崔歌，楊志鴻，王曉妍，章宗籍，鄒英鷹

(昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)系，昆明 650500)

目前中國有超過1億糖尿病患者，且以平均每天3 000人，每年120萬人的速度遞增[1]。隨著糖尿病的發(fā)展，預(yù)計(jì)到2030年糖尿病性視網(wǎng)膜病的發(fā)病率在發(fā)展中國家將增加69%，在發(fā)達(dá)國家將增加20%[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，糖尿病患者平均7～10年發(fā)展為糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)，而患糖尿病20年后幾乎全部發(fā)展為DR[3]。DR若未得到及時(shí)治療，則會發(fā)生視網(wǎng)膜脫落，嚴(yán)重者致盲，不僅降低患者生活質(zhì)量，還嚴(yán)重影響身體健康[4-5]。DR可分為兩個(gè)階段：非增殖性DR和晚期增殖性DR(proliferative diabetic retinopathy，PDR)，當(dāng)DR發(fā)展為PDR時(shí)，視網(wǎng)膜表面血管生成和隨后發(fā)生的纖維化通常會導(dǎo)致纖維血管的形成，最終形成纖維血管膜，即形成糖尿病視網(wǎng)膜纖維化[6]，而纖維血管膜的收縮牽拉引起的玻璃體積血及視網(wǎng)膜脫離是PDR導(dǎo)致患者視力下降甚至失明的主要原因。目前PDR的治療方法主要為對高血壓、高血糖和高血脂等危險(xiǎn)因素的控制，以及激光光凝術(shù)和部分藥物治療，如抗血管內(nèi)皮生長因子制劑、皮質(zhì)類固醇等[7-11]，但均未能有效治療糖尿病所致的視網(wǎng)膜纖維化，因此了解糖尿病視網(wǎng)膜纖維化形成機(jī)制以及選擇相關(guān)治療靶點(diǎn)顯得尤為重要。目前，糖尿病視網(wǎng)膜纖維化發(fā)病機(jī)制尚不清楚。有研究證明，轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β與DR的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，TGF-β/Smad通路的激活在調(diào)節(jié)眼組織血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成和炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)中起重要作用[12-13]?，F(xiàn)就TGF-β/Smad通路在糖尿病視網(wǎng)膜纖維化中的研究進(jìn)展予以綜述。

1 糖尿病視網(wǎng)膜纖維化的形成

在幾種慢性疾病中，類似于惡性腫瘤中上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的過程，ECM蛋白產(chǎn)量增加和纖維化過程，內(nèi)皮表型改變，即內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-mesenchymal transition，EndMT)已得到證實(shí)[14-16]，這種EndMT過程在某些慢性糖尿病并發(fā)癥中尤為重要。EndMT影響成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞的發(fā)育，與纖維化的進(jìn)展和PDR的發(fā)展有關(guān)[17]；且有證據(jù)顯示，EndMT形成過程與EMT的發(fā)生發(fā)展過程相似，并由Smad依賴性和非Smad依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)，由TGF-β蛋白質(zhì)超家族(包括TGF-β1和TGF-β2)調(diào)控[15-16]。高血糖誘導(dǎo)的ECM積累是DR的主要標(biāo)志[18]，而細(xì)胞增殖、ECM伸展和新生血管形成是PDR形成的關(guān)鍵[19]。在視網(wǎng)膜纖維化的早期階段，新血管異常增生，沒有纖維化組織，進(jìn)入中間階段后，半透明的纖維化結(jié)締組織逐漸填充血管間隙，導(dǎo)致在后期形成密集的白色無血管瘢痕。纖維血管增生組織從其起源向周圍擴(kuò)展，而無血管增生組織通常是從纖維血管增生邊緣延伸的薄膜，在這一系列纖維組織形成過程中纖維化產(chǎn)生的牽引力導(dǎo)致內(nèi)部神經(jīng)感覺視網(wǎng)膜與視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)分離，從而導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離。而新生血管的生長伴隨ECM堆積，形成延伸到玻璃體內(nèi)的纖維血管膜，促進(jìn)視網(wǎng)膜表面或玻璃體腔內(nèi)纖維化組織的形成[6,20]。有研究表明，TGF-β1可使增殖的RPE失去極性，發(fā)生EMT，從而增加纖連蛋白、膠原等主要ECM蛋白以及其他大量膠原蛋白的ECM成分[21]，引起糖尿病視網(wǎng)膜纖維化。

