張崇霞 朱延光 李志民 嚴(yán)曉平 馬一銘 陳 帥 周 慶

(1 中儲(chǔ)糧成都儲(chǔ)藏研究院有限公司 610091) (2 中央儲(chǔ)備糧梅河口直屬庫有限公司 135099)

真菌毒素是真菌的次級代謝產(chǎn)物，在玉米、稻谷、小麥、堅(jiān)果等農(nóng)產(chǎn)品中廣泛存在，人和動(dòng)物攝食含毒食品可對健康造成嚴(yán)重威脅。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織報(bào)告，每年全球約有近25%的農(nóng)作物受到真菌及其代謝毒素的污染，這其中有2%的農(nóng)作物因?yàn)槭芪廴緡?yán)重而失去營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)百億美元[1]。近年來，受環(huán)境和氣候條件影響，糧食真菌毒素污染現(xiàn)象有加劇的趨勢[2]，已經(jīng)引起了全社會(huì)的廣泛關(guān)注。

各國對于糧食真菌毒素殘留水平均有嚴(yán)格的規(guī)定，超出食品安全標(biāo)準(zhǔn)的農(nóng)產(chǎn)品不能作為食品或食品相關(guān)的原料，也不能用作飼料，只有經(jīng)過去毒處理才能挽回部分應(yīng)用價(jià)值。為此，近年來人們采用物理、化學(xué)及生物等多種處理手段開展了農(nóng)產(chǎn)品真菌毒素消減處理研究，取得了許多突破性的進(jìn)展，為糧食的數(shù)量安全和食(飼)用安全做出了積極的貢獻(xiàn)。

各種消減含毒糧食的處理方法中，臭氧處理是近年來人們較為關(guān)注的方法之一。臭氧的強(qiáng)氧化性能迅速破壞有機(jī)物的雙鍵，同時(shí)具有良好的氣體滲透性且易自然分解、無毒性殘留，在1997年臭氧被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認(rèn)定為通常是安全的[3]。臭氧降解玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)、嘔吐毒素(deoxynivalenol，DON)、黃曲霉毒素B1(Aflatoxin，AFB1)等真菌毒素在國內(nèi)外也早有報(bào)道[4]。本文重點(diǎn)綜述了臭氧對糧食中真菌毒素的降解研究，以期為臭氧在真菌毒素降解中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 常見真菌毒素在糧粒上的分布

臭氧較易分解，其對糧粒表面毒素的破壞效果顯著高于糧粒內(nèi)部，因此，研究常見真菌毒素在糧食籽粒上的分布具有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)[5-10]真菌毒素在糧食籽粒上分布極不均勻，真菌毒素在糧粒上主要呈現(xiàn)出由外及里的遞減趨勢，皮層中真菌毒素含量通常高于籽粒內(nèi)部，不同地區(qū)糧食樣品中真菌毒素含量在整體上存在較大差異，這是因?yàn)檎婢舅氐男纬沙墚a(chǎn)毒真菌自身遺傳因素的調(diào)控外，還受到宿主、環(huán)境因素的調(diào)控[6]。真菌毒素在糧粒皮層含量較高，主要是因?yàn)榉N皮易于與外部環(huán)境中的真菌接觸，當(dāng)條件適宜時(shí)，真菌進(jìn)一步侵染并積累真菌毒素隨著真菌不斷生長繁殖產(chǎn)毒，菌絲體深入到糧粒內(nèi)部，則籽粒內(nèi)部毒素也不斷積累。

1.1 玉米赤霉烯酮(ZEN)

職愛民收集[7]全國10個(gè)省市82個(gè)批次的玉米樣品發(fā)現(xiàn)，玉米中胚的ZEN含量最多、種皮其次、胚乳最少，霉變程度與毒素含量無明顯相關(guān)性，不完善粒的篩下物毒素含量明顯高于篩上物。胚中ZEN含量最高，因?yàn)榕郀I養(yǎng)豐富、吸濕性強(qiáng)、呼吸旺盛，致使高水分玉米胚部帶菌嚴(yán)重。完整玉米在種皮包裹下，可減少或避免霉菌的污染，不完善粒玉米因種皮被破壞，易受鐮刀菌感染而產(chǎn)生ZEN毒素。姜淼[8]研究發(fā)現(xiàn)，玉米過篩后粉末狀物質(zhì)霉菌毒素含量往往是完整粒的幾十倍，過篩去除玉米中的不完善粒及雜質(zhì)能有效去除部分真菌毒素。

