs接種于6孔板中，分別用豆蔻素或氯化鋰處理3 d。使用Beckman Coulter Vi-Cell 測量三次細胞活力。

在細胞培養(yǎng)第5 d，使用豆蔻素或LiCl最后一次處理樣本后2 h，用Trizol 試劑（Invitrogen）分別提取不同培養(yǎng)條件下人PDLSCs的總核糖核酸（ribonucle?ic acid，RNA）。然后用分光光度計測定所提取RNA的濃度和純度，結(jié)果顯示總RNA的純度高達95%或者更高。RNA 分離后，使用SYBR-PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒（中國，Takara），在每10 μL反應(yīng)體積中使用500 ng RNA 進行反向轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cD?NA）合成，每個反應(yīng)體積包含0.5 μL PrimeScriptTMRT酶混合物I，0.5 μL oligo dT引物，2.0 μL PrimeScriptTM緩沖液和0.5 μL 隨機6 聚體。使用ABI PRISM 7300實時PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems，US）重復(fù)測量三次RT-PCR。根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫合成了Runx2、ALP、Col-I和GAPDH的引物序列，如表1所示。本實驗采用2-ΔΔCT方法計算基因表達水平。實驗數(shù)據(jù)顯示為相對于對照組的折疊變化。為保證擴增產(chǎn)物的純度，繪制了每次PCR反應(yīng)的熔融曲線。

表1 RNA提取及實時定量RT-PCR

1.3 Western blot分析

從培養(yǎng)液取出細胞后，用冷PBS洗滌2次，在緩沖液（Keygen total protein extraction kit，Keygen Bio?tech，China）中裂解20 min。然后將裂解后的混合物在4 °C 下14 000 r 離心15 min 后，收集上清液，用BCA蛋白檢測試劑盒進行定量測定。每個樣本為30～ 50μg 等量的細胞裂解物，將其放在10 %SDS-PAGE 凝膠上運行，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜（Bio-Rad）上。如前所述進行Western blot 分析[16]。封閉后，用抗β-catenin、Osterix、OPG、RANKL 和GAP?DH（Abcam，Cambridge，MA，USA）的一抗進行檢測，然后加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（中國北京中山生物有限公司）。之后使用化學(xué)發(fā)光試劑盒（Milli?pore，Billerica，MA，USA）觀察免疫反應(yīng)蛋白，使用ChemiDoc XRS 凝膠文檔系統(tǒng)和Quantity One 軟件（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）測定條帶強度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

本實驗數(shù)據(jù)均使用SPSS 17.0（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）進行處理，計量資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-ANOVA）進行組間比較。P ＜0.05 為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞活力測定

豆蔻素的結(jié)構(gòu)如圖1A 所示。我們用Beckman Coulter Vi-Cell 檢測了豆蔻素和LiCl 對細胞活力的影響。另外在進行六組數(shù)據(jù)的單因素方差分析前先進行整體分析，結(jié)果顯示各組之間細胞活力的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.170，P>0.05）。如圖1B 所示，各組數(shù)據(jù)無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），即豆蔻素、二甲基亞砜（DMSO）和LiCl沒有表現(xiàn)出任何明顯的細胞毒性作用。

圖1 豆蔻素結(jié)構(gòu)以及細胞活力檢測結(jié)果

2.2 豆蔻素通過促進β-catenin 降解來抑制Wnt/β-catenin的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

為了檢驗二甲基亞砜（DMSO）對實驗是否有干擾，我們比較了DMSO 組和正常對照組的蛋白質(zhì)表達情況。如圖2所示，β-catenin和Osterix在兩組間的表達無明顯差異（P>0.05），說明DMSO對實驗的影響可以忽略不計。用抗β-catenin抗體進行免疫印跡試驗分析，觀察豆蔻素對細胞內(nèi)β-catenin水平的影響。如圖3 所示，β-catenin 水平降低。GSK-3β導(dǎo)致β-catenin的降解，而LiCl是一種GSK-3β的抑制劑，我們用豆蔻素和LiCl 來培養(yǎng)牙周膜干細胞來排除GSK-3β的影響。Western blot 分析結(jié)果顯示，DMSO組和正常對照組有統(tǒng)計學(xué)差異（P ＜0.05），豆蔻素可降低細胞內(nèi)β-catenin的表達。