2 TGF-β的分子結(jié)構(gòu)

TGF具有廣泛的生理和病理作用，屬于具有免疫調(diào)節(jié)特性的TGF家族[22]。在哺乳動物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)3種TGF-β亞型(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)，三者均由112個(gè)氨基酸組成，生物學(xué)作用相似，其編碼基因分別定位于染色體19q3、1q41和14q24上[23-24]。其中，TGF-β1存在于內(nèi)皮細(xì)胞、造血細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞中，TGF-β2存在于上皮組織和神經(jīng)元中，TGF-β3存在于結(jié)締組織細(xì)胞中[25-27]。TGF-β1以生物學(xué)上無活性的形式分泌，并以分子量為290 000的復(fù)合物形式存儲在ECM中，其含有C端生長因子(成熟的TGF-β同型二聚體)及其前肽[稱為潛伏期相關(guān)肽(latency-associated peptide，LAP)]。LAP是一種二硫鍵連接的二聚體，可調(diào)節(jié)TGF-β1在整個(gè)纖維化發(fā)展過程和維持組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其與TGF-β1非共價(jià)結(jié)合為潛伏TGF-β1，阻止TGF-β與細(xì)胞表面受體結(jié)合并啟動信號通路；成熟的TGF-β1同型二聚體從LAP上解離對于生長因子激活和獲得生物活性是必需的，病毒性糖苷水解酶、蛋白酶和細(xì)胞黏附蛋白通過靶向LAP，誘導(dǎo)LAP發(fā)生大規(guī)模構(gòu)象變化，釋放TGF-β1。此外，潛伏性TGF-β結(jié)合蛋白對大潛在復(fù)合物(large latent complex，LLC)的有效分泌表現(xiàn)出重要作用，主要將分泌的TGF定位在ECM發(fā)生區(qū)域。而炎癥損傷等誘導(dǎo)ECM的發(fā)生，并增加局部細(xì)胞外潛伏的TGF-β的儲存，同時(shí)也刺激了廣泛的分子信號，介導(dǎo)成熟的生物活性TGF-β從LLC中釋放出來，當(dāng)從LLC分離后，TGF-β被整合素、蛋白酶-纖溶酶、高血糖、活性氧類或極端溫度、低pH值和氧化等激活，這個(gè)過程為TGF-β的活化[28-30]。

3 TGF-β的調(diào)控及Smad通路

活化的TGF-β由Ⅰ型和Ⅱ型跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體組成的異構(gòu)復(fù)合體傳遞，在人類中存在7個(gè) Ⅰ 型受體和5個(gè) Ⅱ 型受體，包括TGF-β Ⅱ 型受體和骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體2以及 Ⅰ 型受體活化素受體樣激酶(activin receptor-like kinase，ALK)(ALK1～7)[25]，其中ALK5也稱為TGF-βⅠ型受體[25,27]，根據(jù)它們磷酸化受體的不同可分為受體調(diào)節(jié)型Smads、共同通路型Smads和抑制型Smads，其中受體調(diào)節(jié)型Smads包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8[31-32]。Ⅰ型受體可以進(jìn)一步分為兩個(gè)亞群，一類是對TGF-β樣蛋白反應(yīng)而激活Smad2和Smad3的受體，另一類是對骨形態(tài)發(fā)生蛋白反應(yīng)而激活Smad1、Smad5和Smad8的受體，激活的受體通過經(jīng)典的Smad依賴性通路或非Smad依賴性通路將細(xì)胞外信號從細(xì)胞表面跨膜受體傳遞到細(xì)胞核，這兩條通路均參與了TGF-β誘導(dǎo)的肌成纖維細(xì)胞的分化?？梢?，Smad蛋白在纖維化中起不同的作用，一些Smad發(fā)揮促纖維化作用，而其他Smad發(fā)揮抗纖維化作用[33]。

3.1經(jīng)典Smad依賴性信號通路 在經(jīng)典Smad依賴性信號通路中，TGF-β Ⅱ 型受體二聚體和TGF-β Ⅰ 型受體二聚體均與TGF-β配體結(jié)合形成復(fù)合物，對TGF-βⅠ型受體的GS結(jié)構(gòu)域磷酸化，并磷酸化TGF-βⅠ型受體(ALK5)的絲/蘇氨酸殘基，進(jìn)而磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子Smad2和Smad3[34-36]。磷酸化的Smad2和Smad3與Smad4形成復(fù)合體，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，多種非Smad共激活子(如組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶p300、激活蛋白-1、轉(zhuǎn)錄因子Sp-1和cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白)和共抑制因子(如Ski原癌基因、SnoN蛋白和Smad核相互作用蛋白1)結(jié)合到含有Smad3的復(fù)合體上，從而影響不同基因的轉(zhuǎn)錄[25]；同時(shí)，磷酸化的Smad3激活ECM和α平滑肌肌動蛋白的轉(zhuǎn)錄，引起纖維化的發(fā)生。有研究顯示，在動物模型中，ALK5的藥理抑制作用通過ALK5-Smad3軸減弱了肝臟、腎臟、心臟、腸、脈管系統(tǒng)等的纖維化重構(gòu)[37-41]，但有關(guān)其在糖尿病視網(wǎng)膜纖維化中的發(fā)病機(jī)制研究較少。此外，TGF-β配體結(jié)合ALK1和TGF-βⅡ型受體復(fù)合物，進(jìn)而磷酸化激活Smad1、Smad5和Smad8的受體，激活后的Smad1、Smad5和Smad8與Smad4結(jié)合轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控不同于Smad2/3/4復(fù)合物的靶基因轉(zhuǎn)錄[42]。但目前有關(guān)ALK1-Smad1-Smad5軸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在纖維化中潛在作用的研究較少，且與糖尿病視網(wǎng)膜纖維化相關(guān)的研究更少。抑制型Smads主要包括Smad6、Smad7，其中Smad7是經(jīng)典Smad信號通路的抑制劑，其與Samd2、Smad3競爭結(jié)合激活TGF-β Ⅰ 型受體和隨后信號[43]。因此，可以在促進(jìn)纖維化型Smads和抗纖維化型Smads之間取得平衡來進(jìn)行抗纖維化治療。