1.2 嘔吐毒素(DON)

中儲(chǔ)糧成都儲(chǔ)藏院[2]利用實(shí)驗(yàn)室小麥磨粉機(jī)處理嘔吐毒素超過國家限量指標(biāo)的小麥樣品，分別收集粗麩、細(xì)麩、皮粉和心粉，發(fā)現(xiàn)小麥籽粒中DON含量分布呈現(xiàn)由外及里的遞減趨勢，DON主要分布在籽粒皮層部位，平均質(zhì)量占比32.45%的外層組織DON總量占比60.82%。職愛民等[9]采集來自全國10個(gè)省市的78個(gè)批次的玉米,發(fā)現(xiàn)DON主要分布在玉米種皮及篩下物中，主要是因?yàn)橛衩追N皮易于與外部環(huán)境中的霉菌接觸，當(dāng)條件適宜時(shí)，玉米受霉菌進(jìn)一步侵染并積累真菌毒素。在不同霉變率的玉米中，DON在霉變率高的玉米中含量較高。在含有不完善粒的玉米中，嘔吐毒素在其篩下物中含量較高。DON超標(biāo)玉米經(jīng)脫皮處理后其嘔吐毒素含量很可能達(dá)到相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)限量要求。也有研究發(fā)現(xiàn)DON含量高的小麥籽粒干癟，體積也更小。Chelkowski J等[10]將自然條件下感染DON的小麥過2.5 mm和2.2 mm篩分成四部分，發(fā)現(xiàn)籽粒小于2.2 mm的小麥DON含量為15 mg/kg，籽粒在2.2 mm～2.5 mm的小麥，DON含量為14 mg/kg，籽粒大于2.5 mm的小麥，DON含量很低(0～1.0 mg/kg)。

1.3 黃曲霉毒素B1(AFB1)

侯芮[11]研究了自然條件下感染真菌毒素的6個(gè)小麥樣品，磨粉后收集皮磨粉1B、2B、3B和心磨粉1M、2M、3M、細(xì)麩、麩皮共8種組分，研究發(fā)現(xiàn)不同AFB1初始濃度的小麥制粉后其面粉或麩皮中AFB1所占的比率也不相同，6個(gè)樣品中麩皮AFB1的含量是籽粒中含量的1.94～2.69倍；麩皮和細(xì)麩(即小麥外皮層)中AFB1占小麥總AFB1比例的48.51%～64.42%。隨著小麥中AFB1毒素含量的不斷增加，AFB1毒素越來越多的分布在內(nèi)部的胚乳中。由此可以推斷，AFB1由外皮層逐漸進(jìn)入到籽粒內(nèi)部，對于污染AFB1毒素程度較輕的小麥，其內(nèi)部胚乳中AFB1毒素含量不高，制粉后，面粉中毒素含量降低。初始AFB1含量為7.76 μg/kg的小麥，經(jīng)試驗(yàn)制粉以后，其面粉中AFB1含量降低至5.01 μg/kg，基本符合國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的安全水平。隨著AFB1污染的加劇，小麥中的AFB1逐漸由外層轉(zhuǎn)移到胚乳內(nèi)部，面粉中毒素含量逐漸增加，去除難度逐漸加大。

2 臭氧對真菌毒素降解效果

臭氧降解真菌毒素的效果主要受臭氧處理濃度、處理時(shí)間和真菌毒素存在介質(zhì)的影響。臭氧對玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素等真菌毒素溶液降解效果明顯，對糧粒上真菌毒素的降解率要低于真菌毒素溶液，這與真菌毒素在糧粒上的分布特點(diǎn)以及糧食水分含量有關(guān)。臭氧降解糧粒上的真菌毒素，主要與糧粒表面的真菌毒素反應(yīng)，同時(shí)由于糧食的水分含量普遍較低，使得臭氧在糧粒上的附著和滲透受限，降解真菌毒素效果變差[12-14]。