圖2 DMSO組和正常對照組的蛋白表達情況

2.3 經(jīng)典Wnt通路對PDLSCs成骨分化的促進作用

LiCl 是Wnt/β-catenin 信號通路的激活劑，提高了β-catenin 的表達（圖3）。通過評估成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子Osterix 蛋白表達的變化，以劑量依賴的方式支持Wnt信號在hPDLSCs中的成骨潛力（圖3）。在進行五組數(shù)據(jù)的單因素方差分析前先進行整體分析，結(jié)果顯示各組之間細胞活力的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.270，P ＜0.05）。Western blot 分析結(jié)果表明，LiCl 培養(yǎng)3 d 后，OPG 的表達增加（P ＜0.05），RANKL 表達無明顯變化（P >0.05），因此OPG/RANKL比值增加（圖4）。為了證實LiCl促進成骨的作用，我們采用了實時RT-PCR的方法，以ALP、Col-I和Runx2 作為其他成骨靶基因的例子。經(jīng)過LiCl 處理后，各組信使核糖核酸（messenger ribonucleic ac?id，mRNA）水平均呈劑量依賴性升高（圖5）。上述結(jié)果表明，經(jīng)典Wnt 通路促進PDLSCs 向成骨細胞分化。

圖3 各組Western blot分析結(jié)果

圖4 各組蛋白表達情況

2.4 豆蔻素對PDLSCs成骨分化的抑制作用

為了確定經(jīng)典Wnt/β-catenin 信號通路是否對PDLSCs的成骨有正向調(diào)節(jié)作用，將這些細胞與豆蔻素培養(yǎng)，豆蔻素可促進細胞內(nèi)β-catenin 的降解，并抑制經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)。對五組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析前先進行整體分析，顯示各組之間的表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=8.18，P ＜0.05）。最終的結(jié)果表明豆蔻素能降低Osterix 和OPG 的表達，導(dǎo)致OPG/RANKL 比值降低（圖4）。同時豆蔻素也降低了成骨因子ALP、Col-I 和Runx2 的mRNA 水平。此外，豆蔻素減弱了LiCl誘導(dǎo)的成骨分化刺激作用，提示豆蔻素通過典型的Wnt/β-catenin信號通路抑制成骨分化（圖5）。

圖5 各組mRNA表達情況

3 討論

人牙周膜組織源性間充質(zhì)干細胞（PDLSCs）具有克隆形成能力強、增殖能力強等特點，可用于干細胞介導(dǎo)的治療和組織工程。正畸牙齒的移動是由于外加的機械力而引起的組織重建的結(jié)果。PDLSCs則在正畸牙齒的移動過程中和過程后發(fā)揮著動態(tài)作用。組織再生和重建的過程受不同的信號通路控制。來自幾個團隊的最新研究闡明了經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路在骨骼發(fā)育和出生后骨量維持中的重要性[2]。作為經(jīng)典Wnt信號通路協(xié)助受體，人類的LRP5如果發(fā)生功能缺失的突變，就會導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥-假性膠質(zhì)瘤綜合征，在這種綜合征中，人們表現(xiàn)為低骨密度和骨骼脆性。相反，激活人類LRP5 的突變發(fā)生會導(dǎo)致患者骨密度增加[17]。幾項對于基因敲除小鼠的優(yōu)等研究也證實，經(jīng)典的wnt/β-catenin 信號通路對于骨骼發(fā)育和出生后骨量的維持是必不可少的[2-3]。