3.2非Smad依賴性信號通路 除經(jīng)典Smad依賴性信號通路外，TGF-β還可通過非經(jīng)典的信號通路(即非Smad依賴性信號通路)調(diào)控糖尿病視網(wǎng)膜纖維化[44]。在Smad依賴性信號通路介導(dǎo)的TGF-β信號機(jī)制的背景下，激活的受體也可通過促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路傳遞信號，包括胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、c-Jun氨基端激酶、p38 MAPK、IκB激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶和蛋白激酶B，以及Rho家族鳥苷三磷酸酶，通過相關(guān)激酶激活引起非Smad依賴性信號通路作為獨(dú)立通路或與Smads合作，然后整合到經(jīng)典Smad依賴性信號通路上控制Smad活動，進(jìn)而在多種細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用[45]。經(jīng)典Smad依賴性信號通路和非Smad依賴性信號通路之間雖有相互作用，但在介導(dǎo)TGF-β所致的ECM沉積與纖維化中的相互作用尚不清楚。

4 TGF-β/Smad通路與糖尿病視網(wǎng)膜纖維化

TGF-β是關(guān)鍵的纖維化因子，與糖尿病并發(fā)癥(如糖尿病腎病)有關(guān)。在胚胎發(fā)育和成人組織中，已經(jīng)證明了眼中的TGF-β及其受體的表達(dá)[16]。經(jīng)檢測，PDR患者玻璃體液中的TGF-β2水平較無糖尿病患者高[6]，且TGF-β是EMT最有效的誘導(dǎo)劑[46-47]。TGF-β1經(jīng)眼組織中的高糖刺激，可以異常高表達(dá)，從而傳遞細(xì)胞信號以發(fā)揮其生物學(xué)作用，尤其是對下游Smad3的強(qiáng)烈刺激作用，Smad3被激活并進(jìn)一步磷酸化。磷酸化Smad3進(jìn)入細(xì)胞核以傳輸細(xì)胞信號并使許多轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)視網(wǎng)膜纖維化。微RNA(microRNA，miRNA/miR)-21是一種非編碼RNA，已被證實(shí)與多種疾病的發(fā)作有密切聯(lián)系，能夠調(diào)節(jié)多種細(xì)胞信號通路，從而對疾病的多種病理反應(yīng)產(chǎn)生重要影響。有研究表明，DR模型大鼠視網(wǎng)膜組織中的miR-21表達(dá)水平明顯高于正常大鼠，而TGF-β/Smad信號通路抑制劑顯著減弱了miR-21在DR模型大鼠中的作用，并改善了DR模型大鼠的眼血流動力學(xué)，表明miR-21通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號通路參與糖尿病視網(wǎng)膜纖維化的發(fā)生[48]。有研究表明,高糖誘發(fā)糖尿病性心肌病以及EndMT，而miR-142-3p對TGF-β1具有直接調(diào)控作用，可抑制TGF-β1-Smad通路引起的EndMT，且TGF-β1是內(nèi)皮細(xì)胞miR-142-3p的下游靶基因[49]，但在高糖誘發(fā)的糖尿病視網(wǎng)膜纖維化中miR-142-3p是否有類似作用尚不清楚。實(shí)驗(yàn)表明，高糖通過Smad2引起TGF-β的信使RNA上調(diào)，當(dāng)使用TGF-β1抑制劑(SB431542)處理后，可防止葡萄糖誘導(dǎo)的ECM相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)水平的升高以及Smad通路的激活[50]。Smad2是miR-200b的靶標(biāo)[14],高糖誘導(dǎo)的EndMT與miR-200b的下調(diào)以及轉(zhuǎn)錄共激活因子p300 的上調(diào)相關(guān)，并伴隨TGF-β/Smad信號通路的激活和ECM蛋白水平的提高。Feng等[51]使用miR-200b內(nèi)皮特異性過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示ECM相關(guān)蛋白表達(dá)水平降低。而在高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞EndMT的過程中，TGF-β起關(guān)鍵作用，且這些變化受miR-200b和轉(zhuǎn)錄共激活因子p300調(diào)控，從而為基于TGF-β/Smad通路誘導(dǎo)所致的糖尿病視網(wǎng)膜纖維化提供了新思路。