2.1 玉米赤霉烯酮

齊麗君[4]用5 mg/L的臭氧處理ZEN標(biāo)準(zhǔn)溶液(20 μg/mL)5 s，ZEN的降解率超過90%，當(dāng)臭氧濃度為10 mg/L和20 mg/L時(shí)，ZEN被降低到HPLC檢測不到的含量。用40 mg/L～100 mg/L的臭氧處理自然污染ZEN的玉米，當(dāng)處理時(shí)間為180 min時(shí)，玉米中的ZEN降解率達(dá)到86%，在處理的0～120 min，ZEN下降顯著，在120 min～180 min，ZEN下降不明顯，主要是由于臭氧容易與玉米表面的ZEN反應(yīng)，對于內(nèi)部的真菌毒素臭氧滲透較慢。用100 mg/L的臭氧處理水分14.1%和19.6%的玉米180 min，ZEN降解率為86.0%和90.7%，高水分含量的玉米中真菌毒素的降解效果更好，但這種差距在120 min到180 min逐漸不明顯，這可能是因?yàn)槌粞跖c玉米表面的真菌毒素反應(yīng)，通過玉米氣孔進(jìn)入到玉米內(nèi)部比較困難。

諸多研究表明水分含量對ZEN降解十分重要，因?yàn)樗挚梢匀芙獬粞?，增加臭氧氣體與真菌毒素的接觸。Wang等[14]認(rèn)為高水分可以提高臭氧的滲透能力和氧化能力，臭氧在水中可以形成氧原子和氫氧根，有利于ZEN的氧化分解，增加水分含量，可以產(chǎn)生更多的自由基，從而對ZEN的降解產(chǎn)生重要影響。

2.2 嘔吐毒素

陳帥等[15]研究發(fā)現(xiàn)用3 mg/L的臭氧處理濃度為4 mg/L的嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品水溶液10 min，嘔吐毒素100%降解，用相同濃度的臭氧處理不同水分含量的玉米和小麥加標(biāo)樣品4 h和8 h發(fā)現(xiàn)，臭氧對絕干玉米和小麥加標(biāo)樣品中的嘔吐毒素幾乎沒有降解作用，隨著玉米和小麥水分含量的提高，降解效果有明顯提升。水分含量是影響玉米和小麥嘔吐毒素降解率的關(guān)鍵因素。實(shí)倉驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，利用內(nèi)環(huán)流技術(shù)維持糧倉內(nèi)臭氧濃度在3 mg/L～4 mg/L，倉間濕度55%～57%，處理3 d，嘔吐毒素降解范圍在22.1%～35.1%。玉米脂肪酸值和小麥面筋含量在臭氧處理前后無明顯變化，霉菌總數(shù)明顯降低。

2.3 黃曲霉毒素B1

謝剛[16]用40 ppm～50 ppm的臭氧處理AFB1超標(biāo)的谷物1 h～2 h，谷物中AFB1的含量顯著減少。丁愛鳳研究表明[17]，經(jīng)濃度95 mg/L的臭氧處理25 min，稻谷中AFB1的降解率隨著其初始含量的增加，呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，可將AFB1初始含量為68.42 μg/kg的稻谷降解到國家限量標(biāo)準(zhǔn)(10 μg/kg)，降解率最高可達(dá)88.1%。臭氧對稻谷中AFB1的降解效果受到臭氧濃度、處理時(shí)間以及稻谷處理量等因素的影響，在一定范圍內(nèi)，AFB1的降解率與臭氧處理濃度和處理時(shí)間成正比。

臭氧的處理濃度、時(shí)間和糧食水分含量都會(huì)影響到其對真菌毒素的降解效果[18]。用臭氧處理真菌毒素超標(biāo)的糧食，應(yīng)用中受臭氧機(jī)產(chǎn)量和投資成本影響，臭氧濃度一般能維持在3 mg/L～4 mg/L，由于臭氧主要與糧粒表面的真菌毒素反應(yīng)，隨著處理時(shí)間不斷延長，在后期真菌毒素降解率很難繼續(xù)增加。已有的研究證明提高糧食水分含量或通入臭氧的相對濕度，可以提高臭氧對真菌毒素的降解效果[12-14]，因此在實(shí)踐應(yīng)用中，可考慮從適當(dāng)提高糧食水分含量或通入臭氧的相對濕度方面入手，提高臭氧對真菌毒素的降解率。

3 臭氧處理真菌毒素的降解產(chǎn)物

臭氧處理玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素、黃曲霉毒素B1后，降解產(chǎn)物復(fù)雜，往往含有幾種不同的降解產(chǎn)物[3,12,19]，通過液質(zhì)聯(lián)用等手段推測降解產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)式，并且經(jīng)細(xì)胞活性試驗(yàn)、小鼠亞急性毒性動(dòng)物試驗(yàn)等對降解產(chǎn)物的毒性進(jìn)行分析，結(jié)果表明降解產(chǎn)物的毒性與真菌毒素相比，顯著降低[3,12,19]。