Wnt信號通路通過控制間充質(zhì)干細胞或成骨細胞的功能進而參與成骨的過程。細胞和分子水平的研究表明，β-catenin 和Tcf 蛋白共同調(diào)節(jié)成骨細胞對于OPG的表達，OPG是破骨細胞分化的主要抑制劑。在βcat（ex3）ob 成骨細胞中，OPG 的表達明顯增加，而作為主要破骨細胞分化因子的RANKL的表達則略有增加[18]。在礦化培養(yǎng)基中分化5 d 和10 d 后，β-catenin 成骨細胞中OPG mRNA 的表達與對照組相比降低，而RANKL的表達增加[3]。Wnt/β-catenin信號通路會促進MSCs（骨髓間充質(zhì)干細胞）向成骨細胞分化[10]。用LiCl刺激MSCs，作為Wnt信號通路的激活劑，可以誘導(dǎo)MSCs向成骨細胞分化[11]。相反，Dick?kopfs1（DKK1）抑制Wnt/β-catenin 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，可與LRP5 結(jié)合，阻斷Wnt/β-catenin 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制BM?SCs 的成骨分化，減少骨的形成[12]。這些重要的發(fā)現(xiàn)表明，Wnt/β-catenin 信號通路的激活可能有助于改善骨或牙齒的組織工程。在牙齒發(fā)育過程中，人們發(fā)現(xiàn)經(jīng)典Wnt信號通路作用于牙齒形態(tài)形成的多個階段[19]。雖然Wnt 信號通路在牙周發(fā)育和動態(tài)平衡中的作用尚不清楚，但越來越多的數(shù)據(jù)表明，Wnt信號通路的激活是牙周組織（如牙骨質(zhì)、牙周膜和牙槽骨）再生所必需的。然而，經(jīng)典Wnt 信號通路與PDLSCs成骨分化之間的潛在關(guān)系尚不清楚。

