劉佳蓉 李 楠 甘韜玉 曾慧蘭 李潤(rùn)根

（宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院園藝系，江西省作物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西宜春 336000）

龍牙百合（Lilium browniivar.viridulumBaker）為百合科百合屬多年生球根植物，是深受市場(chǎng)歡迎的藥食同源養(yǎng)生品，是集食用、藥用和觀賞于一體的重要經(jīng)濟(jì)作物。目前，在我國(guó)江西萬(wàn)載、泰和、永新，湖南隆回、安化、龍山以及廣西永福、資源、柳州等市縣有大面積栽培，其中江西萬(wàn)載的龍牙百合種植歷史已有500 年之久。

隨著栽培年限的延長(zhǎng)和栽培面積的擴(kuò)大，一些地區(qū)百合病害發(fā)生日益嚴(yán)重，百合炭疽病是常見(jiàn)的病害之一。Zhao 等（2016）報(bào)道了白蠟樹炭疽菌（Colletotrichum spaethianum）為卷丹百合的致病菌；前期，筆者在龍牙百合貯藏期腐爛鱗莖上分離、鑒定了白蠟樹炭疽菌，并能引起百合植株發(fā)生炭疽?。ㄔ厶m 等，2020）。目前有關(guān)白蠟樹炭疽菌的研究較少，為明確其生物學(xué)特性及對(duì)藥劑的敏感性，本試驗(yàn)采用菌絲生長(zhǎng)速率法和孢子計(jì)數(shù)法，研究不同碳源、氮源、培養(yǎng)基、pH、光照、溫度等對(duì)白蠟樹炭疽菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響；并采用菌絲生長(zhǎng)速率法，測(cè)定該病原菌對(duì)6 種殺菌劑的敏感性。以期為龍牙百合炭疽病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌種：白蠟樹刺盤孢（Colletotrichum spaethianum），保存于江西省作物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

供試藥劑：選擇6 種殺菌劑（表1）進(jìn)行室內(nèi)毒力試驗(yàn)。

表1 供試藥劑名稱及生產(chǎn)廠家

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）、玉米瓊脂培養(yǎng)基（corn meal agar，CMA）、馬鈴薯胡蘿卜培養(yǎng)基（potato carrot agar，PCA）、查氏培養(yǎng)基（czapek dox agar，CDA）、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（potato sucrose agar，PSA）、燕麥培養(yǎng)基（oatmeal agar，OA）（岳海梅，2015）。

1.2 白蠟樹炭疽菌的生物學(xué)特性測(cè)定

1.2.1 光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 將在PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d 的菌落，用無(wú)菌打孔器沿其邊緣打取直徑為5 mm 的菌餅，接種在新的PSA 平板中央，在0 h 光照、12 h 光照（3 000 lx 日光燈照射，下同）/12 h 黑暗、24 h 光照3 種不同光照條件下，25 ℃恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d 后，采用“十”字交叉法測(cè)量菌落直徑；培養(yǎng)10 d 后，用無(wú)菌水洗脫孢子，適度稀釋后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算每個(gè)培養(yǎng)皿（直徑9 cm）的孢子數(shù)量（下同）。設(shè)4 次重復(fù)。

1.2.2 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 將直徑5 mm 的菌餅接種到PSA 平板中央，分別置于4、10、15、20、25、30、35 ℃恒溫條件下12 h 光照/12 h 黑暗培養(yǎng)。設(shè)4 次重復(fù)。

1.2.3 pH 對(duì)菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響 用1 mol·L-1NaOH 和HCl 調(diào)節(jié)配制pH 值為5、6、7、8、9、10 的PSA 培養(yǎng)基，將直徑5 mm 菌餅分別接種到不同pH 的PSA 平板中央，25 ℃恒溫、12 h 光照/12 h 黑暗培養(yǎng)。設(shè)4 次重復(fù)。

1.2.4 碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 以查式培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以相同質(zhì)量（0.11 mol·L-1）的木糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、麥芽糖和乳糖作碳源。將直徑5 mm 菌餅接種到不同碳源的平板中央，25 ℃恒溫、12 h 光照/12 h 黑暗培養(yǎng)。設(shè)4 次重復(fù)。

1.2.5 氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 以查式培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以相同質(zhì)量（0.02 mol·L-1）的牛肉浸膏、蛋白胨、尿素、甘氨酸、硫酸銨、氯化銨、硝酸鈉和硝酸銨作氮源。將直徑5 mm 的菌餅接種到不同氮源的平板中央，25 ℃恒溫、12 h光照/12 h 黑暗培養(yǎng)。設(shè)4 次重復(fù)。

1.2.6 培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 將直徑5 mm 的菌餅接種到PDA、CMA、PCA、CDA、PSA、OA 培養(yǎng)基平板中央，25 ℃恒溫、12 h 光照/12 h 黑暗培養(yǎng)。設(shè)4 次重復(fù)。