3.1 玉米赤霉烯酮

臭氧通過與碳碳雙鍵的親電反應(yīng)與有機(jī)物反應(yīng)。ZEN含有一個(gè)烯烴雙鍵，使ZEN與臭氧反應(yīng)更加容易，此外在苯環(huán)存在時(shí)臭氧易與羥基反應(yīng)，ZEN的苯環(huán)上含有兩個(gè)羥基。

王軼凡[3]用20 mg/L臭氧處理10 μg/mL的ZEN溶液1 min，產(chǎn)生4種未知的穩(wěn)定降解產(chǎn)物，臭氧處理5 min后，這4種產(chǎn)物被完全降解而未發(fā)現(xiàn)其他新產(chǎn)物。通過超高液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜分析推測各降解產(chǎn)物的化學(xué)式分別為C18H22O6，C18H22O7，C17H20O6，C18H22O8。通過ZEN及其臭氧降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)對比分析表明：ZEN臭氧降解產(chǎn)物的生成路徑主要遵循臭氧與烯烴雙鍵加成的Criegee反應(yīng)機(jī)制和親電效應(yīng)，并模擬出4種ZEN臭氧降解產(chǎn)物的生成途徑。對降解產(chǎn)物進(jìn)行體外毒性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，臭氧處理后的ZEN降解產(chǎn)物的毒性顯著降低，但仍存在一定細(xì)胞毒性，臭氧降解產(chǎn)物完全被臭氧氧化后，其細(xì)胞毒性與空白正常組無顯著性差異。

3.2 嘔吐毒素

嘔吐毒素的臭氧降解遵循Criegee機(jī)制，即臭氧首先作用于C9-C10上的雙鍵，進(jìn)行環(huán)加成反應(yīng)，形成不穩(wěn)定的臭氧化物，隨后在臭氧的強(qiáng)氧化作用下生成相關(guān)降解產(chǎn)物及過渡態(tài)產(chǎn)物[20]。

陳帥等[15]利用高效液相色譜、核磁共振及液質(zhì)聯(lián)用等分析手段對臭氧處理嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品的降解產(chǎn)物進(jìn)行分離和結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，主產(chǎn)物為己二酸二甲酯，從其分子結(jié)構(gòu)可以看出，DON分子中的C12、C13環(huán)氧結(jié)構(gòu)和C3-OH基團(tuán)等毒性基團(tuán)被完全破壞，主產(chǎn)物DMA為一種只含醛酮基團(tuán)的低毒性化合物。因此，糧食所含的DON進(jìn)行臭氧處理降解后毒性會(huì)顯著降低，可顯著改善含毒糧食的食品安全性。孫超[19]研究發(fā)現(xiàn)，DON被臭氧降解時(shí)，高濃度(40 mg/L)情況下DON被快速完全降解，沒有新的物質(zhì)出現(xiàn)，當(dāng)在低濃度(20 mg/L)條件下降解時(shí)，降解速度變慢，檢測到兩個(gè)降解產(chǎn)物，分子式為C15O7H2和C1507H18，降解產(chǎn)物不穩(wěn)定，屬于中間產(chǎn)物，DON完全降解后，對細(xì)胞的毒性顯著降低。

3.3 黃曲霉毒素B1

臭氧降解AFB1的機(jī)理是臭氧通過Criegee機(jī)理的親電攻擊，臭氧攻擊呋喃環(huán)末端的C8-C9雙鍵，最后形成酮、醛、酸和二氧化碳等多種化合物，從而去除黃曲霉毒素的致毒性，因?yàn)镃8-C9雙鍵是黃曲霉毒素引起細(xì)胞突變和致癌性的主要原因[16]。

張芳[1]研究發(fā)現(xiàn)，通過HPLC-MS對臭氧降解AFB1的降解產(chǎn)物進(jìn)行推測，發(fā)現(xiàn)臭氧完全降解AFB1最終產(chǎn)生3個(gè)氧化產(chǎn)物。Mckenzie等[21]研究發(fā)現(xiàn)在臭氧的作用下C=C雙鍵首先發(fā)生加成反應(yīng)，得到分子式為C17H12O9的中間產(chǎn)物，臭氧的進(jìn)一步作用使得苯環(huán)和另一個(gè)C=C雙鍵被打破，形成R-COOH(酸類)，R-CHO(醛類)、R-CO-R(醚類)和CO2。通過小鼠毒性試驗(yàn)和Ames致突變試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：臭氧處理過的花生粕不再對小鼠造成傷害。臭氧處理過的玉米漿也不再對小鼠健康造成傷害，也不會(huì)有致突變的作用。DIAO等[22]研究發(fā)現(xiàn)臭氧降解AFB1后檢測到10種降解產(chǎn)物，這些產(chǎn)物含量低，且分子量相近，通過對其結(jié)構(gòu)-效應(yīng)分析可知，AFB1的最終降解產(chǎn)物毒性顯著降低。