有文獻(xiàn)報(bào)道，DR患者血漿心肌梗死相關(guān)轉(zhuǎn)錄長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA of myocardial infarction associated transcript，lncRNA-MIAT)表達(dá)增加，其可作為提示患者發(fā)生DR的標(biāo)志物，且lncRNA-MIAT通過激活TGF-β1信號通路[52]，從而引起糖尿病視網(wǎng)膜纖維化，因此lncRNA-MIAT對TGF-β信號通路的調(diào)節(jié)作用可能成為治療DR的靶點(diǎn)。此外，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)通過靶向包括TGF-β在內(nèi)的多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)EMT在癌癥轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[53]。Thomas等[44]闡述了lncRNA H19在高糖誘導(dǎo)的EndMT中的作用。lncRNA H19通過非Smad依賴性信號通路的MAPK-ERK1/2通路抑制高糖引起的TGF-β1介導(dǎo)的EndMT，而lncRNA H19是否可通過經(jīng)典Smad依賴性信號通路調(diào)節(jié)糖尿病視網(wǎng)膜纖維化有待進(jìn)一步探討。可見，lncRNA通過經(jīng)典Smad依賴性信號通路與非Smad依賴性信號通路參與高糖引起的EndMT，且lncRNA-MIAT可作為DR的潛在診斷標(biāo)志物，為開發(fā)DR臨床診斷方法和治療目標(biāo)提供新思路。

另有研究表明，在TGF-β誘導(dǎo)的人RPE系(ARPE-19)和原代人RPE中TGF-β受體2表達(dá)水平升高，且典型的間充質(zhì)標(biāo)志物(包括α平滑肌肌動蛋白、纖連蛋白和波形蛋白)表達(dá)顯著增加，實(shí)驗(yàn)中使用MG132(一種有效的特異性蛋白酶體抑制劑)可導(dǎo)致泛素化蛋白的劑量依賴性和時(shí)間依賴性累積[54]，MG132顯著抑制TGF-β誘導(dǎo)的Smad2、ERK1/2磷酸化，其對TGF-β的信號調(diào)節(jié)，歸因于TGF-β受體2表達(dá)減少，從而抑制人RPE系和原代人RPE的增殖、遷移和EndMT。該研究證明，蛋白酶體抑制劑MG132誘導(dǎo)的蛋白毒性應(yīng)激可以抑制人RPE系(ARPE-19)和原代人RPE中的EMT過程，提示蛋白酶體抑制劑或可成為難治性視網(wǎng)膜纖維化疾病(如增生性玻璃體病變和PDR)的治療方法。

以上研究表明，TGF-β是纖維化的誘導(dǎo)因素，是參與糖尿病視網(wǎng)膜纖維化過程的一種重要細(xì)胞因子，在纖維化發(fā)生發(fā)展過程參與多種通路，其中TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路已經(jīng)成為治療糖尿病視網(wǎng)膜纖維化的關(guān)鍵靶點(diǎn)，其相關(guān)通路的基因靶點(diǎn)可成為糖尿病視網(wǎng)膜纖維化的潛在靶點(diǎn)。

5 小 結(jié)

DR通常發(fā)展為慢性或不受控制的糖尿病并發(fā)癥，目前通過常規(guī)眼科檢查進(jìn)行評估。其治療方法主要為激光療法，但目前可用的DR治療策略僅適用于晚期患者，且被報(bào)道會發(fā)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)[55]。糖尿病視網(wǎng)膜纖維化的發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)階段，雖然在整個(gè)疾病發(fā)展過程中TGF-β信號均參與其中，但TGF-β超家族成員在糖尿病視網(wǎng)膜纖維化中的作用尚不清楚，從而需要特定的糖尿病動物模型，重點(diǎn)關(guān)注視網(wǎng)膜中TGF-β信號參與的各個(gè)方面，以為尋找TGF-β/Smad信號通路上相關(guān)作用靶點(diǎn)和相關(guān)因子的抑制藥物提供新思路。隨著研究人員對相關(guān)機(jī)制研究的不斷深入，今后會有更多的抗糖尿病視網(wǎng)膜纖維化靶點(diǎn)以及藥物被發(fā)現(xiàn)，從而為治療DR提供新思路。