1.2.7 病原菌菌落致死溫度的測(cè)定 將直徑5 mm的菌餅放置于裝有1 mL 無(wú)菌水的1.5 mL 滅菌離心管中，分別置于45、50、55、60、65 ℃的恒溫水浴鍋中處理10 min（先預(yù)熱1 min），取出后迅速冷卻；然后置于PSA 平板中央，25 ℃恒溫、12 h 光照/12 h 黑暗培養(yǎng)。連續(xù)觀察7 d，確定菌絲致死溫度范圍。根據(jù)確定的致死溫度范圍，相隔1 ℃設(shè)置溫度梯度，重復(fù)以上試驗(yàn)，最終確定菌絲致死溫度。同理，用1 mL 孢子懸浮液代替病原菌菌餅混合液，測(cè)定分生孢子致死溫度。各處理均設(shè)置4 次重復(fù)。

1.3 6 種殺菌劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇6 種殺菌劑對(duì)白蠟樹炭疽菌菌絲生長(zhǎng)抑制率在5%～95%范圍內(nèi)的6 個(gè)質(zhì)量濃度（20%抑霉唑EW、25%吡唑醚菌酯EC和80%乙蒜素EC 分別稀釋1 × 103、1 × 104、2 ×104、5 × 104、1 × 105、5 × 105倍，60%唑醚·代森聯(lián)WG、40%腈菌唑WP 和1%申嗪霉素SC 分別稀釋1 × 102、1 × 103、2 × 103、5 × 103、1 × 104、5 × 104倍）進(jìn)行試驗(yàn)，培養(yǎng)基配制和試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理參照曾慧蘭等（2018）方法進(jìn)行。每處理設(shè)3 次重復(fù)，在25 ℃、12 h 光照/12 h 黑暗的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7 d 后測(cè)量菌絲直徑，計(jì)算抑菌率。

抑菌率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑 × 100%

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理、做圖，用SPSS 21 軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 百合炭疽病病原菌C. spaethianum 的生物學(xué)特性

2.1.1 光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 由圖1-A可見(jiàn)，白蠟樹炭疽百合炭疽菌C.spaethianum菌絲在12 h 光照/12 h 黑暗條件下生長(zhǎng)最快，顯著高于其他光照處理，24 h 光照條件下菌絲生長(zhǎng)最慢；0 h 光照條件下每皿產(chǎn)孢量最大，達(dá)167.17 × 106個(gè)，明顯高于其他光照處理（圖1-B）。

圖1 不同光照時(shí)間對(duì)白蠟樹炭疽菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

2.1.2 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 由圖2-A可見(jiàn)，不同溫度處理對(duì)白蠟樹炭疽菌菌絲生長(zhǎng)有顯著影響，病原菌菌絲在10～35 ℃范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，其中25 ℃處理生長(zhǎng)最快，4 ℃時(shí)菌落幾乎停止生長(zhǎng)；10～35 ℃范圍內(nèi)均能產(chǎn)孢，25 ℃處理產(chǎn)孢量最大，達(dá)95.13 × 106個(gè)，4 ℃時(shí)產(chǎn)孢量最小，僅為0.13 × 106個(gè)（圖2-B）。

圖2 不同溫度對(duì)白蠟樹炭疽菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

2.1.3 pH 對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 由圖3-A可見(jiàn)，白蠟樹炭疽菌菌絲在pH 值5～10 范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，其中pH 值為5 時(shí)最利于菌絲生長(zhǎng)；pH值5～10 范圍內(nèi)產(chǎn)孢量均較高，pH 值為9 時(shí)產(chǎn)孢量最大，達(dá)22.50 × 106個(gè)，pH 為6 時(shí)產(chǎn)孢量最小，為8.50 × 106個(gè)（圖3-B）。說(shuō)明該病原菌在弱酸性、中性和弱堿性條件下菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢均較好。

圖3 不同pH 對(duì)白蠟樹炭疽菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

2.1.4 碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 由圖4-A可見(jiàn)，7種碳源處理下白蠟樹炭疽菌菌絲均可生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速度不同，其中葡萄糖和乳糖最利于菌絲生長(zhǎng)，顯著高于其他碳源處理；7 種碳源處理產(chǎn)孢均較好，其中乳糖處理產(chǎn)孢量最大，達(dá)7.10 × 107個(gè)（圖4-B）。

圖4 不同碳源對(duì)白蠟樹炭疽菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

2.1.5 氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 由圖5-A可見(jiàn)，用8 種氮源培養(yǎng)7 d 時(shí)，白蠟樹炭疽菌菌落擴(kuò)展直徑的大小排序依次為：牛肉浸膏＞蛋白胨＞硝酸鈉＞硝酸鉀＞脲＞氯化銨＞甘氨酸＞硫酸銨，以牛肉浸膏為氮源時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，在以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢；8 種氮源處理的產(chǎn)孢量差異較大，以甘氨酸為氮源時(shí)，產(chǎn)孢量最大，達(dá)39.75 × 106個(gè)，以氯化銨為氮源時(shí)，產(chǎn)孢量最小，僅為1.10 × 106個(gè)（圖5-B）。