4 臭氧對糧食品質(zhì)的影響

用臭氧處理真菌毒素污染的糧食，在降解真菌毒素的同時(shí)，臭氧對糧食品質(zhì)也會(huì)產(chǎn)生一定的影響，從已有的研究可以看出，臭氧對小麥、玉米、稻谷等原糧的品質(zhì)影響較小。

研究發(fā)現(xiàn)臭氧降解小麥中DON，小麥粉相比原面粉白度增強(qiáng)，黃度下降。孫超[19]用80 mg/L臭氧水處理小麥10 min，磨粉后小麥粉亮度和白度增加，蛋白含量、淀粉含量和脂肪酸值變化不大。齊麗君[4]用100 mg/L臭氧處理玉米180 min后，玉米粉白度增加、黃度下降。臭氧可以與胡蘿卜素、類胡蘿卜素的雙鍵反應(yīng)從而具有漂白作用。玉米含有豐富的胡蘿卜素，小麥的主要顏色來自類胡蘿卜素，因此臭氧與這些色素的反應(yīng)可能是導(dǎo)致白度增加、黃度下降的原因。用100 mg/L的臭氧處理玉米樣品180 min，隨著處理時(shí)間延長，玉米脂肪酸值呈上升趨勢，但仍在正常范圍內(nèi)。玉米糊化峰值粘度、最低粘度、最終粘度和回生值呈下降趨勢。Melte等[4]用同樣濃度的臭氧處理被AFB1污染的開心果，開心果的脂肪酸值無顯著變化。

Chan等[23]認(rèn)為，淀粉經(jīng)過氧化會(huì)導(dǎo)致部分糖苷鍵斷裂，淀粉分子量下降，淀粉峰值粘度降低。也有研究表明用臭氧處理蠟質(zhì)大米淀粉，發(fā)現(xiàn)隨著處理時(shí)間延長，蠟質(zhì)大米淀粉的峰值年度粘度增加?？赡苡袃蓚€(gè)原因：一是臭氧處理后，蠟質(zhì)大米淀粉中酶的活性降低；二是氧化使淀粉分子發(fā)生交聯(lián)從而使淀粉分子膨脹力增加。淀粉種類不同，處理方式不同也會(huì)造成淀粉糊化特性的差異。臭氧處理后玉米中直鏈淀粉含量呈下降趨勢，但變化不顯著。臭氧處理會(huì)造成高相對分子質(zhì)量的淀粉聚合物解離，產(chǎn)生低相對分子質(zhì)量的淀粉聚合物和直鏈淀粉。臭氧處理時(shí)，玉米外殼對其內(nèi)部的淀粉起到一定保護(hù)作用。玉米中氨基酸總量和必需氨基酸含量呈下降趨勢，但必需氨基酸與總氨基酸含量的比值無顯著變化。莊坤等[17]用臭氧處理糯米，氨基酸總含量減少，這可能是因?yàn)檫@些氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)對臭氧比較敏感，容易被氧化。

5 結(jié)束語

真菌毒素在糧食籽粒上分布極不均勻，在糧粒上主要呈現(xiàn)由外及里的遞減趨勢，皮層中真菌毒素含量通常高于籽粒內(nèi)部，不同地區(qū)糧食中真菌毒素含量在整體上存在較大差異。

臭氧作為一種強(qiáng)氧化劑，可有效降解原糧中的真菌毒素，降解效果受臭氧濃度、處理時(shí)間和原糧水分含量的影響。受臭氧附著和穿透能力的影響，臭氧主要與原糧籽粒表面的真菌毒素反應(yīng)，因?yàn)樗挚梢蕴岣叱粞踉谧蚜１砻娴母街痛┩改芰?，在用臭氧處理真菌毒素超?biāo)的糧食時(shí)，建議適當(dāng)提高通入臭氧的相對濕度。

臭氧降解真菌毒素的產(chǎn)物復(fù)雜，從已有的研究可以看出，真菌毒素降解后，降解產(chǎn)物毒性顯著降低。在臭氧有效降解真菌毒素的濃度和時(shí)間范圍內(nèi)，臭氧對糧食品質(zhì)的影響較小。