在本項研究中，通過在人體PDLSCs 中加入GSK-3β抑制劑LiCl來模擬Wnt的作用，并檢測經(jīng)典Wnt信號通路是否對這些細胞的成骨分化有積極的影響。經(jīng)過LiCl 的處理可升高PDLSCs 在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的成骨特異性基因和蛋白的表達。LiCl 可促進OPG的表達，但不改變RANKL的表達，從而增加OPG/RANKL的比值。這一結(jié)果表明，使用可以上調(diào)經(jīng)典Wnt信號通路的藥物可以促進PDLSCs的成骨分化。成骨轉(zhuǎn)錄因子包括Runx2 和Osterix 是調(diào)節(jié)成骨細胞定位和間充質(zhì)細胞成骨分化所必需的[20]。與以前的研究一致，本研究表明LiCl 以劑量依賴的方式提高Osterix、Runx2、ALP 和Col-I 的水平。以前的研究表明，Wnt 信號通路上調(diào)β-catenin 蛋白水平足以促進Runx2的表達，從而導(dǎo)致成骨細胞分化。反之，作為一種新型的Wnt/β-catenin信號的小分子抑制劑，不論有沒有LiCl，豆蔻素能以劑量依賴性下調(diào)細胞內(nèi)β-catenin 的表達[21]，從而抑制成骨因子的表達，但不會改變RANKL 的表達。豆蔻素會減弱LiCl的一些積極作用，這表明豆蔻素可通過經(jīng)典Wnt 信號通路抑制hPDLSCs的成骨分化。Cho等[22]的研究表明，劑量≤10 μM 的豆蔻素可抑制65%～ 70%的β-catenin 活性，而不影響細胞活力。也有學(xué)者指出豆蔻素引起ALP、OCN、OPN、BSP、CAP、CEMP1等成骨基因表達下降，從而導(dǎo)致相應(yīng)的蛋白合成減少[23]。瞬時受體電位通道（TRP）參與了疼痛信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活或調(diào)節(jié)。有研究表明豆蔻素可以通過抑制TRPV1 離子通道發(fā)揮顯著的鎮(zhèn)痛作用[24]。為了避免此項干擾作用，提示我們后續(xù)實驗可以采用特定siRNA 或者其他Wnt 通路抑制劑，用以佐證豆蔻素在Wnt 信號通路中的作用。細胞內(nèi)β-catenin 水平受多種途徑控制：GSK-3β依賴途徑、PKCα依賴途徑和Siah依賴途徑。在GSK-3β依賴途徑中，GSK-3β與腺瘤性息肉大腸桿菌和軸蛋白形成破壞復(fù)合物，磷酸化β-catenin的末端絲氨酸/蘇氨酸殘基，通過泛素依賴機制促進其降解[25]。β-catenin的N-末端絲氨酸/蘇氨酸殘基也會被PKCα磷酸化，也會導(dǎo)致泛素依賴的β-catenin 降解[26]。在Siah 依賴的途徑中，Si?ah-1與腺瘤性息肉病結(jié)腸腺瘤性結(jié)腸炎的羧基末端相互作用，從而吸附泛素化復(fù)合體，促進β-catenin的降解[27]。在本研究中，豆蔻素能誘導(dǎo)細胞內(nèi)β-catenin在LiCl（已知的GSK-3β抑制劑）存在的情況下發(fā)生降解。這些結(jié)果表明，豆蔻素胞內(nèi)降解β-catenin 的途徑可能是通過Siah 途徑和/或依賴PKCα途徑，而不是通過GSK-3β途徑。經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路通過一系列機制增加骨量，包括干細胞更新，刺激成骨細胞復(fù)制，誘導(dǎo)成骨，抑制成骨細胞和骨細胞的凋亡[25]。Heo 等[28]的研究表明，在成骨轉(zhuǎn)錄因子的刺激下，經(jīng)典Wnt 信號通路會導(dǎo)致PDLC 分化為成骨細胞系。Wnt/β-catenin 信號通路會促進祖細胞向成骨細胞分化[9]。與之前的一些研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路促進了PDLSCs 的成骨分化。與之相矛盾的是，有多篇文章表明Wnt/β-catenin 信號通路在體外會抑制MSCs的成骨分化和礦化[15，29]。例如，一項研究表明，wnt/β-catenin 信號通路會負向調(diào)節(jié)牙髓干細胞向成牙本質(zhì)細胞的分化[14]。Liu 的研究指出，β-catenin 的激活抑制了非經(jīng)典的Wnt/Ca2+途徑，導(dǎo)致炎癥微環(huán)境中PDLSCs 的增殖增加，但成骨分化減少[30]。Nemotot等[31]觀察到Wnt信號通路會抑制成牙骨質(zhì)細胞分化并促進細胞的增殖。鑒于祖細胞成骨分化調(diào)控的復(fù)雜性，我們要闡明Wnt/β-catenin 信號通路在調(diào)控MSCs成骨分化中的確切機制是非常困難的。在這方面，我們的研究結(jié)果與前面的一些研究結(jié)果是一致的[11，13-14]，但與其他研究人員也有不同之處[14-15，29]。我們認為這種差異在于Wnt靶基因轉(zhuǎn)錄的基因特異性激活因子和/或抑制因子存在于細胞環(huán)境中，這或許取決于細胞類型和/或分化階段[32]。在未來，開發(fā)一個模型系統(tǒng)來測試規(guī)范的Wnt 信號對人體PDLSCs 增殖和成骨分化的影響將會是很有意義的。綜上所述，本文報道的結(jié)果首次證明Wnt/β-catenin 信號可以促進PDLSCs 的成骨分化。我們的研究結(jié)果表明，對經(jīng)典Wnt 信號通路進行藥理學(xué)調(diào)節(jié)可以提高hP?DLSCs 的成骨能力，為牙周組織工程提供了一種可行的策略。據(jù)了解，正畸治療后復(fù)發(fā)的風(fēng)險一直會持續(xù)到牙槽骨改建完成，因此我們的研究結(jié)果啟發(fā)我們提出，通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin 信號對PDLSCs 成骨分化的影響，正確調(diào)控正畸牙移動后的牙槽骨改建，可以預(yù)防移動牙齒的復(fù)發(fā)。LiCi是Wnt通路激活劑，本研究的局限性在于只檢驗mRNA 的表達不足以證明經(jīng)典Wnt信號通路對人牙周膜干細胞的成骨分化具有正向調(diào)節(jié)作用，后續(xù)應(yīng)增加實驗增強結(jié)論的正確性。

4 結(jié)論

經(jīng)典Wnt 信號通路對人PDLSCs 的成骨分化有正向調(diào)節(jié)作用，為牙周組織工程中經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路對人牙周膜干細胞成骨分化的藥理學(xué)調(diào)控提供了一種可行性策略，同時也為促進正畸治療過程中的牙齒移動以及隨后的牙周組織改建提供了思路。