圖5 不同氮源對(duì)白蠟樹炭疽菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

2.1.6 培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 由圖6-A 可見(jiàn)，白蠟樹炭疽菌在供試的6 種培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)，在PDA 培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度最慢，顯著低于其他培養(yǎng)基處理，在OA 培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度最快，顯著高于其他培養(yǎng)基處理；6 種培養(yǎng)基處理的產(chǎn)孢量差異較大，在PSA 培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大，達(dá)95.13 × 106個(gè)，在OA 培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最小，僅為0.32 × 106個(gè)（圖6-B）。說(shuō)明OA 培養(yǎng)基有利于白蠟樹炭疽菌菌絲生長(zhǎng)，但不利于病原菌產(chǎn)孢。

圖6 不同培養(yǎng)基對(duì)白蠟樹炭疽菌菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢量的影響

2.1.7 病原菌菌落的致死溫度 白蠟樹炭疽菌菌株經(jīng)45～50 ℃、10 min 恒溫水浴處理后，菌絲在PSA 培養(yǎng)基上均能繼續(xù)生長(zhǎng)，但經(jīng)53 ℃、10 min和54 ℃、10 min 處理的菌絲不再生長(zhǎng)，表明該病原菌菌絲的致死溫度是53 ℃、10 min；其分生孢子在58 ℃、10 min 和59 ℃、10 min 處理后不再產(chǎn)孢，表明該病原菌分生孢子的致死溫度是58 ℃、10 min。

2.2 百合炭疽病病原菌C.spaethianum 對(duì)殺菌劑敏感性

室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明（表2），6 種藥劑對(duì)白蠟樹炭疽菌C.spaethianum均有一定的抑制作用，但不同藥劑的抑制作用差異較大，其中吡唑醚菌酯抑制作用最強(qiáng)，EC50為0.056 mg·L-1；其次是抑霉唑，EC50為4.499 mg·L-1；再次是申嗪霉素，EC50為4.809 mg·L-1；唑醚·代森聯(lián)的防治效果最差，EC50為64.609 mg·L-1。

由毒力回歸方程可知，申嗪霉素的斜率值最大，為1.516；其次是腈菌唑；吡唑醚菌酯的斜率值最小，為0.567。說(shuō)明白蠟樹炭疽菌對(duì)申嗪霉素最敏感，而對(duì)吡唑醚菌酯最不敏感（表2）。

表2 不同殺菌劑對(duì)白蠟樹炭疽菌菌絲生長(zhǎng)毒性的影響

3 結(jié)論與討論

研究病原菌的生物學(xué)特性對(duì)掌握病害的發(fā)生規(guī)律和提出防治措施具有非常重要的意義。在對(duì)引起百合炭疽病的病原菌白蠟樹炭疽菌（C.spaethianum）的生物學(xué)特性進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，該菌在25 ℃時(shí)無(wú)論是菌絲生長(zhǎng)速度還是產(chǎn)孢量均最大，在pH 值5～10 范圍內(nèi)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢均較好，表明在溫暖的氣候條件下，無(wú)論是在弱酸性、中性還是弱堿性條件均有利于該病害發(fā)生。該結(jié)果與蘭嶼肉桂炭疽病菌C.aotearoaB.（易潤(rùn)華 等，2017）、茶褐枯病病原菌C.camelliae（王雪 等，2019）的研究結(jié)果類似。該病原菌在含有硫酸銨的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢且產(chǎn)孢量也較小，與百合枯萎病菌Fusarium proliferatum（李潤(rùn)根 等，2018）、百合鱗莖腐爛病病原菌F.oxysporum（曹興 等，2018）和高粱附球菌Epicoccum sorghinum（曾慧蘭 等，2018）的研究結(jié)果相同，生產(chǎn)上施用硫酸銨是否能緩解其發(fā)病有待進(jìn)一步研究。

趙曉珍等（2020）在火龍果膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）、王凡等（2015）在核桃膠孢炭疽菌防治試驗(yàn)中均發(fā)現(xiàn)申嗪霉素的防效較好，作為一種微生物源綠色農(nóng)藥，對(duì)百合枯萎病菌（李潤(rùn)根 等，2018）、百合米根霉（李潤(rùn)根和艾芬婷，2017）等均防效良好。本試驗(yàn)選用的6 種殺菌劑中，1%申嗪霉素的毒力回歸方程斜率值最大、EC50相對(duì)較低、抑菌效果較好，因此在百合生產(chǎn)中推薦選用申嗪霉素進(jìn)行百合炭疽病的防控；吡唑醚菌酯對(duì)白蠟樹炭疽菌的室內(nèi)抑菌效果最好，與冉飛等（2021）在百香果喀斯特炭疽菌（C.karstii）防治試驗(yàn)結(jié)果相似，但與鄧潔等（2020）對(duì)鉤藤博寧炭疽菌（C.boninense）防治試驗(yàn)結(jié)果差異較大，可能是因菌種不同所致。殺菌劑室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果只能說(shuō)明該藥劑在室內(nèi)離體條件下對(duì)白蠟樹炭疽菌具有殺菌活性，而田間防治效果受眾多因素影響，因此在應(yīng)用于大田防治前還需進(jìn)一步通過(guò)田間試驗(yàn)證實(shí)。